黃俊玲　鐘騰猛　黃贊松　李廣志　周喜漢　何守搞

533000 廣西右江民族醫(yī)學(xué)院消化疾病研究所/附屬醫(yī)院(黃俊玲,黃贊松,李廣志,周喜漢,何守搞)；533000 廣西百色市人民醫(yī)院(鐘騰猛)

?

自噬因子Beclin 1和LC3表達(dá)與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性研究

黃俊玲鐘騰猛黃贊松李廣志周喜漢何守搞

533000 廣西右江民族醫(yī)學(xué)院消化疾病研究所/附屬醫(yī)院(黃俊玲,黃贊松,李廣志,周喜漢,何守搞)；533000 廣西百色市人民醫(yī)院(鐘騰猛)

【摘要】目的探討自噬因子Beclin 1和LC3表達(dá)與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性。方法采用免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)胃癌組織中自噬因子Beclin 1和LC3的表達(dá)情況。結(jié)果Beclin 1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)率為42.5%(51/120)，在癌旁組織其表達(dá)率為93.3%(112/120)，兩者比較有顯著性差異(χ2=21.3，P<0.05)；LC3蛋白在胃癌組織中的表達(dá)率為90.0%(108/120)，明顯高于癌旁組織的表達(dá)率(29.3%，34/120) ，兩者有顯著性差異(χ2=24.8，P<0.05)。Beclin 1和LC3蛋白表達(dá)與胃癌腫瘤分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，P<0.05。結(jié)論自噬因子Beclin1和LC3表達(dá)可能與胃癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】胃癌；Beclin 1；LC3

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:530～532)

自噬是細(xì)胞死亡的1種形式，不但參與正常的生理反應(yīng)，而且參與各種病理學(xué)過(guò)程[1]。但是自噬因子與胃癌病理相關(guān)性研究目前知之甚少，有待進(jìn)一步研究[2-3]。本研究用免疫組化方法檢測(cè)自噬因子在胃癌組織中的表達(dá)分布，探討自噬因子在癌變過(guò)程中的作用以及臨床意義。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器

免疫組化所用單克隆抗體均購(gòu)于CST公司，免疫組化試劑盒購(gòu)于康成生物科技有限公司，顯微成像系統(tǒng)購(gòu)于Leica公司。

1.2標(biāo)本及切片準(zhǔn)備

從2010年至2013年，我院共收治120例胃癌患者，切取120例患者的癌組織及癌旁組織，患者均未行任何化療、放療或腫瘤其他療法。所有標(biāo)本均采用石蠟切片法進(jìn)行處理和切片，每個(gè)標(biāo)本做連續(xù)切片2張，每張厚約5 μm，均行HE染色。

1.3免疫組織化學(xué)染色

①石蠟切片常規(guī)脫蠟后用酶消化處理，然后水化，用0.01 mol/L pH 7.2～7.4,PBS洗5 min，冷風(fēng)吹干，放入濕盒中。②滴加稀釋的抗體，37 ℃ 30～60 min或4 ℃ 過(guò)夜。③PBS 洗2次，蒸餾水洗1次。④50%甘油緩沖液封片。⑤熒光顯微鏡下檢查。⑥對(duì)照染色。陽(yáng)性對(duì)照，用已經(jīng)證實(shí)的含有靶抗原的組織切片與待檢標(biāo)本同樣處理，結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性。陰性對(duì)照，用確知不存在靶抗原的組織切片與待檢標(biāo)本同樣處理，結(jié)果應(yīng)為陰性?？瞻讓?duì)照，用免去特異性抗體或用PBS替代特異性抗體，結(jié)果應(yīng)為陰性。抑制試驗(yàn)，將標(biāo)記抗體和未標(biāo)記的抗體或血清等量混合后，按上述步驟處理切片，結(jié)果應(yīng)為陰性(一步法)。或?qū)⒋龣z切片兩張，一張加未標(biāo)記特異性血清，另一張加未標(biāo)記同種正常血清，孵育后沖洗，再加入標(biāo)記的特異性血清(例如特異性熒光標(biāo)記抗體)，加了未標(biāo)記特異性血清的切片因抗原抗體已結(jié)合，故染色被抑制，呈陰性結(jié)果，而加同種正常血清的切片則呈陽(yáng)性反應(yīng)(二步法)。切片標(biāo)本經(jīng)自來(lái)水充分沖洗后，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，梯度乙醇脫水后，用二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片后，顯微鏡下觀察并拍照。

1.4陽(yáng)性結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

采用半定量評(píng)分對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定，在低倍鏡和高倍鏡下觀察全片，根據(jù)染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占比率的乘積來(lái)判定。染色強(qiáng)度(A)可以分為不染色、淡黃色、黃色、棕黃色。在×400高倍鏡下至少任意計(jì)數(shù)5個(gè)視野，觀察陽(yáng)性染色細(xì)胞程度并準(zhǔn)確計(jì)數(shù)。陽(yáng)性染色細(xì)胞(B)的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%為1分；10%～50%為2分；≥50%為3分?？傇u(píng)分為A與B的乘積。

胃癌前病變包括腺體萎縮、腸上皮化和上皮內(nèi)瘤變。癌前病變和癌變的診斷以病理診斷為金標(biāo)準(zhǔn)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理相關(guān)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，自噬因子的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。P<0.01或0.05為具有顯著性差異。

2結(jié)果

2.1Beclin 1和LC3蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)情況

Beclin 1蛋白在胃癌組織中的表達(dá)率為42.5%(51/120)，在癌旁組織中的表達(dá)率為93.3%(112/120)，兩者有顯著性差異(χ2=21.3，P<0.05)；LC3蛋白在胃癌組織中的表達(dá)率為90.0%(108/120)，明顯高于癌旁組織的表達(dá)率(29.3%，34/120) ，兩者比較有顯著性差異(χ2=24.8，P<0.05)。

2.2Beclin 1和LC3蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

Beclin 1和LC3蛋白表達(dá)與胃癌分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，P<0.05，見(jiàn)表1。

表1　Beclin 1和LC3蛋白表達(dá)與胃癌

3討論

自噬是機(jī)體由于自身代謝和某些細(xì)胞器更新的緣故，吞噬自身蛋白質(zhì)或細(xì)胞器，并被溶酶體融合及降解的過(guò)程，是1種正常的、高度保守的細(xì)胞功能，與細(xì)胞增殖、凋亡以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。有很多研究報(bào)道表明，與細(xì)胞癌變有關(guān)的癌基因和抑癌基因可以受細(xì)胞自噬信號(hào)通路調(diào)[4-5]。消化性潰瘍常常導(dǎo)致胃癌前病變，是胃癌發(fā)生的重要原因之一，近年來(lái)，其發(fā)病率和死亡率都居高不下，引起了社會(huì)各界人士的廣泛關(guān)注[6-10]。但是自噬因子與Hp感染導(dǎo)致的消化性潰瘍合并胃癌前病變的相關(guān)性目前并不明確，有待進(jìn)一步研究。

本研究結(jié)果表明，自噬因子Beclin 1在胃癌中的表達(dá)量明顯低于癌旁組織，Beclin1的低表達(dá)可能是胃癌前病變發(fā)生的分子生物學(xué)機(jī)制之一。Beclin 1主要為細(xì)胞漿內(nèi)，也稱為BECN1，是迄今為止在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的唯一自噬基因，是酵母自噬相關(guān)基因6(ATG6)的同系物，與多種腫瘤或癌癥的發(fā)生發(fā)展息息相關(guān)。自噬性細(xì)胞死亡是一種不依賴caspase的Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，Beclin 1是與自噬相關(guān)的抑癌基因，是激活自噬信號(hào)通路的關(guān)鍵蛋白之一，可以調(diào)控調(diào)往信號(hào)通路，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡。Beclin 1的表達(dá)水平與腫瘤或癌癥惡化程度有關(guān)，在臨床上可以作為預(yù)測(cè)標(biāo)志物和判斷患者預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)。Beclin 1在腫瘤中的生物學(xué)機(jī)制可能有：①腫瘤細(xì)胞受刺激后，線粒體釋放大量凋亡蛋白，啟動(dòng)自噬來(lái)清除受損的線粒體，阻斷了線粒體介導(dǎo)的凋亡信號(hào)通路，腫瘤細(xì)胞受到保護(hù)而存活；②Beclin 1抑制Bcl-2凋亡抑制通路，腫瘤細(xì)胞可以無(wú)限增殖；③參與自噬的Beclin 1主要位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，不同的腫瘤組織中，Beclin 1在細(xì)胞器中的分布存在很大的差異性，在某些腫瘤中，其表達(dá)量雖然高，但是不能發(fā)揮抗腫瘤效果。已有研究報(bào)道，Beclin 1在慢性肺萎縮性胃炎、胃癌前病變和胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的表達(dá)量及活性逐漸降低，通過(guò)自噬和凋亡通路死亡的病變細(xì)胞減少，腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移增加，同時(shí)，癌變過(guò)程中，基因組極其不穩(wěn)定，癌變概率增加，進(jìn)一步促進(jìn)了癌癥的發(fā)生。Beclin 1在胃癌組織中表達(dá)量下降，是胃癌發(fā)生的早期事件之一，因此對(duì)胃癌的患者檢測(cè)Beclin 1的表達(dá)水平，可以提高胃癌的早期診斷和預(yù)后。

自噬體的形成需要多種蛋白質(zhì)復(fù)合體和小分子的參與，其標(biāo)志性蛋白是LC3(autophagy protein microtubule associated protein 1 light chain 3,LC3)，LC3-Ⅰ的C端被類(lèi)泛素化酶催化后和PE(phosphatidyl ethanolamine,PE)結(jié)合轉(zhuǎn)變?yōu)長(zhǎng)C3-Ⅱ，該蛋白復(fù)合物是檢測(cè)自噬現(xiàn)象的標(biāo)志物[11]。LC3介導(dǎo)的自噬作用在多種胃病中都至關(guān)重要[12]，本研究顯示LC3蛋白在胃癌中的表達(dá)率為90.0%(108/120)，明顯高于癌旁組織的表達(dá)率(29.3%，34/120) ，兩者有顯著性差異(χ2=24.8，P<0.05)，結(jié)果表明LC3蛋白的高表達(dá)可能與胃癌的發(fā)生里面相關(guān)。在隨后Beclin 1和LC3蛋白的表達(dá)與疾病臨床病理特征的關(guān)系研究中，我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，胃癌惡性程度高的患者中，Beclin 1表達(dá)是呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)，而LC3蛋白的表達(dá)是呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，結(jié)果表明兩者與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

綜上所述，研究自噬因子在胃癌中的作用，有助于研制新的治療方案，使臨床診斷更加準(zhǔn)確，提高患者的早期診斷及治療。

參考文獻(xiàn)

[1]Zhu BS,Zhao K,Jia X,et al.Effects of damage-regulated autophagy regulator gene on the SGC7901 human gastric cancer cell line〔J〕.Oncol Lett,2014,8(2):657-662.

[2]Rasul A,Yu B,Zhong L,et al.Cytotoxic effect of evodiamine in SGC-7901 human gastric adenocarcinoma cells via simultaneous induction of apoptosis and autophagy〔J〕.Oncol Rep,2012,27(5):1481-1487.

[3]Kim MS,Jeong EG,Ahn CH,et al.Frameshift mutation of UVRAG,an autophagy-related gene,in gastric carcinomas with microsatellite instability〔J〕.Hum Pathol,2008,39(7):1059-1063.

[5]Ding Y,Zhao K,Wu Y,et al.Expression and significance of Beclin-1 in vasculogenic mimicry formation of gastric cancer〔J〕.Zhonghua Wei Chang Wai Ke Za Zhi,2014,17(7):716-719.

[6]Ge J,Chen Z,Huang J,et al.Upregulation of autophagy-related gene-5 (ATG-5) is associated with chemoresistance in human gastric cancer〔J〕.PLoS One,2014,9(10):e110293.

[7]Hosogi S,Kusuzaki K,Inui T,et al.Cytosolic chloride ion is a key factor in lysosomal acidification and function of autophagy in human gastric cancer cell〔J〕.J Cell Mol Med,2014,18(6):1124-1133.

[8]Lee HW,Jang KS,Choi HJ,et al.Celastrol inhibits gastric cancer growth by induction of apoptosis and autophagy〔J〕.BMB Rep,2014,47(12):697-702.

[9]Li Y,Zhang J,Ma H,et al.Protective role of autophagy in matrineinduced gastric cancer cell death〔J〕.Int J Oncol,2013,42(4):1417-1426.

[10]Liu D,Gao M,Zhao S.Autophagy as a novel strategy for treatment of gastric cancer:a hypothesis〔J〕.Med Sci Monit,2013,19:794-796.

[11]Mizushima N,Yoshimori T,Levine B.Methods in mammalian autophagy research〔J〕.Cell,2010,140(3):313-326.

[12]Halder P,Datta C,Kumar R,et al.The secreted antigen,HP0175,of Helicobacter pylori links the unfolded protein response (UPR) to autophagy in gastric epithelial cells〔J〕.Cell Microbiol,2015,17(5):714-729.

(編輯：吳小紅)

Correlation Study of Expression of Autophagic Factors Beclin 1 and LC3 and Clinicopathological Features in Gastric Cancer

HUANGJunling,ZHONGTengmeng,HUANGZansong,etal.AffiliatedHospitalofYoujiangMedicalCollegeofNationality,Baise,533000

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression of autophagic factors Beclin 1 and LC3 and clinicopathological features in gastric cancer.MethodsBy immunohistochemical method,the expression of Beclin 1 and LC3 in gastric cancer tissues were detected.ResultsBeclin 1 protein expression of gastric carcinoma was 42.5% (51/120),and of adjacent tissues was 93.3% (112/120),there was significant difference (χ2=21.3,P<0.05);LC3 protein expression in gastric carcinoma was 90.0% (108/120),which was significantly higher than that of adjacent tissues (29.3%,34/120),there was significant difference (χ2=24.8,P<0.05).Beclin 1 and LC3 protein expression were closely related to the degree of differentiation and lymph node metastasis,P<0.05.ConclusionThe expression of Beclin1 and LC3 are related to carcinogenesis and development of gastric cancer.

【Key words】Gastric cancer;Beclin 1；LC3

(收稿日期2015-07-06修回日期 2015-12-21)

中圖分類(lèi)號(hào)：R735.2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2016)04-0530-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.04.003