劉 晉 鄧漢超 王學(xué)林 侯紅利 李永紅 楊啟鵬 陳惠芳 周向陽

（農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（深圳）/深圳市農(nóng)業(yè)科技促進(jìn)中心，廣東深圳518040）

轉(zhuǎn)基因水稻標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的構(gòu)建與分析

劉 晉 鄧漢超 王學(xué)林 侯紅利 李永紅 楊啟鵬 陳惠芳 周向陽

（農(nóng)業(yè)部農(nóng)作物種子質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（深圳）/深圳市農(nóng)業(yè)科技促進(jìn)中心，廣東深圳518040）

針對目前轉(zhuǎn)基因（GM）產(chǎn)品檢測標(biāo)準(zhǔn)分子的缺乏，構(gòu)建適用于轉(zhuǎn)基因水稻的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMDSPS和pMDTheli，其中包含水稻內(nèi)源基因SPS通用序列，耐鹽基因ThST3和Ubiquitin啟動(dòng)子序列的構(gòu)建特異性Theli序列。對其特異性及制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性進(jìn)行鑒定研究，研究結(jié)果顯示，在進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增時(shí)，采用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子為陽性對照，均能特異擴(kuò)增目的條帶。以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線，SPS基因的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)平均為0.9993，PCR擴(kuò)增效率在1.0004～1.034之間；ThST3基因的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)平均為0.9937，PCR擴(kuò)增效率在0.9358～0.9486之間。因此，構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)分子pMDSPS和pMDTheli既能作為普通PCR的陽性對照，也能用于定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建，為轉(zhuǎn)基因水稻的定量檢測提供簡便、價(jià)格低廉的標(biāo)準(zhǔn)分子打下基礎(chǔ)。

標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子；實(shí)時(shí)熒光PCR；標(biāo)準(zhǔn)曲線；PCR效率

隨著轉(zhuǎn)基因（GM，genetically modified）技術(shù)的不斷發(fā)展，產(chǎn)生（獲得）更多優(yōu)良的作物品種有望在解決全球糧食危機(jī)方面作出貢獻(xiàn)，然而轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的出現(xiàn)也引發(fā)公眾對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品影響食品安全與環(huán)境安全的擔(dān)憂。因此，世界各國政府和組織都非常重視轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品的食用安全的監(jiān)管，紛紛建立轉(zhuǎn)基因標(biāo)識(shí)的制度。檢測技術(shù)的發(fā)展為轉(zhuǎn)基因作物及產(chǎn)品的監(jiān)管提供了重要的技術(shù)保障，基于核酸的檢測方法是目前轉(zhuǎn)基因檢測最為常用的檢測方法。無論是基于核酸還是蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因檢測方法，都需要陽性對照物質(zhì)。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)既可以作為陽性對照，也可以用來繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線用于定量分析。然而目前我國使用的大部分標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)都是購買國外的產(chǎn)品，這些產(chǎn)品價(jià)格貴、針對轉(zhuǎn)基因的品種少、貨期長等，顯然難以滿足我國對不斷增加的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品監(jiān)督檢測的需求[1-2]。

質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子（plasmid standard molecule），是在質(zhì)粒中重新組裝目標(biāo)基因或片段的分子。一般整合轉(zhuǎn)基因的目標(biāo)基因、序列（包括內(nèi)源基因、外源基因、篩選基因、構(gòu)建特異片段、品系特異片段等）。由于構(gòu)建質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的生產(chǎn)成本低、操作簡便、技術(shù)成熟等特點(diǎn)，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子已經(jīng)公認(rèn)成為一種解決轉(zhuǎn)基因檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)缺乏的有效方法[3-4]。這種方法已經(jīng)大量地應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因及其產(chǎn)品的定量檢測之中。本研究旨在構(gòu)建適用于轉(zhuǎn)基因水稻檢測的標(biāo)準(zhǔn)分子，并對其在特異性及制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性進(jìn)行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料轉(zhuǎn)基因材料 轉(zhuǎn)Theli基因水稻，非轉(zhuǎn)基因水稻。

試劑 質(zhì)粒DNA提取溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ；pMD-T載體連接試劑盒購自TaKaRa公司，TaKaRa Premix PCR試劑盒，100mg/mL氨芐青霉素、IPTG和X-Gal為大連寶生物公司產(chǎn)品，DH5α大腸桿菌為全式金產(chǎn)品，Qiagen Dneasy Plant Mini Kit DNA提取試劑盒，PCR產(chǎn)物純化試劑盒為上海生工產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取使用試劑盒Qiagen Dneasy Plant Mini Kit提取植物DNA，采用Neno1000檢測DNA的濃度和純度，將DNA稀釋到10～50ng/μ L，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物和探針設(shè)計(jì)轉(zhuǎn)Theli基因水稻的特異性引物（耐鹽基因ThST3和Ubiquitin啟動(dòng)子序列），內(nèi)源基因SPS引物使用L.X.Jiang等[5]引物。利用Primer5軟件設(shè)計(jì)目標(biāo)基因的引物和探針。設(shè)計(jì)的引物和探針由生工合成，詳見表1。

表1 普通PCR及定量PCR所用引物和探針序列

1.2.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的構(gòu)建普通PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因片段 PCR擴(kuò)增體系中Primex Ex Taq 10μL，F(xiàn)引物（10μmol/L）0.4μL，R引物（10μmol/L）0.4μL，DNA（10～50ng/μL）2μL，補(bǔ)充ddH2O至總體積20μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2 min；40個(gè)循環(huán)（95℃ 30s，58℃30s，72℃ 40s）；72℃延伸 2min；20℃10min。PCR產(chǎn)物電泳后采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒說明書進(jìn)行回收。

連接 使用pMD-T克隆載體進(jìn)行連接，1μL的10×T4 DNA Ligase Buffer，2μL的pMD-T載體，0.5μL的50μg/mL DNA，0.4μL的 T4 DNA Ligase，補(bǔ)充ddH2O至總體積10μL，在4℃冰箱中過夜連接。

轉(zhuǎn)化 取連接產(chǎn)物5μ L加入含有100μ L的感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，然后42℃熱激90s，于離心管加入500μ L LB液體培養(yǎng)基，將混勻離心管置于37℃搖床（220r/min，60min），最后用100μ L菌液涂板，37℃培養(yǎng)16h。

單克隆PCR鑒定 挑取單個(gè)白色克隆，于10μL雙蒸水中稀釋，取1μL稀釋液作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在2%瓊脂糖凝膠中電泳PCR產(chǎn)物，凝膠成像鑒定，大小片段一致的單克隆送測序。

質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)DNA拷貝數(shù)測定與計(jì)算 大量表達(dá)制備標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，采用Neno1000測定質(zhì)粒DNA濃度，按下列公式計(jì)算拷貝數(shù)：質(zhì)粒DNA拷貝數(shù)=質(zhì)粒DNA濃度×上樣質(zhì)粒體積/質(zhì)粒DNA分子量×6.02×1023（阿佛加德羅常數(shù)）。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）定量PCR在ABI 7500熒光PCR儀上進(jìn)行，反應(yīng)體系為Primex Ex Taq 10μL，F(xiàn)引物（10μmol/L）0.4μL，R引物（10μmol/L）0.4μL，探針（10μmol/L）0.4μL，DNA（10～50ng/μL）2μL，補(bǔ)充ddH2O至總體積20μL。RT-PCR反應(yīng)程序：95℃10s；40個(gè)循環(huán)（95℃5s，60℃ 34s）。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取5×109copies/μL的質(zhì)粒DNA以10倍濃度梯度進(jìn)行稀釋，取稀釋梯度為10-1～10-7共7個(gè)梯度的DNA為模板，每個(gè)梯度重復(fù)3次，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。以拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并獲得定量的線性方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子的構(gòu)建及鑒定為了構(gòu)建適用于轉(zhuǎn)Theli基因水稻的特異性檢測標(biāo)準(zhǔn)分子，分別將內(nèi)源基因SPS（277bp）和外源基因Theli（1108bp）克隆到pMD-T載體中，得到pMDSPS（圖1A）和pMDTheli（圖1B）2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子，大小分別為2969bp和3800bp，質(zhì)粒分子經(jīng)基因測序，結(jié)果與目的序列完全一致。

圖1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子結(jié)構(gòu)圖

2.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子的特異性采用非轉(zhuǎn)基因水稻基因組DNA、轉(zhuǎn)Theli基因水稻基因組DNA、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子為擴(kuò)增模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)2%瓊脂糖電泳顯色，其結(jié)果見圖2和圖3。內(nèi)源基因SPS均能在非轉(zhuǎn)基因水稻基因組DNA、轉(zhuǎn)Theli基因水稻基因組DNA、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子特異擴(kuò)增，對Theli序列的擴(kuò)增（圖3）可見轉(zhuǎn)Theli基因水稻基因組DNA和pMDTheli質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子能特異擴(kuò)增，而非轉(zhuǎn)基因水稻和空白對照未見擴(kuò)增。

圖2 SPS基因擴(kuò)增檢測結(jié)果

圖3 Theli序列擴(kuò)增檢測結(jié)果

2.3 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性分析使用質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子10倍梯度稀釋產(chǎn)物，每個(gè)重復(fù)3次進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲取的CT值與拷貝數(shù)對數(shù)分別繪制內(nèi)源基因與目標(biāo)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4、圖5），相關(guān)系數(shù)和PCR效率見表2。SPS基因的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖4）的相關(guān)系數(shù)在0.9993～0.9994之間，平均為0.9993，PCR擴(kuò)增效率在1.0004～1.034之間，平均為1.02；ThST3基因的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖5）的相關(guān)系數(shù)在0.9876～0.9996之間，平均為0.9937，PCR擴(kuò)增效率在0.9358～0.9486，平均為0.94。

圖4 SPS實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖5 ThST3實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子擴(kuò)增目標(biāo)基因的相關(guān)系數(shù)和PCR效率

3 結(jié)論與討論

目前，檢測轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品較為通用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)主要來源于植物原材料本身，而且制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的過程非常復(fù)雜，需要精度很高的設(shè)備、生產(chǎn)成本較高、保存環(huán)境要求高等，為此難以獲得全面的不同轉(zhuǎn)基因植物的標(biāo)準(zhǔn)樣品，市場上已經(jīng)商業(yè)化的轉(zhuǎn)基因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)僅有30種左右[6-8]。轉(zhuǎn)基因成分的實(shí)時(shí)熒光定量檢測依賴于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的缺乏直接制約轉(zhuǎn)基因作物定量檢測技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用。近年來發(fā)展起來的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子技術(shù)有望能解決這個(gè)難題，該方法已經(jīng)不斷的被研究者所接受[9-11]。因此，本研究著力構(gòu)建適用于轉(zhuǎn)基因水稻的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子pMDSPS和pMDTheli，其中包含水稻內(nèi)源基因SPS通用序列，耐鹽基因ThST3和Ubiquitin啟動(dòng)子序列的構(gòu)建特異性Theli序列。對其特異性及制備標(biāo)準(zhǔn)曲線的可靠性進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)分子為標(biāo)準(zhǔn)陽性對照的普通PCR擴(kuò)增中，均能特異擴(kuò)增目的條帶。以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分子構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線，SPS基因的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)平均為0.9993，PCR擴(kuò)增效率在1.0004～1.034之間；ThST3基因的定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)平均為0.9937，PCR擴(kuò)增效率在0.9358～0.9486。因此，構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)分子pMDSPS和pMDTheli既能作為普通PCR的陽性對照，也能用于定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建，為轉(zhuǎn)基因水稻的定量檢測提供簡便、價(jià)格低廉的標(biāo)準(zhǔn)分子打下基礎(chǔ)。

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2016-10-13）

深圳市技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目（CXZZ20120614165508810）；轉(zhuǎn)基因新品種培育重大專項(xiàng)（2009ZX08001-023B）

鄧漢超