熊　英　顧一煌　吳云川

(南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學一級學科，江蘇　南京　210046)

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艾灸預處理對急性力竭運動大鼠心肌損傷及蛋白激酶C的影響

熊英顧一煌吳云川

(南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學一級學科，江蘇南京210046)

〔摘要〕目的探討艾灸預處理對急性力竭運動導致的心肌損傷的保護作用及蛋白激酶C(PKC)的影響。方法健康雄性SD雄性大鼠40只，隨機分為正常對照組(C組)、艾灸組(M組)、力竭組(E組)、艾灸力竭組(ME組)和艾灸力竭+PKC抑制劑組(ME+CHE組)5組。在一次性游泳急性力竭模型的基礎上，用艾灸預處理進行干預，并注射PKC抑制劑白屈菜紅堿(CHE)，采用透射電鏡觀察心肌細胞超微結(jié)構(gòu)的變化，運用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測大鼠心肌PKC蛋白水平及其活化情況。結(jié)果①E組心肌超微結(jié)構(gòu)損傷改變明顯，ME組心肌超微結(jié)構(gòu)損傷較E組輕，而ME+CHE組心肌超微結(jié)構(gòu)損傷程度與E組相似。②與C組比較，M組和ME組PKC蛋白水平無明顯變化，E組和ME+CHE組p-PKC水平均有明顯升高(P<0.05)；與E組比較，ME組PKC水平有明顯下降(P<0.05)，ME+CHE組水平無明顯變化；與ME組比較，ME+CHE組PKC水平有明顯上升(P<0.05)。③與C組p-PKC水平比較，M組無明顯變化，E組、ME組和ME+CHE組水平均有明顯升高(P<0.05)；與E組比較，ME組p-PKC水平有明顯下降(P<0.05)；與ME組比較，ME+CHE組P-PKC水平有明顯上升(P<0.05)。結(jié)論急性力竭運動所致的心肌損傷與PKC的過度表達和活化有關，艾灸預處理對急性力竭所致的心肌損傷有保護作用，阻止PKC的過度表達和活化可能是其起效的機制之一。

〔關鍵詞〕艾灸；預處理；心肌超微結(jié)構(gòu)；蛋白激酶C(PKC)

艾灸是祖國醫(yī)學“治未病”的常用手段，早在古代即有艾灸防治心血管疾病的大量記載，本實驗也證實艾灸預處理對運動性心肌損傷有一定的防治作用。蛋白激酶C(PKC)是預處理心肌保護效應中重要的中介物質(zhì)之一〔1〕，但也有研究表明PKC過度活化可加重心肌缺血再灌注(I/R)損傷的程度〔2〕。鑒于以往的研究結(jié)果，本研究在大鼠急性力竭游泳運動模型的基礎上，運用艾灸預處理進行干預，并使用PKC抑制劑白屈菜紅堿(CHE)，觀察艾灸預處理對急性力竭大鼠心肌損傷的保護作用及心肌PKC表達及活化的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物選用健康雄性SD大鼠37只，體重190~210 g。大鼠常規(guī)分籠飼養(yǎng)，一組一籠，均以標準嚙齒類動物飼料飼養(yǎng)，自由飲食。室溫保持在20℃～22℃，相對濕度45%～50%，光照時間為12 h/d。大鼠參照隨機數(shù)字表分為5組，包括正常對照組(C 組，n=7)、艾灸組(M組，n=8)、力竭組(E組，n=6)、艾灸力竭組(ME組，n=8)、艾灸力竭+CHE組(ME+CHE組，n=8)。

1.2力竭模型的建立力竭模型參照彭澤胄等〔3〕的文獻報道，先進行2 d適應性游泳(20 min/次)，而后進行一次性力竭游泳運動，游泳大鼠尾部負重為體重3%，直至力竭。力竭標準：連續(xù)沉入水中超過10 s，撈出后置于平面不能完成翻正反射。在相對較短時間內(nèi)力竭的大鼠，將其撈出休息5 min后，再繼續(xù)進行游泳運動，使每次運動時間不少于2 h。游泳后，迅速用干毛巾擦干水分，電吹風吹干后，放回籠中休息。

1.3分組所有大鼠進入動物房后，先適應性喂養(yǎng)3 d，各組在同一時間取材。C組：在E組大鼠力竭游泳前，適應性游泳2 d，次日麻醉取材。M組：從E組大鼠游泳前7 d開始，進行艾灸預處理，取大鼠單側(cè)“內(nèi)關”、“足三里”，兩側(cè)輪換，每穴各灸15 min，共灸30 min，每天1次，其他無特殊處理，艾灸第6、7天進行適應性游泳，次日麻醉取材。E組：在大鼠力竭游泳前，適應性游泳2 d，次日一次性游泳至力竭，在訓練結(jié)束30 min后進行取材。ME組：訓練方案同E組，從力竭游泳前7 d開始進行艾灸預處理，方法同M組，艾灸第6、7天進行適應性游泳，次日進行一次性游泳至力竭。在訓練結(jié)束30 min后進行取材。ME+CHE組:處理同ME組，但每天在艾灸前給大鼠腹腔注射CHE(5 mg/kg)，而后開始艾灸。

1.4取材和電鏡標本制備將大鼠用0.4%戊巴比妥鈉(1 ml/100 g體重)腹腔注射麻醉后，呈仰臥位固定，打開胸腔，暴露心臟，取出心臟，取左心室心尖心內(nèi)膜下組織1 mm3，3%戊二醛固定和1%鋨酸后固定(4℃)，逐級酒精-丙酮脫水，Epon812樹脂包埋，0.5%美藍染色，半薄定位。超薄切片機切片，切片厚50~60 nm，醋酸鈾-檸檬酸鉛復染，制成電鏡標本，在Hitach1透射電鏡下觀察攝片。

1.5ELISA法檢測PKC及p-PKC蛋白表達取樣品在4℃10 000 r/min離心5 min，取上清，用 BCA 法對蛋白濃度進行測定，采用 ELISA法在酶標儀上讀出 OD 值，所有 OD 值減去除零孔值后再行計算。以標準品的 OD 值使用相應軟件繪制出標準曲線，計算樣品含量。

1.6數(shù)據(jù)處理采用SPSS11.5軟件行單因素方差分析、LSD檢驗，方差不齊用DunnettT3進行檢驗。

2結(jié)果

2.1各組心肌細胞透射電鏡觀察結(jié)果C組心肌細胞超微結(jié)

構(gòu)正常，肌膜完整，肌原纖維排列規(guī)則，線粒體呈帶狀分布，排列整齊，形態(tài)正常，嵴清晰。M組與C組沒有明顯差異。E組心肌超微結(jié)構(gòu)改變明顯，細胞膜雖完整，但肌原纖維排列不規(guī)則并有斷裂處，纖維間空隙增大，線粒體腫脹嚴重，或線粒體溶解破裂，呈空泡狀，嵴消失。ME組心肌超微結(jié)構(gòu)損傷較E組程度減輕，細胞膜完整，肌原纖維排列較規(guī)則，但間隙較大，線粒體腫脹減輕，嵴較清晰。而ME+CHE組心肌超微結(jié)構(gòu)也有明顯改變，其損傷程度與E組相似。見圖1。

2.2ELISA法檢測各組心肌組織PKC及p-PKC蛋白含量與C組比較，M組PKC蛋白水平無明顯變化，ME組水平雖有上升，但與C組沒有明顯差異，E組和ME+CHE組PKC水平均有明顯升高(P<0.05)；與E組比較，ME組PKC水平有明顯下降(P<0.05)，ME+CHE組水平無明顯變化；與ME組比較，ME+CHE組PKC水平有明顯上升(P<0.05)。大鼠心肌p-PKC的ELISA檢測結(jié)果比較(見表1)，與C組比較，M組p-PKC蛋白水平雖有上升，但無明顯差異，E組、ME組和ME+CHE組水平均有明顯升高(P<0.05)；與E組比較，ME組p-PKC水平有明顯下降(P<0.05)，ME+CHE組水平無明顯變化；與ME組比較，ME+CHE組PKC水平有明顯上升(P<0.05)。見表1。

表1　大鼠心肌組織PKC及p-PKC蛋白水平

1)與C組比較，2)與E組比較，3)與ME組比較：P<0.05

圖1　各組心肌細胞透射電鏡觀察結(jié)果(×2 000)

3討論

超負荷訓練的運動量可能接近極度的疲勞或力竭，也是導致運動員猝死的原因之一〔4,5〕。研究認為運動訓練中，心臟肯定存在缺血、缺氧現(xiàn)象，但在其自我保護機制的作用下不會使心肌損傷，而一旦運動負荷超出了機體的防御能力與心臟的耐受，可造成心肌損傷。急性力竭運動可使心肌出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化加強、鈣離子(Ca2+)超載等現(xiàn)象，致心肌損傷。由于運動后心肌損傷的時相性變化與臨床上心肌I/R損傷的改變一致，故這種心肌損傷又稱為運動性I/R損傷〔6〕。

預處理可以調(diào)動機體內(nèi)源性保護機制，對一些疾病起到預防和治療的作用。1986年Murry等〔7〕提出缺血預處理對心臟有保護作用以來,人們開始通過各種預處理手段來調(diào)動臟器內(nèi)源性保護作用。艾灸預處理又被稱為“逆灸”，是中醫(yī)“治未病”的重要內(nèi)容，“無病而先針灸曰逆。逆,未至而迎之也”。早在古代即有艾灸防治心血管疾病的大量記載，現(xiàn)代研究亦表明艾灸對于心肌I/R具有保護作用〔8〕。本課題組在前期的研究中也發(fā)現(xiàn)艾灸能通過提高大鼠的心肌抗氧化能力，從而對心肌損傷有一定的保護作用〔9〕。

本實驗結(jié)果提示，力竭運動導致心肌細胞超微結(jié)構(gòu)損傷、心肌細胞腫脹、線粒體呈現(xiàn)空泡狀、嵴消失。而艾灸預處理后對力竭運動大鼠的心肌細胞有一定的保護作用，可見心肌細胞腫脹及線粒體的損傷程度等均比力竭大鼠有明顯的減輕，但艾灸預處理對沒有參與力竭的大鼠心肌無明顯影響。PKC是預適應心肌保護效應中重要的中介物質(zhì)之一。近年研究表明,PKC的激活、轉(zhuǎn)位介導了心肌缺血預處理效應,而其抑制劑則能消除此種保護效果〔10〕,故而有人提出PKC介導的預處理中蛋白磷酸化可能是預處理細胞保護作用的重要環(huán)節(jié),早期的PKC活化即在整個預處理中起關鍵作用。但艾灸預處理如何影響急性力衰運動中心肌PKC的表達活化還不得而知。

本研究結(jié)果顯示，力竭運動導致大鼠心肌PKC及p-PKC蛋白水平均有顯著升高，而艾灸預處理使其蛋白水平均有顯著降低。已有研究表明，雖然δPKC的活化是IP發(fā)揮心肌保護效應的環(huán)節(jié)之一，但過度活化可加重心肌I/R損傷的程度，抑制心肌I/R時再灌注期的δPKC活性可以緩解心肌的損傷〔11~13〕;而過度表達和活化的αPKC也會使心肌收縮能力受損而加重心肌損傷〔14〕。所以，推測，PKC含量過多及活化過度可能是其導致急性力竭運動后心肌損傷的機制之一，而艾灸預處理能抑制過度升高及活化的PKC，而對心肌損傷產(chǎn)生一定的保護作用。由于自由基是 PKC 調(diào)控中的關鍵物質(zhì)之一，而前期的研究也表明艾灸能通過提高大鼠的心肌抗氧化能力，對心肌損傷有一定的保護作用〔9〕，所以筆者認為，艾灸預處理可能通過改善力竭運動心肌的氧化應激狀態(tài)而使PKC及其活化水平降低。

CHE是PKC的選擇性抑制劑，可與 PKC 的催化部位結(jié)合而使其失活，抑制PKC的磷酸化〔15〕。在本研究中，注射CHE使艾灸預處理后力竭大鼠心肌PKC及p-PKC蛋白的表達明顯升高，提示CHE抑制了艾灸預處理后大鼠PKC及 p-PKC蛋白表達的下降，這可能是其導致艾灸預處理心肌保護作用消失的主要原因。有研究發(fā)現(xiàn)，PKC抑制劑 CHE 能阻斷大鼠在運動預適應即刻和24 h δPKC下降的趨勢〔16〕，這與本研究的結(jié)果有相似之處，不過預處理手段截然不同。

另有研究證實CHE還有其獨立的生物學作用，CHE 能誘導自由基的產(chǎn)生，而此過程與抑制PKC無關；而且其誘導自由基的產(chǎn)生所致大鼠心肌凋亡的作用比抑制 PKC 的作用更顯著，而自由基又是促進PKC活化的重要物質(zhì)〔17~19〕。

本研究中注射 CHE 后使艾灸預處理的力竭大鼠心肌PKC蛋白表達和活化增加，筆者推測可能是一方面由于 CHE 阻斷PKC 活性后致PKC 在膜上的停留時間增加，同時誘導PKC 蛋白的進一步表達，使PKC 補償性增多；另一方面由于CHE獨立誘導自由基產(chǎn)生，促使PKC水平和活化增加，從而使艾灸預處理作用不能正常發(fā)揮。

綜上，急性力竭游泳運動造成大鼠一定程度的心肌損傷，艾灸預處理對正常大鼠沒有明顯影響，但能一定程度保護力竭運動大鼠的心肌，而注射CHE會影響艾灸預處理對心肌的保護作用。力竭運動導致心肌PKC的過度表達和活化，可能是心肌損傷的機制之一，艾灸預處理明顯抑制過度表達的PKC及其活化，可能是艾灸預處理心肌保護的機制之一，CHE顯著阻礙了艾灸預處理對PKC水平升高及其活化的抑制作用，其機制可能與其補償性增加和獨立誘導自由基的作用相關。

4參考文獻

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〔2014-12-03修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢園)

〔中圖分類號〕R245

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)07-1575-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.017

基金項目：江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目(2014年)；南京中醫(yī)藥大學中醫(yī)學一級學科開放課題資助(YS2012ZYX407)；江蘇省高校自然科學研究面上資助項目(11KJB360005)

第一作者：熊英(1975-)，女，博士，副教授，碩士生導師，主要從事針灸推拿研究。