梁金龍，謝　銘，楊雪峰，李建國，鄭興斌

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州 遵義　563000)

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斑蝥素、斑蝥酸鈉和斑蝥酸鎂抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的研究

梁金龍，謝銘，楊雪峰，李建國，鄭興斌

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州 遵義563000)

摘要:目的比較斑蝥素、斑蝥素酸鈉和斑蝥素酸鎂對人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖的影響，篩選出最佳斑蝥素類抗腫瘤藥物。方法將斑蝥素、 斑蝥素酸鈉及斑蝥素酸鎂作用于人胃癌細(xì)胞SGC-7901；采用CCK-8法檢測上述三種藥物對SGC-7901細(xì)胞的生長抑制率。結(jié)果斑蝥素、斑蝥素酸鈉和斑蝥素酸鎂均對SGC-7901細(xì)胞有抑制作用，且呈效應(yīng)-劑量關(guān)系。上述三種藥物的半數(shù)抑制濃度分別為18.591、17.676、4.105 μmol·L(-1)。結(jié)論斑蝥素、斑蝥素酸鈉和斑蝥素酸鎂均能抑制人胃癌細(xì)胞生長，其中斑蝥素酸鎂的抗腫瘤活性最佳。

關(guān)鍵詞:斑蝥素；斑蝥素酸鈉；斑蝥素酸鎂；SGC-7901細(xì)胞；增殖抑制率

斑蝥素是從斑蝥中提取出來并具有較強(qiáng)抗腫瘤活性的中藥，但因毒副作用明顯[1]，從而限制了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。隨著人們對斑蝥素研究的不斷深入，多種斑蝥素類衍生物也相繼合成，如斑蝥素酸鈉、斑蝥素酸鎂、斑蝥素酸鈣及去甲斑蝥素等。近年來，許多文獻(xiàn)都報(bào)道了關(guān)于斑蝥素和斑蝥素衍生物作用于腫瘤細(xì)胞的研究，結(jié)果顯示它們的抗癌效果確切[2-4]，而關(guān)于斑蝥素酸鎂作用胃癌的研究卻少有報(bào)道。因此，我們設(shè)計(jì)了該實(shí)驗(yàn)，期望通過對斑蝥素、斑蝥素酸鈉和斑蝥素酸鎂的體外抗腫瘤活性的比較，篩選出抗腫瘤活性最佳的斑蝥素類衍生藥物?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1材料與儀器

1.1材料人胃癌細(xì)胞SGC-7901由遵義醫(yī)學(xué)院消化內(nèi)科惠贈(zèng)。斑蝥素、斑蝥素酸鈉及斑蝥素酸鎂由遵義醫(yī)學(xué)院寄生蟲教研室合成。胎牛血清、CCK-8試劑均購自TRANSGen BIOTECH公司。

1.2儀器美國 Thermo 公司產(chǎn)Multiskanspectrum 酶標(biāo)儀；上海睿鈺生物有限公司產(chǎn)Count start自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)及種板將細(xì)胞培養(yǎng)于含12%新生胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中。取對數(shù)生長期細(xì)胞,加入0.25%胰蛋白酶消化,加入含血清培養(yǎng)液， 吹打制成單細(xì)胞懸液。自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀計(jì)數(shù)懸浮細(xì)胞密度，加入適量含血清培養(yǎng)液，配成密度為8×107·L-1細(xì)胞懸液，接種于96 孔平板,每孔100 μL。放入孵箱過夜。

2.2分組斑蝥素組設(shè)為：溶劑對照組、實(shí)驗(yàn)對照組、5.1、10.20、20.40、40.80 μmol·L-1；斑蝥素酸鈉組：實(shí)驗(yàn)對照組、4.375、8.75、17.5、35.00 μmol·L-1；斑蝥素酸鎂組：實(shí)驗(yàn)對照組、1.04、2.08、4.17、8.34 μmol·L-1；另設(shè)空白對照組。

2.3加藥用含血清培養(yǎng)液將斑蝥素(10%丙酮溶解)、斑蝥素酸鈉和斑蝥素酸鎂分別稀釋為上述濃度，依次從低到高濃度全量置換，每個(gè)濃度復(fù)種3孔。其中，溶劑對照組加入含0.4%丙酮溶液(用含血清培養(yǎng)液稀釋)?？瞻捉M為含血清培養(yǎng)液(無細(xì)胞)。加藥完畢，繼續(xù)置于孵箱培養(yǎng)24 h。

2.4CCK-8檢測法取出平板，按說明書操作，加入CCK-8試劑，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1～2 h后， 酶標(biāo)儀檢測吸光光度值(OD值)，波長450 nm。

用回歸曲線求50%細(xì)胞抑制率時(shí)的藥物濃度(IC50) 。抑制率的計(jì)算公式為:

抑制率(%) =[1-(藥物組OD值-空白組OD值)/(對照組OD值-空白組OD值)]×100%

3結(jié)果

3.1斑蝥素對人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖抑制作用斑蝥素對人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖抑制作用見表1。斑蝥素濃度在5.10～40.80 μmol·L-1時(shí)， 與細(xì)胞增殖抑制率成正相關(guān)。表1中示：溶劑對照組與實(shí)驗(yàn)對照組相比較，P>0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即溶解在實(shí)驗(yàn)濃度斑蝥素中的丙酮對細(xì)胞增殖無影響；當(dāng)斑蝥素濃度為40.80 μmol·L-1時(shí)，最大抑制率為67.78%；當(dāng)斑蝥素濃度為10.20和20.40 μmol·L-1時(shí)，抑制率分別為34.12%和55.41%，抑制中濃度應(yīng)在10.20～20.40 μmol·L-1之間。以藥物濃度為橫坐標(biāo)、 抑制率為縱坐標(biāo)作對數(shù)曲線， 得回歸方程Y=1.338Ln(X)+18.294，r=0.907。經(jīng)計(jì)算， 得半數(shù)抑制濃度(IC50)為18.591 μmol·L-1。

處理組斑蝥素濃度/μmol·L-1OD抑制率/%空白對照組00.1075±0.009—溶劑對照組01.0358±0.104—實(shí)驗(yàn)對照組01.0789±0.268—T1組5.100.9541±0.17814.01T2組10.200.7544±0.16134.12T3組20.400.5739±0.09355.41T4組40.800.4473±0.08467.78

注：空白對照組：僅含培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)對照：有細(xì)胞但無斑蝥素處理；溶劑對照組:含0.4%丙酮溶液；T1～T4：不同濃度斑蝥素處理組。

3.2斑蝥素對人胃癌SGC-7901細(xì)胞形態(tài)的影響斑蝥素對人胃癌SGC-7901細(xì)胞形態(tài)的影響見圖1。圖1中a為斑蝥素組中溶劑對照，b為斑蝥素組實(shí)驗(yàn)對照， a與b相比，細(xì)胞形態(tài)未見明顯變化，以活細(xì)胞為主；而從c中可以看出，斑蝥素作用后的細(xì)胞密度減小，形態(tài)明顯改變，皺縮、變圓變亮，細(xì)胞幾乎全死亡。

3.3斑蝥素酸鈉對人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖抑制作用斑蝥素酸鈉對人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖抑制作用見表2。斑蝥素酸鈉濃度在4.375～35.00 μmol·L-1時(shí)， 對腫瘤細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出明顯抑制作用， 且隨著濃度增加而增強(qiáng)。當(dāng)濃度為17.5和35 μmol·L-1時(shí)，OD450值差異不顯著，最大抑制率為62.57%；當(dāng)濃度為8.75和17.5 μmol·L-1時(shí)，癌細(xì)胞生長明顯被抑制，抑制率分別為38.37%和53.03%，抑制中濃度應(yīng)在8.75～17.5 μmol·L-1之間。以藥物濃度為橫坐標(biāo)、抑制率為縱坐標(biāo)作對數(shù)曲線，得回歸方程Y=1.297Ln(X)+21.308，r=0.892。經(jīng)計(jì)算， 得半數(shù)抑制濃度(IC50)為17.676 μmol·L-1。

圖1　斑蝥素對人胃癌細(xì)胞SGC-7901

注：a：溶劑對照組;b：實(shí)驗(yàn)對照組;c：斑蝥素處理組。

±s)

注：空白對照組：僅含培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)對照：有細(xì)胞但無斑蝥素鈉處理；T1～T4：不同濃度度斑蝥素酸鈉處理組。

3.4斑蝥酸鈉對人胃癌SGC-7901細(xì)胞形態(tài)的影響斑蝥酸鈉對人胃癌SGC-7901細(xì)胞形態(tài)的影響見圖2。圖2中a為斑蝥酸鈉組實(shí)驗(yàn)對照，b為斑蝥酸鈉藥物組； a與b進(jìn)行對比，可見斑蝥酸鈉作用后的細(xì)胞密度明顯小于對照組；細(xì)胞形態(tài)明顯改變，皺縮、變圓變亮，細(xì)胞幾乎全死亡。

圖2　斑蝥素鈉對人胃癌SGC-7901細(xì)胞形態(tài)的

注：a：實(shí)驗(yàn)對照組;b：斑蝥素鈉處理組。

3.5斑蝥素酸鎂對人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖

抑制作用斑蝥素酸鎂對人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖抑制作用見表3。斑蝥素酸鎂濃度在1.04～8.34 μmol·L-1時(shí)， 對人胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖表現(xiàn)出顯著抑制。當(dāng)濃度為1.04 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞增殖抑制率已達(dá)30.03%；當(dāng)濃度為1.04和2.08 μmo·L-1時(shí)，OD450值差異不明顯；當(dāng)濃度為4.17 μmol·L-1和8.35 μmol·L-1時(shí)OD450值差異不顯著，最大抑制率為60.09%；當(dāng)濃度為2.08 和4.17 μmol·L-1時(shí)，抑制率分別為38.37%和52.01%，因此可知，斑蝥素酸鎂的抑制中濃度應(yīng)在2.08～4.17 μmol·L-1之間。以藥物濃度為橫坐標(biāo)、 抑制率為縱坐標(biāo)作對數(shù)曲線， 得回歸方程Y=3.957Ln(X)+29.664，r=0.948。經(jīng)計(jì)算， 得半數(shù)抑制濃度(IC50)為4.105 μmol·L-1。

±s)

注：空白對照組：僅含培養(yǎng)液；實(shí)驗(yàn)對照：有細(xì)胞但無斑蝥素鎂處理；T1～T4：不同濃度斑蝥素酸鎂處理組。

3.6斑蝥酸鎂對人胃癌SGC-7901細(xì)胞形態(tài)的影響斑蝥酸鎂對人胃癌SGC-7901細(xì)胞形態(tài)的影響見圖3。圖3中a為斑蝥酸鎂組實(shí)驗(yàn)對照，b為斑蝥酸鎂藥物組。a與b進(jìn)行對比，可見斑蝥酸鎂作用后的細(xì)胞變得稀疏、分離；形態(tài)明顯改變，皺縮、變圓變亮，細(xì)胞幾乎全死亡。

4討論

胃癌是消化道常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率高，嚴(yán)重威脅著人類健康[5]。近年來，關(guān)于斑蝥素及其衍生物作用于胃癌細(xì)胞的研究大量開展，在李曉飛等[6]的研究中顯示：斑蝥素類衍生物與斑蝥素相比較，前者具有更好的抗腫瘤活性，且毒性大大降低。此外，斑蝥素鹽類藥物易溶于水[7-8]，使機(jī)體更容易吸收。目前，市場上銷售的斑蝥素類藥物種類繁多，如斑蝥素酸鈣、斑蝥酸酸鉀和去甲斑蝥素等。斑蝥素及斑蝥素衍生物可能是通過以下幾種機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)：(1)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡：通過上調(diào)或下調(diào)某些與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的基因如Bax、Bcl-2的表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞增殖的調(diào)控[3]。(2)影響細(xì)胞增殖周期：干預(yù)細(xì)胞有絲分裂的過程，將細(xì)胞阻滯于分裂的不同時(shí)期，從而影響細(xì)胞的增殖。Li等[9]發(fā)現(xiàn)斑蝥素能下調(diào)胰腺癌細(xì)胞內(nèi)CDK1的表達(dá)，增強(qiáng)CDK抑制因子P21的表達(dá)， 從而使胰腺癌細(xì)胞阻滯于G2/M期；在鄭喬丹等[10]的研究中也表明，斑蝥素可通過上調(diào)p21 表達(dá)而抑制 CDK1的活性，從而導(dǎo)致細(xì)胞G2/M期阻滯。斑蝥素酸鎂能將人胃癌SGC-7901細(xì)胞明顯阻滯于S期。(3)抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移：斑蝥素通過下調(diào)細(xì)胞NF-κB(P65)、NF-κB(P65) mRNA、Caspase-3、Smad3的表達(dá)和FAK 酪氨酸磷酸化水平，抑制蛋白的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[11]。(4)抑制腫瘤血管生成Zhang等[12]研究發(fā)現(xiàn)去甲斑蝥素通過抑制VEGFR2/MEK/ERK信號(hào)通路激活， 削弱了VEGF的作用， 減少了腫瘤血管生成。(5)抑制淋巴管的生成，從而影響腫瘤細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移。正是斑蝥素類衍生藥物具有較強(qiáng)的抗腫瘤細(xì)胞增殖的作用，抗癌效果明顯，且與斑蝥素相比，具有高效、低毒的優(yōu)勢，使其在臨床上得以廣泛應(yīng)用。

圖3　斑蝥素鎂對人胃癌SGC-7901細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響(20×10)

注:a：實(shí)驗(yàn)對照組；b：斑蝥素鎂處理組。

本文比較了斑蝥素、斑蝥素酸鈉和斑蝥素酸鎂對人胃癌細(xì)胞SGC-7901增殖的影響,研究結(jié)果顯示:斑蝥素、斑蝥素酸鈉和斑蝥素酸鎂均能抑制癌細(xì)胞生長，其中斑蝥素IC50為18.591 μmol·L-1；斑蝥素酸鈉IC50為17.676 μmol·L-1；斑蝥素酸鎂IC50為4.105 μmol·L-1。三種藥物均能有效的抑制人胃癌細(xì)胞SGC-7901的增殖，且抑制作用呈效應(yīng)—?jiǎng)┝筷P(guān)系，與其他文獻(xiàn)報(bào)道相符[13]。其中， 斑蝥素酸鎂抑制中濃度(IC50)最小，斑蝥素酸鈉次之。結(jié)果表明了人胃癌細(xì)胞SGC-7901對斑蝥素酸鎂較敏感，斑蝥素酸鈉次之，斑蝥素最差。提示斑蝥素酸鎂治療胃癌的效果可能優(yōu)于斑蝥素和斑蝥素酸鈉。此外，實(shí)驗(yàn)結(jié)果中還顯示：當(dāng)濃度為17.5 和35 μmol·L-1時(shí)，OD450值差異不顯著；當(dāng)濃度為4.17和8.35 μmol·L-1時(shí)OD450值差異不顯著。而在張恒等[14]的研究中也存在類似現(xiàn)象。或許可以推測斑蝥素衍生物作用腫瘤細(xì)胞時(shí)，其抑制率達(dá)到一定程度后不再隨著濃度的增加而顯著改變。這就需要我們開展更多的實(shí)驗(yàn)，增加濃度梯度來證實(shí)這一猜想，為探索斑蝥素類藥物的安全有效濃度提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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Research on Cantharidin,Sodium cantharidinate and magnesium cantharidate Inhibition of proliferation of human gastric cancer cell SGC-7901

LIANG Jin-long，XIE Ming，YANG Xue-feng，et al

(DepartmentofGastrointestinalSurgery,AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege,Zunyi563000，China)

Abstract:ObjectiveTo compare the inhibitory effects of cantharidin,cantharidin sodium and cantharidin magnesium on human gastric cancer cell ( SGC-7901) proliferation,and to screen out the most efficacious cantharidin antineoplastic drug.MethodsTo detect the inhibitory rate of the proliferation of SGC-7901 cells of cantharidin,cantharidin sodium and cantharidin magnesium by CCK-8 assay after the three drugs were applied to these cells.ResultsCantharidin,cantharidin sodium and cantharidin magnesium have inhibitory effect on SGC-7901 cells,and showed a dose-response relationship. The median inhibitory concentrations of these three drugs were 18.591,17.676,4.105 μmol·L(-1) respectively.ConclusionCantharidin,cantharidin sodium and cantharidin magnesium can inhibit human gastric cancer SGC-7901 cell growth,and the antitumor activity of cantharidin magnesium ranks the best.

Key words：cantharidin;cantharidin sodium;cantharidin magnesium;SGC-7901 cells;proliferation inhibitory rate

(收稿日期：2015-10-12，修回日期：2015-12-06)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.09

作者簡介：梁金龍，男，碩士研究生通信作者： 謝銘，女，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：消化道腫瘤，E-mail： 617720897@qq.com

基金項(xiàng)目：貴州省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目(No QZYY-2014-005)