暴云鋒，王晶晶，諸葛銘寧，張洪珍*(.河北省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，河北 石家莊 05005；.河北省人民醫(yī)院腫瘤五科，河北 石家莊 05005；.河北省人民醫(yī)院急診科，河北 石家莊 05005)

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·論著·

阿霉素對(duì)SD大鼠心肌纖維化的影響機(jī)制

暴云鋒1，王晶晶2，諸葛銘寧3，張洪珍2*(1.河北省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像科，河北 石家莊 050051；2.河北省人民醫(yī)院腫瘤五科，河北 石家莊 050051；3.河北省人民醫(yī)院急診科，河北 石家莊 050051)

[摘要]目的探討阿霉素對(duì)大鼠心肌纖維化的影響機(jī)制。方法尾靜脈注射阿霉素6周(3 mg/kg，每周1次)，觀察大鼠的一般情況及體質(zhì)量，于第7周檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)、羥脯氨酸含量及心肌組織形態(tài)學(xué)的變化。結(jié)果與正常對(duì)照組比較，阿霉素模型組心肌組織中的羥脯氨酸含量升高，組織病理學(xué)進(jìn)一步證實(shí)阿霉素對(duì)心肌纖維化的誘導(dǎo)作用，血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)顯示左心室舒張末期壓升高，左心室收縮壓、左心室壓最大上升速率及最大下降速率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論阿霉素可以誘導(dǎo)大鼠心肌纖維化，抑制心功能。

[關(guān)鍵詞]心內(nèi)膜心肌纖維化癥；阿霉素；大鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.03.002

阿霉素因其抗瘤譜廣、臨床療效高、對(duì)乏氧細(xì)胞同樣有效等顯著特點(diǎn),常作為一線抗癌藥物廣泛應(yīng)用于乳腺癌、肝癌、前列腺癌等實(shí)體瘤及血液系統(tǒng)惡性腫瘤的治療[1]。有研究證實(shí)阿霉素與心臟組織的高親和力可導(dǎo)致劑量依賴的不可逆轉(zhuǎn)的慢性心力衰竭、心臟重塑，限制了其臨床應(yīng)用[2]，但是具體機(jī)制尚不清楚。本研究通過尾靜脈注射阿霉素(3 mg/kg，每周1次，連續(xù)6周)建立心肌纖維化動(dòng)物模型，觀察阿霉素對(duì)心肌纖維化的影響并探討其可能的機(jī)制。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組雄性Sprague-Dawley大鼠(體質(zhì)量220～260 g)購自河北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，均在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境[晝夜循環(huán)，保持溫度(25±1) ℃、濕度(55±10)%]中自由攝取食水。隨機(jī)將大鼠分為模型組和正常對(duì)照組各8只。模型組大鼠給予尾靜脈注射阿霉素6周(3 mg/kg，每周1次)，正常對(duì)照組給予同等體積的生理鹽水。觀察大鼠的一般狀態(tài)，記錄體質(zhì)量及病死率。

1.2試劑及儀器鹽酸阿霉素為浙江海正藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；生化試劑盒購買于南京建成生物工程研究所；BL-410生物機(jī)能信號(hào)處理及分析系統(tǒng)為成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品。

1.3血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)于第7周終止模型制備，禁食水12 h后稱體質(zhì)量，腹腔注射25%烏拉坦(5 mg/kg)麻醉，大鼠置于仰臥位固定于手術(shù)操作臺(tái)上，常規(guī)進(jìn)行剪毛消毒，取頸部正中切口，暴露并鈍性分離右頸總動(dòng)脈，靜脈注射肝素液以進(jìn)行肝素化，將心導(dǎo)管逆行插入右頸總動(dòng)脈，順勢(shì)將其送至左心室，將導(dǎo)管的另一端連接至壓力傳感器上，與生理記錄儀(BL-410型，成都泰盟科技有限公司)相連接。當(dāng)屏幕顯示的波形圖由血壓波變成下沿達(dá)0 mmHg附近具有明顯舒張期而封頂平坦的波形時(shí)，表明導(dǎo)管已通過主動(dòng)脈瓣進(jìn)入左心室腔內(nèi)。平穩(wěn)5 min后，記錄左心室收縮壓、左心室壓最大上升速率、左心室壓最大下降速率和左心室舒張末期壓，用BL-410生物機(jī)能信號(hào)處理及分析系統(tǒng)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4計(jì)算心臟質(zhì)量指數(shù)血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè)完成后，剪開胸腔，迅速摘取心臟，用4 ℃冰冷生理鹽水沖洗，濾紙吸干，稱取全心質(zhì)量后，沿房室交界處減去心房和右心室，稱取左心室質(zhì)量，計(jì)算心臟質(zhì)量指數(shù)(全心質(zhì)量/體質(zhì)量)和左心室質(zhì)量指數(shù)(左心室質(zhì)量/體質(zhì)量)。

1.5膠原含量檢測(cè)羥脯氨酸是代表膠原含量的指標(biāo)，在氧化劑的作用下所產(chǎn)生的氧化產(chǎn)物與二甲氨基苯甲醛作用呈現(xiàn)紫紅色。取左心室心肌組織100 mg用堿水解法，按照試劑盒說明在550 nm波長(zhǎng)用分光光度法測(cè)定心肌組織羥脯氨酸含量，濃度用μg/mg(心肌組織質(zhì)量)表示。

1.6心肌損傷的病理學(xué)檢查心室樣本用10%多聚甲醛固定，逐級(jí)乙醇脫水，常規(guī)石蠟包埋，與縱軸垂直切取4 μ厚切片數(shù)張，行HE染色，用光學(xué)顯微鏡觀察心肌組織結(jié)構(gòu)的變化。

1.7心肌纖維化程度評(píng)估為了進(jìn)一步明確阿霉素對(duì)心肌間質(zhì)膠原沉積程度的影響，行Masson膠原纖維特異性染色。結(jié)果判定：膠原纖維呈藍(lán)色，細(xì)胞漿、肌纖維呈紅色，胞核呈藍(lán)色。

2結(jié)果

2.1阿霉素對(duì)大鼠一般情況的影響與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠消瘦、喜蜷縮、進(jìn)食水量減少。給藥結(jié)束時(shí)，大鼠死亡3只(病死率37.5%)。

2.2阿霉素對(duì)體質(zhì)量和心臟質(zhì)量指數(shù)的影響與正常對(duì)照組相比，模型組大鼠的體質(zhì)量及全心質(zhì)量降低，而心臟質(zhì)量指數(shù)及左心質(zhì)量指數(shù)較正常對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1阿霉素對(duì)體質(zhì)量和心臟質(zhì)量指數(shù)的影響

Table1Theeffectsofadriamycinoncardiac

massindexesinrats

組別體質(zhì)量(g)全心質(zhì)量(mg)心臟質(zhì)量指數(shù)(mg/g)左心室質(zhì)量指數(shù)(mg/g)正常對(duì)照組345.71±9.261023.30±0.082.81±0.072.01±0.06模型組 298.33±7.14838.31±0.022.96±0.072.12±0.03t 11.4616345.1054.2864.638P 0.0000.0000.0000.000

2.3阿霉素對(duì)心功能的影響與正常對(duì)照組相比，模型組左心室舒張末期壓升高，左心收縮壓、左心室壓最大上升速率和最大下降速率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2阿霉素對(duì)心功能的影響

Table 2The effects of adriamycin on

cardiac function in rats

組別左心室收縮壓(mmHg)左心室舒張末期壓(mmHg)左心室壓最大上升速率(mmHg/s)左心室壓最大下降速率(mmHg/s)正常對(duì)照組98.75±2.816.23±0.283674.13±54.41-2076.49±31.44模型組 64.71±3.6210.64±0.212711.32±78.33-3065.13±39.42t 21.01035.63828.55355.435P 0.0000.0000.0000.000

2.4阿霉素對(duì)膠原含量的影響與正常對(duì)照組相比，模型組羥脯氨酸含量明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

2.5阿霉素對(duì)心肌組織病理學(xué)的影響正常對(duì)照組心肌纖維排列整齊，間隙正常，胞漿豐富均勻，無心肌細(xì)胞壞死及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2A)；模型組正常結(jié)構(gòu)消失，心肌纖維變形腫脹，排列紊亂，橫紋消失，肌漿凝聚、溶解，胞漿呈不同程度空泡化，細(xì)胞外間隙較對(duì)照組明顯增寬，部分心肌組織可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖2B)。Masson膠原特異染色(正常心肌為紅色，纖維化區(qū)域?yàn)樗{(lán)色)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組(圖3A)相比，模型組膠原蓄積，纖維化范圍明顯增加(圖3B)。

圖1阿霉素對(duì)膠原含量的影響

*P<0.05與正常對(duì)照組比較(t檢驗(yàn))

Figure 1The effect of adriamycin on collagen content in rats

圖2阿霉素對(duì)心肌組織病理學(xué)的影響(HE染色×400)

A.正常對(duì)照組;B.阿霉素模型組

Figure 2The effects of adriamycin on histopathologic changes in myocardium(HE staining ×400)

圖3阿霉素對(duì)心肌纖維化程度的影響(Masson染色×400)

A.正常對(duì)照組； B.阿霉素模型組

Figure 3 The effect of adriamycin on extent of myocardial fibrosis in rats(Masson staining ×400)

3討論

阿霉素作為一種廣譜的蒽環(huán)類化療藥物已廣泛應(yīng)用于惡性腫瘤的臨床治療，但于用藥早期即可出現(xiàn)一過性的急性心肌損傷，包括心律失常、低血壓及各種心電圖改變等，心肌毒性隨劑量積累而增加，晚期表現(xiàn)為不可逆的慢性心力衰竭及心臟重塑[3]，病死率較高。因此，研究阿霉素的慢性心臟毒性機(jī)制，以便使阿霉素更好地發(fā)揮抗腫瘤作用，從而提高患者的生存率，是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問題。

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)體內(nèi)阿霉素累積劑量達(dá)到450～500 mg/m2時(shí)會(huì)導(dǎo)致心力衰竭，發(fā)生率30%左右；累積劑量達(dá)600 mg/m2時(shí)，心力衰竭發(fā)生率高達(dá)70%。而通過反復(fù)給藥，阿霉素誘導(dǎo)的大鼠慢性心力衰竭與臨床相似[4]。本研究采用尾靜脈注射阿霉素(3 mg/kg，每周1次，連續(xù)6周)模擬人類的臨床化療過程，發(fā)現(xiàn)阿霉素模型組大鼠的體質(zhì)量及心臟質(zhì)量下降，心質(zhì)量指數(shù)及左心室質(zhì)量指數(shù)升高，并出現(xiàn)較高的死亡發(fā)生率；HE染色顯示阿霉素使心肌正常結(jié)構(gòu)消失，心肌纖維變形腫脹，排列紊亂，橫紋消失，肌漿凝聚、溶解，胞漿呈不同程度空泡化，細(xì)胞外間隙增寬，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5]，進(jìn)一步證實(shí)給藥結(jié)束時(shí)已達(dá)到阿霉素的心臟毒性累積劑量，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致心源性猝死。王翠英等[6]發(fā)現(xiàn)阿霉素還可以誘導(dǎo)患者出現(xiàn)ST-T段改變，T波低平、倒置，QRS低電壓、QT間期延長(zhǎng)等心電圖改變，可能是由于阿霉素在體內(nèi)誘導(dǎo)氧自由基的產(chǎn)生，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，損傷了細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞膜電位發(fā)生改變[7]。心功能是反映心力衰竭程度最直接的指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)，阿霉素可導(dǎo)致心室功能障礙，從而誘導(dǎo)大鼠血漿腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)的合成[8]，而且心力衰竭患者的血漿脂褐素及BNP水平也與心功能級(jí)別呈線性相關(guān)[9]。本研究結(jié)果顯示，阿霉素模型組左心室舒張末期壓升高，左心室收縮壓和左心室壓最大上升速率降低。表明阿霉素使心臟收縮和舒張功能均明顯受損[10]。更有意義的是，本研究顯示阿霉素使心肌組織羥脯氨酸含量增加，膠原蓄積，出現(xiàn)嚴(yán)重的心肌纖維化。這是由于阿霉素誘導(dǎo)氧自由基等因素?fù)p傷心肌細(xì)胞導(dǎo)致慢性心力衰竭時(shí)，心肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，使膠原表達(dá)異常，從而觸發(fā)了心肌纖維化的進(jìn)程。本研究中阿霉素誘導(dǎo)的心功能改變與心肌組織病理學(xué)表現(xiàn)呈正相關(guān)，可能是由于心肌纖維化導(dǎo)致室壁僵硬度增加，順應(yīng)性降低，從而使心功能發(fā)生紊亂，這可能是阿霉素對(duì)心肌纖維化的影響機(jī)制之一。

綜上所述，應(yīng)用尾靜脈注射阿霉素(3 mg/kg，每周1次)連續(xù)6周，累計(jì)劑量達(dá)18 mg/kg，可造成心肌纖維化并抑制大鼠的心功能。因此，血流動(dòng)力學(xué)可作為阿霉素心肌損傷程度的指標(biāo)之一。盡管其具體機(jī)制尚未完全闡明，但本研究結(jié)果已經(jīng)為阿霉素心臟毒性的進(jìn)一步研究提供了理論與實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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(本文編輯：劉斯靜)

Effect of adriamycin on myocardial fibrosis and possible mechanisms in rats

BAO Yun-feng1, WANG Jing-jing2, ZHUGE Ming-ning3, ZHANG Hong-zhen2*

(1. Department of Radiology, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, China; 2.Department of Oncology Ⅴ, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, China; 3. Department of Emergency, Hebei General Hospital, Shijiazhuang 050051, China)

[Abstract]ObjectiveTo determine the effect of adriamycin on myocardial fibrosis and possible mechanisms in rats. MethodsA rat myocardial fibrotic model was induced by intravenous injection of adriamycin(3 mg/kg, once a week) for six weeks. During the test, general condition and body weight were observed. At the seventh week, hemodynamic parameters and hydroxyproline concentration as well as morphological transformation of heart tissues were detected. ResultsCompared to those in control group, hydroxyproline content was markedly increased in adriamycin induced rats. Histopathological examination further confirmed the same alteration. Moreover, hemodynamics showed a significant decline in left-ventricular systolic pressure, maximum and minimum rate of developed left ventricular pressure, accompanied by an increment of left ventricular end-diastolic pressure(P<0.05). ConclusionThese findings suggested that adriamycin could induce myocardial fibrosis and inhibit cardiac function.

[Key words]endomyocardial fibrosis; adriamycin; rats

[中圖分類號(hào)]R542.23

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1007-3205(2016)03-0252-04

*通訊作者

[作者簡(jiǎn)介]暴云鋒(1974-)，男，河北石家莊人，河北省人民醫(yī)院主管技師，醫(yī)學(xué)碩士，從事醫(yī)學(xué)影像診斷研究。

[收稿日期]2015-02-06；[修回日期]2015-02-27