王　慧　許惠玉　官　杰　吳艷敏　譚佳音

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫教研室,黑龍江　齊齊哈爾　161006)

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真人養(yǎng)臟湯對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎大鼠腸黏膜sIgA、γδT細(xì)胞和超微結(jié)構(gòu)的影響

王慧許惠玉官杰吳艷敏譚佳音

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院免疫教研室,黑龍江齊齊哈爾161006)

〔摘要〕目的通過觀察真人養(yǎng)臟湯(ZRYZ)對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎(UC)模型大鼠腸黏膜分泌性免疫球蛋白(sIg)A、γδT細(xì)胞百分率和電鏡超微結(jié)構(gòu)的影響，探討其對(duì)UC模型大鼠腸黏膜的修復(fù)作用。方法采用TNBS/乙醇灌腸法復(fù)制UC模型大鼠，肉眼觀察評(píng)價(jià)結(jié)腸組織形態(tài)；ELISA法檢測(cè)結(jié)腸黏膜sIgA水平變化；流式細(xì)胞術(shù)測(cè)γδT細(xì)胞百分率；透射電鏡觀察結(jié)腸黏膜超微結(jié)構(gòu)改變。結(jié)果肉眼可見模型組大鼠結(jié)腸組織黏膜層出現(xiàn)炎癥及潰瘍；電鏡下見結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞微絨毛消失，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體明顯腫脹；結(jié)腸組織sIgA含量、γδT細(xì)胞百分率均顯著降低，與空白組比較有顯著差異(P<0.05或 P<0.01)；各治療組大鼠結(jié)腸黏膜損傷情況均有改善，電鏡下見結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞有較多粗短微絨毛，未見內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張及線粒體腫脹；sIgA含量、γδT細(xì)胞百分率均較模型組顯著升高(P<0.01)。結(jié)論真人養(yǎng)臟湯通過影響腸黏膜sIgA合成、γδT細(xì)胞表達(dá)，減輕UC模型大鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞病變，對(duì)UC模型大鼠腸黏膜免疫屏障具有一定的修復(fù)作用。

〔關(guān)鍵詞〕潰瘍性結(jié)腸炎；分泌性免疫球蛋白A；γδT細(xì)胞；超微結(jié)構(gòu)；真人養(yǎng)臟湯

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種慢性非特異性結(jié)腸疾病，是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的難治病之一，近年在我國(guó)發(fā)病率呈明顯上升,其病因復(fù)雜，涉及免疫、遺傳、環(huán)境、感染等因素，該病臨床上表現(xiàn)為腹瀉,黏液，膿血便,腹痛及里急后重,其病理特點(diǎn)為結(jié)腸黏膜的慢性炎癥和潰瘍形成。因此改善結(jié)腸黏膜炎癥，促進(jìn)黏膜修復(fù)是治療的關(guān)鍵〔1〕。真人養(yǎng)臟湯(ZRYZ)出自宋代《太平惠民和劑局方》,能夠溫補(bǔ)脾腎、澀腸固脫。本實(shí)驗(yàn)通過觀察ZRYZ對(duì)UC模型大鼠腸黏膜分泌性免疫球蛋白(sIg)A含量、γδT細(xì)胞百分率和電鏡超微結(jié)構(gòu)改變，探討其對(duì)UC模型大鼠腸黏膜免疫屏障的修復(fù)作用。

1材料與方法

1.1動(dòng)物清潔級(jí)雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量(220±20)g，購(gòu)于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)中心，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(黑)2013-001。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物與試劑ZRYZ：組方在古文獻(xiàn)記載基礎(chǔ)上略改動(dòng)藥物組成：人參、當(dāng)歸、炒白術(shù)、肉豆蔻、肉桂、炙干草、白芍、木香、訶子。藥材由齊齊哈爾市中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，水煎濃縮至生藥量2 g/ml，高壓滅菌后冰箱保存?zhèn)溆茫涣沁拎つc溶片(SASP)上海信誼天平藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H31020557，使用前用蒸餾水配制成0.05 g/ml；5%2，4，6-三硝基苯磺酸(TNBS)，Sigma公司，貨號(hào)：P2297；sIgA試劑盒(CUSABIO公司，批號(hào)：CSB-E08412r)；γδT-PE抗體(美國(guó)eBioscience公司)。

1.3儀器電熱恒溫水浴箱(中國(guó)上海醫(yī)療器械五廠)；Safire2型多功能全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(瑞士Tecan)；石蠟包埋機(jī)(中國(guó)湖北歐美萊醫(yī)療科技有限責(zé)任公司)；手動(dòng)旋轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(德國(guó)Slfe)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)BECTON DICKINSON)；高速低溫冷凍離心機(jī)(德國(guó) Eppendorf)；透射式電子顯微鏡(日本日立HITACHI)；超薄切片機(jī)(瑞典 LKB)。

1.4方法

1.4.1造模方法隨機(jī)抽取15只大鼠，設(shè)為空白組，其余大鼠進(jìn)行造模。采用TNBS/乙醇溶液灌腸法制作UC大鼠模型：將大鼠禁食(不禁水)24 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉(0.25 ml/100 g)后，一次性將TNBS/乙醇溶液(100 mg/kg TNBS+50%的乙醇0.25 ml)溶液用改良的大鼠灌胃針輕緩注入大鼠距肛門約7～8 cm深的腸腔內(nèi)，注射完畢用手捏住肛門停留數(shù)分鐘，防止溶液外漏，讓動(dòng)物保持下腹部上傾狀態(tài)，注意保暖，自然清醒?？瞻捉M15只大鼠也采用同樣方法用等量的0.9%生理鹽水溶液灌腸。

1.4.2分組與給藥12 h后觀察造模動(dòng)物，約85%大鼠出現(xiàn)稀便和血便。3 d后，隨機(jī)處死5只動(dòng)物，取距肛門約7～8 cm處結(jié)腸，肉眼可見潰瘍面，表明造模成功。造模動(dòng)物隨機(jī)分成模型組、SASP、ZRYZ低、中、高劑量組共5組，每組均14只大鼠。ZRYZ低、中、高劑量組分別按生藥7.6、15.2及30.4 g/kg劑量灌胃(按照臨床成人用量的5、10及20倍折算)，SASP組按0.5 g/kg劑量灌胃(按照臨床成人用量的10倍折算)，空白組、模型組灌服等體積0.9%生理鹽水溶液。各組于造模后第3天開始灌胃，1次/d，連續(xù)21 d。

1.4.3標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè)

1.4.3.1腸組織病理學(xué)觀察末次給藥后禁食不禁水24 h，處死大鼠，取距肛門大約8 cm結(jié)腸，沿縱軸剪開，用冰生理鹽水清洗干凈，肉眼觀察結(jié)腸大體形態(tài)、結(jié)腸黏膜損傷情況，大體形態(tài)損傷評(píng)分參照Luketal標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行：0分：無損傷；1分：充血但沒有潰瘍；2分：充血而且腸壁變厚但沒有潰瘍；3分：有一處小潰瘍，直徑約0~1 cm；4分：潰瘍較大，直徑約1~2 cm，但腸管與外周臟器無粘連；5分：潰瘍直徑1~2 cm，腸管增厚，與周圍臟器粘連嚴(yán)重〔2〕。

1.4.3.2結(jié)腸組織黏膜中sIgA含量取病變結(jié)腸下段，大約距肛門4 cm，用PBS洗去血污，在4℃生理鹽水中將腸組織翻轉(zhuǎn)，洗凈，刮取腸內(nèi)膜組織。稱取100 mg所取組織，剪成小塊加入1 ml PBS 進(jìn)行組織勻漿，然后置于-20℃過夜后，ELISA法測(cè)定組織中sIgA含量。

1.4.3.3結(jié)腸組織中γδT細(xì)胞檢測(cè)載玻片刮取病變腸內(nèi)組織，300目銅網(wǎng)過濾，制成腸組織細(xì)胞懸液，離心，取1×106細(xì)胞。FACS420流式細(xì)胞儀上進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.3.4結(jié)腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察取2～3塊大小為1 mm×1 mm×1 mm組織固定后，超薄切片進(jìn)行透射電鏡觀察結(jié)腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。電鏡樣品的制作和觀察由齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院超微病理實(shí)驗(yàn)中心完成。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0軟件行單因素方差分析。

2結(jié)果

2.1一般狀態(tài)模型組及各治療組大鼠均出現(xiàn)稀便，肛周污濁，體毛晦暗無光澤，飲食飲水量均減少，喜歡聚群。部分大鼠有肉眼可見膿血便，體質(zhì)量下降明顯。給藥10 d后各治療組狀體均有改善，其中ZRYZ中、低劑量組、SASP組明顯好轉(zhuǎn)，大部分大鼠稀便和膿血便癥狀消失，糞便呈顆粒狀，毛色潤(rùn)澤光亮，食量和飲水量正常，不再聚群，活躍度高，體質(zhì)量增長(zhǎng)明顯。

2.2結(jié)腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察空白組大鼠結(jié)腸黏膜上皮表面的微絨毛結(jié)構(gòu)完整,上皮細(xì)胞連接緊密，細(xì)胞間隙無明顯異常改變。模型組大鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞微絨毛脫落，細(xì)胞間隙增寬，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，線粒體腫脹，部分細(xì)胞質(zhì)溶解，并可見凋亡現(xiàn)象。ZRYZ高劑量組細(xì)胞微絨毛排列欠整齊，細(xì)胞間隙增寬程度有所減輕，腺上皮細(xì)胞間連接較緊密。ZRYZ中劑量組和低劑量組大鼠結(jié)腸黏膜上皮細(xì)胞有較多的粗短微絨毛，排列整齊，大小一致，細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞間隙增寬程度明顯減輕，腺上皮間相互連接緊密，未見擴(kuò)張的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及腫脹的線粒體。SASP組大鼠結(jié)腸黏膜上皮表面的微絨毛排列整齊，稀疏，但無脫落，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及線粒體未見明顯病理形態(tài)學(xué)改變，見圖1。

圖1　各組大鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察(×13 000)

2.3結(jié)腸黏膜損傷情況模型組大鼠結(jié)腸黏膜可見明顯充血、水腫、潰瘍、腸道縮短，部分還出現(xiàn)壞死及粘連，與空白組比較具有顯著性差異(P<0.05)。ZRZY中劑量組、低劑量組、SASP組及ZRZY高劑量組大鼠結(jié)腸黏膜僅有少量的充血水腫，與模型組比較有顯著差異(P<0.01或P<0.05)。見表1。

2.4結(jié)腸組織黏膜中sIgA含量變化模型組大鼠結(jié)腸組織黏膜中sIgA含量顯著下降，與空白組比較具有顯著差異(P<0.01)；ZRZY各組和SASP組大鼠結(jié)腸組織黏膜中sIgA含量顯著下降，與空白組比較具有顯著差異(P<0.01或P<0.05)。見表1。

2.5結(jié)腸組織中γδT細(xì)胞水平變化模型組大鼠結(jié)腸組織中γδT細(xì)胞百分率顯著下降，與空白組比較，具有顯著差異(P<0.01)；ZRZY各組和SASP組大鼠結(jié)腸組織中γδT細(xì)胞百分率顯著下降，與空白組比較，具有顯著差異(P<0.01)。 見表1。

表1　ZRYZ對(duì)UC模型大鼠結(jié)腸黏膜損傷評(píng)分及

與空白組比較：1)P<0.05，2)P<0.01；與模型組比較：3)P<0.05，4)P<0.01；與SASP組比較：5)P<0.05，6)P<0.01

3討論

腸道免疫屏障由腸上皮細(xì)胞、腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、固有層淋巴細(xì)胞、派伊氏結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)等腸道組織及腸道漿細(xì)胞sIgA構(gòu)成〔3〕。生理情況下，機(jī)體可通過腸黏膜屏障來有效地阻止致病微生物和毒素的侵入，以保證機(jī)體處于健康狀態(tài)〔4〕。當(dāng)腸黏膜屏障損傷時(shí)，腸道中的微生物和毒素便可突破腸黏膜屏障，進(jìn)入門靜脈和淋巴系統(tǒng)引起細(xì)菌移位，發(fā)展為UC。原發(fā)性和繼發(fā)性結(jié)腸損害，都會(huì)損傷黏膜及其功能。

sIgA是免疫球蛋白(Ig)A單體通過J鏈連結(jié)而成的二聚體，主要由腸黏膜固有層漿細(xì)胞產(chǎn)生。sIgA主要在黏膜局部免疫當(dāng)中發(fā)揮重要作用，進(jìn)入腸道能選擇性地包被革蘭陰性菌，形成抗原抗體復(fù)合物，阻礙細(xì)菌與上皮細(xì)胞受體相結(jié)合，刺激腸道黏液分泌并加速黏液層的流動(dòng)，有效地阻止細(xì)菌對(duì)腸黏膜的黏附，并且其在穿胞過程中對(duì)于已潛入細(xì)胞內(nèi)的病毒同樣具有中和作用〔5〕。創(chuàng)傷后，腸道產(chǎn)生sIgA的功能明顯受到抑制，主要表現(xiàn)為sIgA含量減少，合成sIgA的漿細(xì)胞數(shù)量減少及被sIgA包被的革蘭陰性菌數(shù)量減少，腸道抗定植力下降，促進(jìn)腸內(nèi)細(xì)菌移位〔6〕。

γδT細(xì)胞在正常人外周血所占比例甚少，但在表皮及腸黏膜上皮組織中大量存在〔7〕。研究表明〔8，9〕，γδT細(xì)胞能夠通過調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，在機(jī)體抗感染、抗腫瘤、自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。它主要分布于皮膚、黏膜上皮等部位，當(dāng)有病原微生物入侵時(shí)迅速活化和增殖，因此常作為機(jī)體抵抗外界病原菌的第一道防線。在黏膜免疫應(yīng)答中，γδT細(xì)胞通過分泌IL-2和IL-6等細(xì)胞因子促進(jìn)黏膜局部淋巴組織中的B細(xì)胞活化、增殖，分泌大量抗原特異的sIgA，增強(qiáng)黏膜免疫，阻止病原菌的進(jìn)一步入侵。UC中結(jié)腸黏膜受損，導(dǎo)致γδT細(xì)胞缺失，腸道內(nèi)環(huán)境破壞。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明ZRYZ可能通過升高結(jié)腸黏膜sIgA含量和增加結(jié)腸組織γδT百分率，從而提升黏膜局部免疫功能，恢復(fù)結(jié)腸黏膜的免疫屏障功能，達(dá)到治療目的。

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〔2015-10-11修回〕

(編輯苑云杰/曹夢(mèng)園)

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〔中圖分類號(hào)〕R285.5

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)07-1565-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.013

基金項(xiàng)目：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(No.12531798)

第一作者：王慧(1978-)，女，碩士，講師，主要從事中醫(yī)藥治療炎癥性疾病的機(jī)制研究。