張志強　王梓瑛　王曉舟　鄭　爽　馬　怡　赫麗杰

110016 遼寧省人民醫(yī)院

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LKB1對胰腺癌細胞遷移侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及機制研究

張志強王梓瑛王曉舟鄭爽馬怡赫麗杰

110016 遼寧省人民醫(yī)院

【摘要】目的研究LKB1基因?qū)θ艘认侔┘毎w移侵襲及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及機制。方法將LKB1過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至人胰腺癌細胞ASPC-1，實驗分為轉(zhuǎn)染試劑組、空載體組和LKB1過表達組。Western blot檢測細胞轉(zhuǎn)染后LKB1蛋白的表達水平；劃痕實驗和Transwell實驗分別檢測LKB1過表達對人胰腺癌細胞ASPC-1遷移、侵襲能力的影響；Western blot檢測LKB1過表達對AMPKα、p-AMPKα及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表達的影響。結(jié)果與轉(zhuǎn)染試劑組相比，LKB1過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人胰腺癌細胞ASPC-1后LKB1蛋白表達水平明顯增高(P<0.01)，細胞遷移、侵襲能力均顯著降低(P<0.01)，p-AMPKα及上皮細胞標志物E-cadherin的蛋白相對表達水平增高(P<0.01)，間質(zhì)表型細胞標志物N-cadherin和Vimentin蛋白相對表達水平顯著下降(P<0.01)。結(jié)論LKB1抑制人胰腺癌細胞ASPC-1的遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，該抑制過程可能通過激活AMPK信號通路發(fā)揮作用。

【關(guān)鍵詞】LKB1；胰腺癌；遷移；侵襲；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:362～365)

胰腺癌是惡性程度極高的消化道腫瘤之一，由于生長速度快、轉(zhuǎn)移率高、預后差等原因往往被稱為“癌中之王”。近年來，外科已經(jīng)可以切除15%～20%的患者，即使這樣，胰腺癌術(shù)后中位生存時間僅為8～12個月，晚期胰腺癌的中位生存期僅為3～6個月，浸潤和轉(zhuǎn)移是胰腺癌致死的主要原因[1-2]。我國胰腺癌發(fā)病率為5.19/10萬，且呈逐年上升趨勢，死亡率為4.39/10萬，雖低于世界平均水平，但5年生存率僅為4%[3]。近十年來針對胰腺癌的治療尚無突破性進展，進一步研究胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制對胰腺癌的早期診斷、治療及預后改善具有重要意義。

基礎研究顯示上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要過程[4]，研究顯示EMT的發(fā)生受多種因素調(diào)控。LKB1是1個抑癌基因，對細胞增殖、能量代謝等具有調(diào)控作用。既往研究顯示LKB1在胰腺癌中存在基因缺失[5]，LKB1的過表達可促進胰腺癌細胞凋亡[6]，但LKB1對胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移及EMT的影響尚不明確，本研究以人轉(zhuǎn)移胰腺癌細胞ASPC-1為研究對象，探討LKB1過表達對胰腺癌細胞遷移侵襲能力和EMT的影響及作用機制。

1材料與方法

1.1實驗材料

人胰腺癌細胞ASPC-1(中國科學院上海細胞庫)，真核表達載體pcDNA3.1、真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-LKB1(沈陽萬類)，DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco)，胎牛血清(美國Hyclone)，lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑(美國Invitrogen)，Transwell小室(美國Corning)，Matrigel基質(zhì)膠(美國BD公司)，結(jié)晶紫(美國Amresco)，RIPA裂解液(上海碧云天)，LKB1抗體、AMPKα抗體、p-AMPKα抗體、HRP標記二抗(英國Abcam)，E-cadherin抗體、N-cadherin抗體、Vimentin抗體、內(nèi)參-actin抗體、ECL化學發(fā)光底物(沈陽萬類)。

1.2方法

1.2.1細胞轉(zhuǎn)染以5×105個/孔的密度將人胰腺癌細胞ASPC-1接種于6孔培養(yǎng)板，置于37 ℃，5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。待細胞生長至80%融合時，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說明書操作，LKB1過表達組和空載體組細胞分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-LKB1和pcDNA3.1，對照組加入等量轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染后48 h采用Western blot檢測各組細胞中LKB1的表達水平。

1.2.2劃痕實驗檢測細胞遷移能力轉(zhuǎn)染后24 h進行劃痕實驗，用200 μl微量移液器的吸管垂直于細胞表面均勻劃線，無血清培養(yǎng)液洗滌細胞兩次，除去細胞碎片，顯微鏡下觀察并按組拍照。換用無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，將各組細胞置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h并記錄，計算各組細胞遷移率。

1.2.3Transwell實驗檢測細胞侵襲能力轉(zhuǎn)染后24 h收集各組細胞，將細胞稀釋成1×105個/ml的細胞懸液，取200 μl接種于包被好Matrigel膠的Transwell小室的上室。下室中加入800 μl含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。用棉簽擦去微孔濾膜上層的膠，加入多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色5 min。于200×倒置顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)侵襲細胞，取平均數(shù)。

1.2.4Western blot檢測細胞中蛋白表達水平轉(zhuǎn)染后48 h收集各組細胞，加入RIPA細胞裂解液，提取細胞總蛋白，BCA法測蛋白濃度，用5×上樣緩沖液混合蛋白后沸水浴中煮10 min，加熱變性后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，半干電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶進行封閉1 h，加入1∶1 000倍稀釋的抗人LKB1抗體、AMPKα抗體、p-AMPKα抗體、E-cadherin抗體、N-cadherin抗體、Vimentin抗體，4 ℃孵育過夜后再加入1∶5 000倍稀釋的辣根過氧化物酶標記二抗，37 ℃孵育1 h，加入ECL化學發(fā)光底物曝光顯色，掃描膠片，凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的條帶的光密度值，以β-actin為內(nèi)參進行標化處理。

1.3統(tǒng)計學處理

應用IBM SPSS 19.0進行單因素方差分析，所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，采用t檢驗分析組間差異，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1轉(zhuǎn)染LKB1過表達質(zhì)粒對人胰腺癌細胞ASPC-1中LKB1蛋白表達的影響

Western blot檢測各組細胞中LKB1蛋白表達水平，檢測結(jié)果如圖1所示，與轉(zhuǎn)染試劑組相比，空載體組LKB1蛋白相對表達水平無顯著變化，LKB1過表達組LKB1蛋白相對表達水平顯著升高(P<0.01)。

A為轉(zhuǎn)染試劑組；B為空載體組；C為LKB1過表達組。

2.2LKB1過表達對人胰腺癌細胞ASPC-1遷移能力的影響

細胞劃痕實驗檢測LKB1過表達對人胰腺癌細胞ASPC-1遷移能力的影響，結(jié)果如圖2所示，與轉(zhuǎn)染試劑組(46.01±5.23)相比，空載體組(44.08±3.92)細胞遷移能力無明顯變化，LKB1過表達組(23.48±3.18)細胞遷移能力明顯下降(P<0.01)，提示LKB1過表達對人胰腺癌細胞ASPC-1體外遷移能力具有抑制作用。

A為轉(zhuǎn)染試劑組；B為空載體組；C為LKB1過表達組。

2.3LKB1過表達對人胰腺癌細胞ASPC-1侵襲能力的影響

Transwell實驗檢測LKB1過表達對人胰腺癌細胞ASPC-1侵襲能力的影響，檢測結(jié)果如圖3所示，與轉(zhuǎn)染試劑組(112.39±10.89)相比，空載體組(107.99±10.99)細胞侵襲能力無明顯變化，LKB1過表達組(57.89±7.89)細胞侵襲能力明顯降低(P<0.01)，表明LKB1過表達對人胰腺癌細胞ASPC-1侵襲能力具有抑制作用。

A為轉(zhuǎn)染試劑組；B為空載體組；C為LKB1過表達組。

2.4LKB1過表達對人胰腺癌細胞ASPC-1上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

Western blot檢測LKB1過表達對人胰腺癌細胞ASPC-1上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白E-cadherin、N-cadherin及Vimentin表達水平的影響，檢測結(jié)果如圖4所示，與轉(zhuǎn)染試劑組相比，空載體轉(zhuǎn)染組各指標無明顯變化，LKB1過表達組上皮細胞標志物E-cadherin蛋白相對表達水平明顯升高(P<0.01)，間質(zhì)表型細胞標志物N-cadherin及Vimentin的蛋白相對表達水平明顯降低(P<0.01)，提示LKB1過表達對人胰腺癌細胞ASPC-1上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化具有明顯抑制作用。

A為轉(zhuǎn)染試劑組；B為空載體組；C為LKB1過表達組。

2.5LKB1過表達對人胰腺癌細胞ASPC-1中AMPK信號通路的影響

Western blot檢測LKB1過表達對人胰腺癌細胞ASPC-1中AMPK信號通路相關(guān)蛋白AMPKα及p-AMPKα表達水平的影響，檢測結(jié)果如圖5所示，與轉(zhuǎn)染試劑組相比，空載體組AMPKα和p-AMPKα的蛋白表達水平均無顯著變化，LKB1過表達組AMPKα表達水平較轉(zhuǎn)染試劑組無明顯變化，p-AMPKα蛋白相對表達水平明顯升高(P<0.01)，提示在人胰腺癌細胞ASPC-1中過表達LKB1可磷酸化激活AMPKα。

3討論

胰腺癌大多數(shù)起源于腺管上皮的導管腺癌，早期無明顯癥狀和體征，缺乏有效的早期篩查和診斷方法，80%以上患者就診時已處于局部晚期或晚期，手術(shù)切除機會僅有15%～20%[7]。晚期胰腺癌的中位生存期僅為3～6個月，局部晚期者術(shù)后中位時間也僅為8～12個月。既往研究發(fā)現(xiàn)胰腺癌組織中存在多個基因表達異常，其中LKB1(liver kinase B1)在胰腺癌組織中存在表達缺失或下降[5,8-9]，但其具體作用機制尚未明確。

A為轉(zhuǎn)染試劑組；B為空載體組；C為LKB1過表達組。

LKB1又稱STK11(serine-threonine kinase 11,STK11)，定位于人染色體19p13.3，編碼進化保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，可磷酸化激活AMPK及12種AMPK相關(guān)激酶[10]。研究發(fā)現(xiàn)在LKB1缺失的腫瘤細胞中導入LKB1可引起p53依賴的激酶抑制因子p21表達升高，使細胞周期停滯于G1期。LKB1缺失或下調(diào)則伴隨著p21表達下降，促進腫瘤細胞增殖[11]。在LKB1表達缺失的乳腺癌細胞中導入LKB1可抑制細胞遷移和侵襲，減少腫瘤細胞向肺部轉(zhuǎn)移[12]。Hezel等研究發(fā)現(xiàn)LKB1基因缺失可引發(fā)小鼠漿液性囊腺瘤，破壞腺泡細胞結(jié)構(gòu)完整性，使細胞失去極性，同時伴隨腺泡導管上皮化生[13]。本研究結(jié)果顯示LKB1過表達可引起人胰腺癌細胞ASPC-1遷移侵襲能力下降，提示LKB1具有潛在抑制胰腺癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的能力。

既往的研究證實上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions，EMT)是腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的重要因素之一[14]。EMT是指上皮細胞在特定的生理和病理情況下向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象。自然狀態(tài)下，上皮細胞排列緊密，細胞間質(zhì)少，具有高度的極性，間質(zhì)細胞結(jié)構(gòu)松散，缺乏細胞連接和細胞極性。EMT發(fā)生后細胞黏附性降低，運動能力增強，遷移和侵襲能力增加，EMT的特征性表現(xiàn)是上皮細胞標志物E-cadherin降低，間質(zhì)表型細胞標志物N-cadherin、Vimentin表達增加[15]。本實驗結(jié)果顯示LKB1過表達可顯著增加人胰腺癌細胞ASPC-1中E-cadherin蛋白相對表達量，降低N-cadherin和Vimentin的蛋白表達水平，表明LKB1在一定程度上抑制人胰腺癌細胞EMT的發(fā)生，可能通過該作用抑制胰腺癌浸潤和遠端轉(zhuǎn)移。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是LKB1的1種重要底物，它是真核細胞在ATP水平較低的情況下存在的1種主要的細胞應激因子，由α、和γ亞基組成的異源三聚體。α-亞基N-末端包含一個保守的Ser/Thr激酶區(qū)，其中蘇氨酸(Thr-172)位點的磷酸化是其激酶活性所必需的[16]。LKB1可以在體外直接磷酸化AMPK的Thr-172從而活化AMPK，在LKB1缺乏的小鼠胚胎中幾乎沒有檢測到AMPK的Thr-172位點的磷酸化。此外，研究表明AMPK的激活劑可逆轉(zhuǎn)乳腺癌細胞和前列腺癌細胞間質(zhì)表型，沉默AMPK后逆轉(zhuǎn)作用消失，提示AMPK在腫瘤細胞EMT過程中發(fā)揮重要作用[17]。本研究結(jié)果顯示，LKB1過表達可明顯增加人胰腺癌細胞ASPC-1中p-AMPKα的蛋白表達，降低細胞間質(zhì)表型標記物N-cadherin和Vimentin的表達，提示LKB1可能通過磷酸化激活AMPKα抑制人胰腺癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，降低細胞遷移侵襲能力，LKB1有可能成為胰腺癌浸潤和轉(zhuǎn)移的一個治療靶點。

參考文獻

[1]Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics,2012〔J〕.CA Cancer J Clin,2012,62(1):10-29.

[2]Vincent A,Herman J,Schulick R,et al.Pancreatic cancer〔J〕.Lancet,2011,378(9791):607-620.

[3]李慧超,鄭榮壽,張思維,等.中國2010年胰腺癌發(fā)病和死亡分析〔J〕.中國腫瘤,2015,24(3):163-169.

[4]Bonnomet A,Brysse A,Tachsidis A,et al.Epithelial-to-me-

senchymal transitions and circulating tumor cells〔J〕.J Mammary Gland Biol Neoplasia,2010,15(2):261-273.

[5]Sahin F,Maitra A,Argani P,et al.Loss of Stk11/Lkb1 expression in pancreatic and biliary neoplasms〔J〕.Mod Pathol,2003,16(7):686-691.

[6]Qanungo S,Haldar S,Basu A.Restoration of silenced Peutz-Jeghers syndrome gene,LKB1,induces apoptosis in pancreatic carcinoma cells〔J〕.Neoplasia,2003,5(4):367-374.

[7]Hidalgo M.Pancreatic cancer〔J〕.N Engl J Med,2010,362(17):1605-1617.

[8]De Wilde RF,Ottenhof NA,Jansen M,et al.Analysis of LKB1 mutations and other molecular alterations in pancreatic acinar cell carcinoma〔J〕.Mod Pathol,2011,24(9):1229-1236.

[9]Morton JP,Jamieson NB,Karim SA,et al.LKB1 haploinsufficiency cooperates with Kras to promote pancreatic cancer through suppression of p21-dependent growth arrest〔J〕.Gastroenterology,2010,139(2):586-597.

[10]Gan RY,Li HB.Recent progress on liver kinase B1(LKB-

1): expression,regulation,downstream signaling and cancer suppressive function〔J〕.Int J Mol Sci,2014,15(9):16698-16718.

[11]Tiainen M,Vaahtomeri K,Ylikorkala A,et al.Growth arrest by the LKB1 tumor suppressor: induction of p21(WAF1/CIP1)〔J〕.Hum Mol Genet,2002,11(13):1497-1504.

[12]Zhuang ZG,Di GH,Shen ZZ,et al.Enhanced expression of LKB1 in breast cancer cells attenuates angiogenesis,invasion,and metastatic potential〔J〕.Mol Cancer Res,2006,4(11):843-849.

[13]Hezel AF,Gurumurthy S,Granot Z,et al.Pancreatic LKB1 deletion leads to acinar polarity defects and cystic neoplasms〔J〕.Mol Cell Biol,2008,28(7):2414-2425.

[14]Thiery JP.Epithelial-mesenchymal transitions in developm-

ent and pathologies〔J〕.Curr Opin Cell Biol,2003,15(6):740-746.

[15]Thiery JP,Acloque H,Huang RY,et al.Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease〔J〕.Cell,2009,139(5):871-890.

[16]Sarnowska E,Balcerak A,Olszyna-Serementa M,et al.AM-

P-activated protein kinase(AMPK) as therapeutic target〔J〕.Postepy Hig Med Dosw(Online),2013,67:750-760.

[17]Chou CC,Lee KH,Lai IL,et al.AMPK reverses the mesenchymal phenotype of cancer cells by targeting the Akt-MDM2-Foxo3a signaling axis〔J〕.Cancer Res,2014,74(17):4783-4795.

(編輯：吳小紅)

Effects of LKB1 on Migration,Invasion and Epithelial-Mesenchymal Transition in Pancreatic Carcinoma Cells

ZHANGZhiqiang,WANGZiying,WANGXiaozhou,etal.

LiaoningProvincialPeople′sHospital,Shenyang,110016

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects and mechanism of LKB1 on migration,invasion and epithelial-mesenchymal transition in human pancreatic carcinoma cells.MethodsHuman pancreatic carcinoma ASPC-1 cells were transfected with pcDNA3.1-LKB1.The experiment was divided into Mock,Vector and Vector-LKB1 group.The protein expression level of LKB1 was validated by Western blot.Cell migration and invasion ability was determined by the scratch tests and Transwell assay.The protein expression level of AMPKα,p-AMPKα and epithelial-mesenchymal transition(EMT)-related markers(E-cadherin,N-cadherin and Vimentin) were assayed by Western blot analysis.ResultsThe protein expression level of LKB1 was significantly increased in Vector-LKB1 group compared with the Mock group(P<0.01),and the ability of cell migration and invasion was strongly reduced(P<0.01).Increased expression of p-AMPKα,epithelial marker(E-cadherin) and decreased expression of mesenchymal markers(N-cadherin,Vimentin) were observed in Vector-LKB1 group compared with the Mock group(P<0.01).ConclusionLKB1 inhibit migration,invasion ability and epithelial-mesenchymal transition of human pancreatic carcinoma ASPC-1 cells,which may act through activating AMPK signaling pathway.

【Key words】LKB1;Pancreatic carcinoma;Migration;Invasion;Epithelial-mesenchymal transition

(收稿日期2015-08-24修回日期 2016-01-20)

中圖分類號：R735.9

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2016)03-0362-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.03.005

通訊作者：赫麗杰