李　萌　張　靖　張煥新

(南陽市中心醫(yī)院，河南　南陽　473000)

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PPARγ激活物對缺氧缺血性腦損傷大鼠神經行為學功能的影響

李萌張靖張煥新

(南陽市中心醫(yī)院，河南南陽473000)

〔摘要〕目的探討激活過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ對缺氧缺血性腦損傷(HIBI)大鼠神經行為學功能的影響。方法80只成年SD大鼠隨機分為假手術組、HIBI組、曲格列酮(TGZ，PPARγ激動劑)組和GW9662(PPARγ抑制劑)組。采用RICE法制備HIBI模型后，TGZ組和GW9662組分別于HIBI后腹腔注射20 mg/kg TGZ或10 mg/kg GW9662。采用早期神經反射分析術后2、4、7 d的懸崖調轉、陰性趨地性反射和步態(tài)時間，步跡分析術后14 d手術同側、對側的步長和趾間距，Morris水迷宮分析術后21 d的游泳距離和逃避潛伏期，干濕質量法測定術后2、4、7 d的腦組織含水量，免疫組化檢測術后28 d損傷腦組織中腦神經相關生長蛋白(GAP)-43表達。結果與假手術組比較，HIBI組早期神經反射相關時間指標均延長，手術對側步長和趾間距及Morris水迷宮的游泳距離、逃避潛伏期和站臺所在象限停留時間均縮小，腦組織含水量升高，且GAP-43陽性細胞減少(P<0.05)。TGZ可改善HIBI大鼠的以上異常指標(P<0.05)，但與假手術組仍有顯著差異(P<0.05)；HIBI大鼠以上異常指標經GW9662處理后進一步惡化。結論激活PPARγ可改善HIBI導致的大鼠神經行為學功能異常，減輕腦水腫并促進損傷腦細胞的恢復。

〔關鍵詞〕過氧化物酶體增殖物激活受體γ；缺氧缺血性腦損傷；神經行為學

缺氧缺血性腦病(HIE)目前尚無特效方法治療，神經系統(tǒng)損傷的主要特征為神經元損害，而常用藥物及低溫療法對于損傷神經結構的功能恢復較為局限，故急需探討新治療手段。過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)是一組配體激活的轉錄因子受體，包括3種不同的亞型，其中PPARγ已證實具有較好的神經保護作用〔1~3〕，因此推測PPARγ激活劑對于HIE引起的神經損傷有一定保護作用。本研究擬采用PPARγ經典激活劑曲格列酮(TGZ)處理缺氧缺血性腦損傷(HIBI)大鼠，觀察對其神經行為學功能的影響。

1材料與方法

1.1動物分組80只成年Sprague-Dawley雄性大鼠(體重180~250 g)購自購自上海斯萊克實驗動物中心，適應性飼養(yǎng)3 d后隨機分為假手術組、HIBI組、TGZ(PPARγ激動劑)組和GW9662(PPARγ抑制劑)組各20只。采用RICE法制備HIBI模型6 h后，TGZ組和GW9662組分別于HIBI后腹腔注射20 mg/kg TGZ或10 mg/kg GW9662，1次/d，連續(xù)給藥7 d。所有大鼠均采用國家標準嚙齒類動物飼料飼養(yǎng)，人工控制光照(光照時間為09：00~21：00)，環(huán)境溫度22℃~26℃，相對濕度45%~55%，可自由進食進水。

1.2HIBI動物模型制備采用RICE法制備HIBI模型〔4〕，操作步驟簡述如下：乙醚吸入麻醉1~2 min后仰臥，切開頸部正中皮膚，行左頸總動脈分離，用5號滅菌雙道線結扎后切斷，術后恢復2 h后置于缺氧箱中，吸入8%氧與92%氮氣的混合體90 min(氣體流量為5 L/min)。假手術組僅分離左側頸總動脈，不行結扎且不吸入氮氧混合氣體。

1.3神經反射分析每組隨機取8只大鼠均于術后2、4、7 d評估發(fā)育神經反射情況。 (1)懸崖調轉反射：大鼠前爪從木板邊緣退回或調轉頭部所需的時間；(2)陰性趨地性：將大鼠的頭面朝向下方，放置在傾斜角為45°的平整木板上(長30 cm)，記錄大鼠倒轉 180°所需時間；(3)步態(tài)：將大鼠放置在直徑為13 cm的白色圓紙中央，記錄兩側前爪爬出圓紙的時間。以上時間均以秒(s)為計時單位，時間越長評分越差。

1.4步跡分析每組隨機取8只大鼠于術后14 d進行足跡分析。將大鼠腳爪連續(xù)染色，當其沿被抬高的跳板行走時，足跡印在紙上。對紙上每一個印記進行測量分析，將手術同側或對側后爪第1個腳趾和第5個腳趾之間的距離計為趾間距，將每個爪之間的距離計為步長。

1.5Morris水迷宮實驗每組隨機取8只大鼠于術后21 d進行Morris水迷宮實驗，Morris 水迷宮由圓形水池(直徑110 cm、高度60 cm、水深35 cm)、攝像頭及分析系統(tǒng)組成，將水池分為1、2、3、4共四個象限，任選一象限正中放置平臺(水面必須高于站臺2 cm)，訓練時隨機選取一個象限入水點處面向池壁將大鼠放入水中，每個時間段從 4個不同的入水點入水，記錄大鼠從入水點入水至爬上水下平臺的時間(逃避潛伏期)，同時記錄游泳距離和站臺所在象限停留時間。

1.6干濕質量法采用干濕質量法測定腦組織含水量，每組取12只于術后2、4、7 d斷頭處死大鼠(每個時間點取4只)，在冰盤上迅速開顱取腦，剔除嗅球、小腦和低位腦干，稱取大腦濕重，于110℃恒溫干燥箱內干燥24 h至恒重，稱干重后按Elliot公式計算腦含水量：腦含水量=(腦濕重-腦干重)/腦濕重×100%。

1.7免疫組化每組取8只大鼠應用免疫組化檢測術后28 d損傷腦組織中腦神經相關生長蛋白-43(GAP-43)表達。將大鼠處死后，開顱取腦，依次經4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋、冠狀切片(厚約3 μm)，采用GAP-43一抗進行免疫組化染色。每個樣本選取5個高倍視野，計數GAP-43的陽性細胞數，GAP-43陽性信號表現為點狀或顆粒樣棕褐色免疫反應產物。

1.8統(tǒng)計學處理采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2結果

2.1激活PPARγ對HIBI大鼠早期神經反射的影響

2.1.1懸崖調轉時間與假手術組相比，HIBI組術后2、4、7 d的懸崖調轉時間均延長(P<0.05)，PPARγ激活劑TGZ可縮短HIBI大鼠的懸崖調轉時間，但經PPARγ抑制劑GW9662處理后進一步延長，與HIBI組的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1A。

2.1.2 陰性趨地性反射時間4組術后2 d陰性趨地性反射時間的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與假手術組相比，HIBI組術后4、7 d的陰性趨地性反射時間均延長，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，PPARγ激活劑TGZ可縮短HIBI大鼠的陰性趨地性反射時間，但經PPARγ抑制劑GW9662處理后進一步延長，與HIBI組的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1B。

2.1.3步態(tài)時間HIBI組、TGZ組術后2 d的步態(tài)時間與假手術組的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與假手術組相比，HIBI組術后4、7 d的步態(tài)時間均延長(P<0.05)，PPARγ激活劑TGZ可縮短HIBI大鼠的步態(tài)時間，但經PPARγ抑制劑GW9662處理后進一步延長，與HIBI組的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1C。

與假手術組比較：1)P<0.05；與HIBI組比較：2)P<0.05；與TGZ組比較：3)P<0.05圖1　激活PPARγ對HIBI大鼠早期神經反射的影響

2.2激活PPARγ對HIBI大鼠步跡的影響4組手術同側步長和趾間距的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與假手術組相比，HIBI組手術對側步長和趾間距均縮小(P<0.05)，PPARγ激活劑TGZ可增加HIBI大鼠的手術對側步長和趾間距，但PPARγ抑制劑GW9662可進一步縮小手術對側步長和趾間距，與HIBI組的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1　激活PPARγ對HIBI大鼠步長和趾間距的

與假手術組比較：1)P<0.05；與HIBI組比較：2)P<0.05；與TGZ組比較：3)P<0.05，下表同

2.3激活PPARγ對HIBI大鼠空間運動記憶的影響與假手術組相比，HIBI組的站臺所在象限停留時間縮小(P<0.05)，PPARγ激活劑TGZ可增加HIBI大鼠的上述指標，但PPARγ抑制劑GW9662可進一步縮小上述指標，與HIBI組的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

2.4激活PPARγ對HIBI大鼠腦組織水腫程度的影響與假手術組相比，HIBI組術后腦組織的含水量均升高(P<0.05)，PPARγ激活劑TGZ可降低HIBI大鼠的腦組織含水量，但經PPARγ抑制劑GW9662處理后進一步增加，與HIBI組的差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表2　激活PPARγ對HIBI大鼠空間運動記憶的影響

表3　激活PPARγ對HIBI大鼠腦組織含水量的

2.5激活PPARγ對HIBI大鼠腦組織GAP-43表達的影響HIBI組、TGZ組和GW9662組的GAP-43陽性細胞數分別為(20.1±1.2)、(28.3±2.0)和(12.6±1.7)個/cm2，均低于假手術組的(36.2±2.5)個/cm2(P<0.05)；與HIBI組相比，TGZ組的GAP-43陽性細胞數升高，而GW9662組的降低(P<0.05)。見圖2。

圖2　各組大鼠腦組織GAP-43表達的免疫組化染色(SP ×400)

3討論

神經行為是一個極其復雜的過程，由神經網絡精密調控，此過程的強弱與準確受中樞神經系統(tǒng)的調控〔5〕。HIE是新生兒高發(fā)疾病，致死率高，嚴重影響了患兒的生活質量，如患兒常遺留運動發(fā)育異常、智力低下及腦癱等后遺癥。目前HIE治療的重點是促進受損神經元的功能恢復，但療效較為局限，僅能局部改善癥狀。PPARγ目前已證實具有神經保護作用，可促進神經元存活，如去除PPARγ后神經元對缺血的耐受降低〔6〕，而采用TGZ激活PPARγ可提高大鼠運動神經元的存活率，減少大腦中動脈梗阻腦缺血模型的梗死面積，阻止神經元的凋亡和氧化應激〔7〕。鑒于促進神經元新生及功能恢復是HIE治療的關鍵，本研究推測激活PPARγ對HIBI大鼠神經行為學功能可能發(fā)揮保護作用。神經行為學缺陷是HIE后遺癥的常見表現，如對側肢體痙攣性偏癱和縮短的步距〔8〕。本研究提示HIBI大鼠出現明顯的學習記憶能力損傷。此外，HIBI大鼠右側肢體出現明顯的偏癱癥狀。TGZ組治療后的偏癱表現及記憶功能較HIBI組大鼠明顯改善，表明激活PPARγ可對HIBI術后的偏癱表現及記憶功能損傷有較好改善效果，而給予GW9662處理后HIBI大鼠的以上指標出現明顯惡化趨勢，進一步驗證了PPARγ在改善HIBI所致神經行為學缺陷的重要意義，但潛在機制尚不清楚，多項研究認為可能通過多種途徑減輕了神經元本身損傷所致的有害效應。以上機制可能包含如下途徑：(1)PPARγ激活可穩(wěn)定線粒體活性，改善了缺血缺氧導致的氧化應激，同時激活PPARγ可上調抗凋亡蛋白表達，利于阻止神經元凋亡，促進了神經元存活〔7，9〕；(2)缺血缺氧可引起中樞神經元損傷，而神經軸索的再生能力有限，PPARγ激活可增強和刺激軸索生長，進一步促進了神經功能的恢復〔10〕；(3)膠質細胞屬于高反應性細胞，而缺血缺氧可刺激其釋放損傷因子并介導炎癥反應，PPARγ激活可抑制膠質細胞的功能，為神經元再生及存活提供良好環(huán)境〔11，12〕。

Morris水迷宮是評估嚙齒類動物學習記憶功能的重要工具〔13〕。本研究提示HIBI大鼠出現了學習記憶功能障礙。采用TGZ 激活PPARγ后，HIBI大鼠的相關指標獲顯著改善，表明激活PPARγ對于緩解缺血缺氧導致的學習記憶功能障礙亦有較好的保護作用，可能是多種機制共同參與的結果。本研究同時發(fā)現TGZ 處理后HIBI大鼠的腦水腫癥狀及腦組織GAP-43表達獲改善，從多方面證實了激活PPARγ在缺氧缺血性腦損傷中的保護效果。

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〔2015-11-10修回〕

(編輯滕欣航)

〔中圖分類號〕R74

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)07-1582-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.020

第一作者：李萌(1985-)，女，護師，主要從事新生兒臨床研究。