鄭衛(wèi)軍宋婷婷鄭善堅(jiān)鄭榮泉

（1浙江省野生動(dòng)物生物技術(shù)與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室　浙江金華　321004；2浙江金華市婺城區(qū)農(nóng)林局　321000）

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棘胸蛙出血病病原鑒定及藥敏試驗(yàn)

鄭衛(wèi)軍1,2宋婷婷2鄭善堅(jiān)2鄭榮泉2

（1浙江省野生動(dòng)物生物技術(shù)與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室浙江金華321004；2浙江金華市婺城區(qū)農(nóng)林局321000）

摘要：從患病棘胸蛙(Quasipaa spinosa)中分離到三株細(xì)菌，將分離株制備的菌液分別采用口服、肌肉注射、皮膚損傷浸泡、皮膚不損傷浸泡4種方式回歸感染棘胸蛙，結(jié)果顯示，除口服方式外，其他各種感染途徑均能使棘胸蛙發(fā)病并導(dǎo)致死亡，且對(duì)蛙有較強(qiáng)的致病性。通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化試驗(yàn)、16S rDNA序列等方法鑒定該致病菌株為鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii)。同時(shí)，通過(guò)抑菌圈法研究了該菌株對(duì)12種抗生素的敏感性。結(jié)果顯示：該菌對(duì)亞胺培南、阿米卡星、奈替米星高度敏感，對(duì)青霉素、新霉素、林可霉素、先鋒霉素、氯霉素、吡哌酸、頭孢哌酮、慶大霉素、紅霉素不敏感。

關(guān)鍵詞：棘胸蛙；鮑曼不動(dòng)桿菌；藥敏試驗(yàn)

棘胸蛙(Quasipaa spinosa)營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美，自上世紀(jì)八十年代開展人工養(yǎng)殖以來(lái)逐漸形成規(guī)模，而高密度集約化養(yǎng)殖模式以及種質(zhì)衰退等原因?qū)е铝烁鞣N病害的發(fā)生日益頻繁，其中以細(xì)菌性疾病最為嚴(yán)重。成為困擾棘胸蛙養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的一個(gè)重要因素[1]。國(guó)內(nèi)已有學(xué)者相繼報(bào)道了牛蛙、美國(guó)青蛙等的腹水病[2]、腦膜炎[3]、白內(nèi)障病[4]、肝腫大病[5]、愛(ài)德華氏菌病[6]等蛙類疾病，在棘胸蛙中的疾病雖然報(bào)道較少，但目前已發(fā)現(xiàn)了紅腿病、爛皮病以及一種肝臟發(fā)黑囊腫的新類型疾病等多種細(xì)菌性疾病[7-9]。

2013年6月在麗水市某養(yǎng)殖場(chǎng)，發(fā)生了棘胸蛙成蛙大面積死亡，病蛙的特征與已報(bào)道的其它棘胸蛙發(fā)病癥狀不同：蛙體腹面均充血紅色，均不攝食，應(yīng)激能力差，行動(dòng)遲緩，體態(tài)臃腫。經(jīng)解剖后發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)大量腹水，伴有水腫現(xiàn)象。據(jù)初步調(diào)查，此病的流行季節(jié)為5-9月份，對(duì)棘胸蛙養(yǎng)殖業(yè)的危害較大。為了達(dá)到控制該病的目的，我們進(jìn)行了該病的病原研究，對(duì)致病菌株進(jìn)行了鑒定，并初步篩選了對(duì)致病病原敏感的藥物，以期為該病的防治和診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

由浙江省遂昌縣棘胸蛙養(yǎng)殖場(chǎng)提供的自然發(fā)病蛙，規(guī)格150～200g /只。健康棘胸蛙來(lái)自金華沙畈棘胸蛙養(yǎng)殖場(chǎng)，規(guī)格100～120g/只，置于自然水溫22℃的水族箱中暫養(yǎng)3d備用。

1.2致病菌的分離

按無(wú)菌操作從病蛙的病變肝臟取材，劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，在28℃下培養(yǎng)24h，平板上出現(xiàn)了許多形態(tài)一致的小菌落；選取單個(gè)菌落，再進(jìn)行平板劃線分離，直至獲得純培養(yǎng)物，供試驗(yàn)用[10]。

1.3人工感染試驗(yàn)

1.3.1菌液制備

將純培養(yǎng)物接種在普通營(yíng)養(yǎng)液體培養(yǎng)基中，置于200r/s的搖床中振蕩培養(yǎng)18h，用滅菌生理鹽水，采用比濁管法稀釋，置4℃環(huán)境中貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2人工感染

將分離得到的3株菌制備的菌液采用肌注注射方式感染健康棘胸蛙，每組選取5只健康棘胸蛙，先對(duì)蛙體背部皮膚消毒后，將菌液按0.2ml/只進(jìn)行肌注感染試驗(yàn)，對(duì)照組注射等劑量的生理鹽水，感染試驗(yàn)觀察期為15天，并記錄試驗(yàn)棘胸蛙的病癥及死亡數(shù)目，計(jì)算其死亡率。同時(shí)，對(duì)人工感染發(fā)病瀕死的棘胸蛙進(jìn)行病原菌再分離，檢查所分離的菌株與原分離菌株在形態(tài)與理化特性等方面是否一致。

1.4菌落觀察及生理生化特性的測(cè)定

對(duì)致病菌菌落進(jìn)行大小、形態(tài)、顏色等觀察，細(xì)菌的革蘭氏染色及生理生化的鑒定，參照有關(guān)文獻(xiàn)[10]所述方法進(jìn)行。

1.516S rDNA鑒定

采用TaKaRa公司的16S rDNA Bacterial Identi f ication PCR Kit試劑盒提取菌株的基因組DNA，以PCR法獲取其16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物，將PCR反應(yīng)擴(kuò)增出的16S rDNA片斷送至上海生工生物技術(shù)公司，先進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化后再進(jìn)行測(cè)序。使用NCBI網(wǎng)站對(duì)致病菌的16S rDNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中各種菌的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，最終鑒定目的菌的種類[8-10]。

1.6藥物敏感試驗(yàn)

對(duì)該致病菌株進(jìn)行藥物敏感試驗(yàn)，按文獻(xiàn)[8-9]所述方法進(jìn)行。分離菌株接種營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24 h，無(wú)菌生理鹽水稀釋菌液至(1～2)×105CFU／mL，取100 ug／mL涂布于營(yíng)養(yǎng)瓊脂，取內(nèi)徑6 mm牛津杯置于培養(yǎng)基表面，加入100 ug／mL抗生素200 uL，28℃培養(yǎng)24 h后測(cè)定抑菌圈。每種抗生素做3個(gè)重復(fù)。同時(shí)，對(duì)該病的防治措施進(jìn)行初步的探究。

2　結(jié)果與分析

2.1病原分離結(jié)果

從病蛙病變肝臟內(nèi)組織液接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)，進(jìn)一步劃線培養(yǎng)直至得到單菌落，取3個(gè)單菌落，純化后暫標(biāo)記為S-1、S-2、S-3。

2.2回歸感染試驗(yàn)

將S-1、S-2、S-3三個(gè)菌株用生理鹽水制成菌液，對(duì)健康蛙進(jìn)行肌注感染試驗(yàn)。結(jié)果顯示，S-1、S-2、S-3三個(gè)菌株感染試驗(yàn)組蛙在5d內(nèi)60％發(fā)病死亡，其癥狀表現(xiàn)與自然發(fā)病基本相同，均為蛙體腹面均呈紅色，均不攝食，應(yīng)激能力差，行動(dòng)遲緩，體態(tài)臃腫。經(jīng)解剖后發(fā)現(xiàn)腹腔內(nèi)大量腹水，伴有水腫現(xiàn)象（圖1）。對(duì)照組全部存活，感染試驗(yàn)見(jiàn)表1，表明三株菌株為致病菌。

圖1　病變棘胸蛙腹部特征Figure 1 Abdom inal characteristics of lesions of Quasipaa spinos

表1　分離菌對(duì)實(shí)驗(yàn)棘胸蛙的感染結(jié)果Table 1 Isolated bacteria infection results of experimental giant spiny frogs

2.3菌落觀察及生理生化試驗(yàn)

對(duì)回歸感染的病蛙作細(xì)菌分離，獲得與S-1、S-2、S-3三個(gè)菌株相同形態(tài)特征的菌株，純化后暫標(biāo)記為S-1’、S-2’、S-3’。根據(jù)細(xì)菌的形態(tài)特征，并通過(guò)系統(tǒng)的生理生化鑒定試驗(yàn)，證明六株菌理化性質(zhì)的一致性。

三株分離菌和三株回感菌均成對(duì)排列或單個(gè)存在，菌體大小為1.5-2.5μm，有莢膜，無(wú)芽孢，無(wú)鞭毛。專性需氧，普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，能在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。革蘭氏染色均為革蘭氏陰性桿菌。對(duì)分離菌的生化鑒定見(jiàn)表2。根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[11]鑒定均為鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii)。

表2　三株分離菌生化鑒定結(jié)果Table2 Biochemicalpropertiesof isolated strain S-1，S-2，S-3

2.416S rDNA測(cè)序、鑒定結(jié)果

對(duì)該致病菌的16SrDNA經(jīng)PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。測(cè)得16S rDNA大部分序列為1501bp（圖2）。

圖2　致病菌的16S rDNA堿基序列Figure 2 16S rDNA sequence

通過(guò)NCBI網(wǎng)站對(duì)致病菌的16S rDNA序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中各種菌的16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)。所得結(jié)果中同相似性最高的前9個(gè)菌株比較結(jié)果如表3。

表3　菌株16S rDNA序列同GeneBank中細(xì)菌菌株同源性比較Table 3 Homology comparisons of 16S rDNA sequence between strains and some bacteria in GeneBank

從3可以看出，通過(guò)16S rDNA序列同源性比較，菌株與GeneBank中9株鮑曼不動(dòng)桿菌的16S rDNA序列相似性均達(dá)到97％以上，鑒定結(jié)果進(jìn)一步確認(rèn)引起該病的病原菌為鮑曼不動(dòng)桿菌。

2.5藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果如表4所示：該菌對(duì)亞胺培南、阿米卡星、奈替米星高度敏感，對(duì)青霉素、新霉素、林可霉素、先鋒霉素、氯霉素、吡哌酸、頭孢哌酮、慶大霉素、紅霉素不敏感。

表4　分離菌對(duì)抗菌藥敏感性Table 4 Isolated bacteria to antibiotic sensitivity

3　討論

鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）為廣泛存在于自然界的一種條件致病菌，由于其能很好的耐受較寬泛的溫度和酸堿度，所以能長(zhǎng)期存在于各種物品的表面。鮑曼不動(dòng)桿菌感染一般為醫(yī)院獲得性感染，臨床分離率僅次于銅綠假單胞菌的非發(fā)酵菌，通過(guò)人與人的接觸造成院內(nèi)的交叉?zhèn)鞑ァｋS著抗生素的大量使用，鮑曼不動(dòng)桿菌的耐藥率逐漸升高，在世界各地多重耐藥菌株（MDR）的陸續(xù)報(bào)道[12]，已引起全球?qū)︴U曼不動(dòng)桿菌的廣泛關(guān)注。給養(yǎng)殖業(yè)及人類健康帶來(lái)了巨大危害，因此研究鮑曼不動(dòng)桿菌具有重要生物學(xué)意義。

藥敏實(shí)驗(yàn)表明，許多抗菌藥物對(duì)該菌有較好的抗菌作用，一旦有上述特征疾病的癥狀發(fā)生，可采用對(duì)本菌敏感的藥物進(jìn)行治療。另外，在疾病的防治上，應(yīng)該是防重于治。我們認(rèn)為，應(yīng)該加強(qiáng)野生動(dòng)物的保護(hù)和管理，從野外捕撈或不明來(lái)歷的棘胸蛙，應(yīng)先做好消毒和隔離暫養(yǎng)，安全后進(jìn)入養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行養(yǎng)殖。與此同時(shí)，養(yǎng)殖場(chǎng)應(yīng)加強(qiáng)棘胸蛙飼養(yǎng)管理，保持水體流動(dòng)及水質(zhì)清新，加強(qiáng)水質(zhì)的消毒及降溫保潔工作，且放養(yǎng)密度要適當(dāng)，切勿放養(yǎng)過(guò)密。這對(duì)于預(yù)防該種疾病的大面積蔓延具有切實(shí)有效的作用。

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Pathogen identification and drug Sensitivity of the hemorrhagic disease in Quasipaa spinosa

Abstract：Three pathogenic bacteria was isolated from diseased giant spiny frog (Quasipaa spinosa), which were used to microbial regression experimental infection. The frogs were infected by soaking in the oral, intramuscular injection, skin lesions, and skin does not damage soak ways, results showed that in addition to the oral way, various other infection ways can cause disease and death of giant spiny frogs. Moreover, the bacteria have strong pathogenicity to frogs. The is1olated strain was identified as Acinetobacter baumannii by its morphological, biochemical properties and 16S rDNA sequence analysis. At the same time, the susceptibility of isolated strains to antibiotics was studied by zone of inhibition testing. Results showed: it was sensitive to netilm icin, amikacin, m ipenem. However, it was not sensitive to penicillin, neomycin, clindamycin, cephalothin, chloramphenicol, pipemidic acid, cefoperazone, gentam icin, erythromycin.

Key words:Quasipaa spinosa; Acinetobacter baumannii; drug Sensitivity

收稿日期：2015-12-12

中圖分類號(hào)：Q958

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1004-7743（2016）01-0042-04

項(xiàng)目資助：浙江省公益性項(xiàng)目（2016C32057），浙江省重大科技專項(xiàng)（2010C12008）