李艷菊　陳　榮　張春莉　惠起源

716000 延安大學(xué)附屬醫(yī)院(李艷菊，張春莉，惠起源)；716000 延安市中醫(yī)院(陳　榮)

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·基礎(chǔ)研究·

KRAS、BRAF基因突變?cè)诖竽c鋸齒狀病變中的臨床應(yīng)用

李艷菊陳榮張春莉惠起源

716000 延安大學(xué)附屬醫(yī)院(李艷菊，張春莉，惠起源)；716000 延安市中醫(yī)院(陳榮)

【摘要】目的研究KRAS、BRAF基因突變?cè)诖竽c鋸齒狀病變中的臨床應(yīng)用。方法選取100例大腸鋸齒狀病例經(jīng)切除術(shù)后的石蠟標(biāo)本進(jìn)行研究。應(yīng)用直接測(cè)序技術(shù)對(duì)KRAS、BRAF基因的突變進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果大腸鋸齒狀病變中KRAS基因突變率為40.00%，BRAF基因突變率為6.67%。所有大腸鋸齒狀病變患者中有40例檢出KRAS基因突變，突變率為40.00%，其中KRAS基因12、13密碼子突變率分別為30.00%以及10.00%。KRAS 基因突變率與患者性別、年齡、病變部位、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征均無(wú)關(guān)(P>0.05)。 BRAF基因突變?cè)?65歲患者以及大腸近端情況較多見(jiàn)(P<0.05)。結(jié)論隨著KRAS、BRAF基因突變的研究不斷深入，對(duì)指導(dǎo)臨床進(jìn)行隨訪及藥物治療預(yù)后的判定具有重要的臨床意義。

【關(guān)鍵詞】KRAS；BRAF；基因突變；大腸鋸齒狀病變

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:523～525)

大腸癌是全世界最為多見(jiàn)的惡性腫瘤之一，而鋸齒狀腺瘤可能跟傳統(tǒng)的腺瘤(管狀、絨毛狀和管狀絨毛狀) 等各種類型的癌前狀態(tài)有關(guān)，因而近幾年來(lái)不斷被密切關(guān)注[1-2]。鋸齒狀腫瘤已經(jīng)成為WHO(2010)關(guān)于消化系統(tǒng)腫瘤分類的重點(diǎn)之一[3]。本文特此研究KRAS、BRAF基因突變?cè)诖竽c鋸齒狀病變中的臨床應(yīng)用，得到了一些結(jié)論，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1臨床資料

從2012年6月至2014年6月，選取我院100例大腸鋸齒狀病例經(jīng)切除術(shù)后的石蠟標(biāo)本進(jìn)行研究。所有患者均經(jīng)過(guò)HE染色病理組織學(xué)得以確診，其中男性患者64例，女性患者36例，年齡45～76歲，平均年齡為(46.3±4.3)歲。將所有標(biāo)本使用甲醛進(jìn)行固定，用石蠟將組織包埋。對(duì)全部患者做KRAS基因第2號(hào)外顯子突變檢測(cè)，其中45例患者檢測(cè)其BRAF基因的第15號(hào)外顯子突變情況。

1.2研究方法

實(shí)施基因組DNA的提?。菏褂肣iagen公司的DNA提取試劑盒對(duì)組織的DNA進(jìn)行提取，行4 μm厚的5~10張切片，實(shí)施脫蠟以及水化處理。PCR方式對(duì)KRAS基因第2號(hào)外顯子以及BRAF基因的第15號(hào)外顯子進(jìn)行擴(kuò)增處理：根據(jù)KRAS、BRAF基因組DNA序列設(shè)計(jì)PCR引物，序列為：KRAS基因第2號(hào)外顯子：上游段引物為5’-AGGCCTGCTGAAA—ATGACTG-3’，下游段引物為5’-GGTGCAGGACCATF—CTTTGA-3’，目的片段173 bp；BRAF基因的第15號(hào)外顯子：上游段引物為5’-GCTFGCTCTGATAGGAAAATGAG-3’，下游段引物為5’-GTAACTcAGCAGcATCTCAGG-3’，目的片段為237 bp；以β-actin基因作為對(duì)照組，檢測(cè)所提取的組織DNA質(zhì)量。β-actin基因的引物：上游段引物為5’-CACACTGTGCCCATCTACG-3’，下游段引物為5’-GGTCTTGCGGATGTCCAC-3’，目的片段為492 bp。PCR反應(yīng)體系為25 μl，其反應(yīng)條件是：在94 ℃條件下預(yù)變性10 min，之后變形45 s，72 ℃下進(jìn)行延伸45 s，一共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，之后在72 ℃下延伸7 min，在4 ℃時(shí)結(jié)束。將雙蒸水替代DNA模板做陰性對(duì)照，提取PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl，使用2%的瓊脂凝膠進(jìn)行電泳處理，使用溴乙啶進(jìn)行染色處理。DNA測(cè)序：將PCR的產(chǎn)物直接進(jìn)行純化處理，應(yīng)用美國(guó)ABI3730XL測(cè)序儀，用雙脫氧核糖核酸鏈末端終止方式對(duì)PCR的產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.3觀察指標(biāo)

分析大腸鋸齒狀病變中KRAS、BRAF基因突變類型分布情況以及KRAS、BRAF基因突變與大腸鋸齒狀病變患者臨床病理特征的關(guān)系。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1大腸鋸齒狀病變中KRAS、BRAF基因突變類型分布情況

大腸鋸齒狀病變中KRAS基因突變率為40.00%，BRAF基因突變率為6.67%，見(jiàn)表1。

2.2大腸鋸齒狀病變中KRAS基因突變類型和發(fā)生率

所有大腸鋸齒狀病變患者中有40例檢出KRAS基因突變，突變率為40.00%，其中KRAS基因12、13密碼子突變率分別為30.00%及10.00%，見(jiàn)表2。

2.3KRAS、BRAF基因突變與大腸鋸齒狀病變患者臨床病理特征的關(guān)系

KRAS 基因突變率與患者性別和年齡，病變部位，分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征均無(wú)明顯聯(lián)系(P>0.05)，BRAF 基因突變?cè)?65歲患者以及大腸近端情況較多見(jiàn)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表1　大腸鋸齒狀病變中KRAS、BRAF基因突變類型分布情況

表2　大腸鋸齒狀病變中KRAS基因突變類型和發(fā)生率

3討論

鋸齒狀腺瘤既有增生性息肉的結(jié)構(gòu)特征又有腺瘤性息肉的細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)，在低倍鏡下觀察其組織病理學(xué)表現(xiàn)時(shí)可發(fā)現(xiàn)既有增生性息肉樣的鋸齒狀腺體，又有上皮的異型增生，而內(nèi)鏡下鋸齒狀腺瘤的形態(tài)與增生性息肉相似，因此以往鋸齒狀腺瘤經(jīng)常被診斷為增生性息肉或腺瘤性息肉[4]。

據(jù)統(tǒng)計(jì)，鋸齒狀腺瘤發(fā)生在近端結(jié)腸(盲腸、升結(jié)腸和橫結(jié)腸)的比例達(dá)35.14%,而增生性息肉和傳統(tǒng)腺瘤在這些部位的發(fā)生比例明顯低于鋸齒狀腺瘤。增生性息肉以及鋸齒狀腺瘤在直腸和乙狀結(jié)腸發(fā)生率均較大，說(shuō)明直腸以及乙狀結(jié)腸的鋸齒狀腺瘤極有可能來(lái)源于此部位的增生性息肉。然而近端結(jié)腸的鋸齒狀腺瘤所占比例明顯大于增生性息肉，說(shuō)明該處的鋸齒狀腺瘤很有可能來(lái)源于其他的病灶[5]。微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability,MSI)和CpG島甲基化，KRAS以及BRAF基因突變是鋸齒狀病變研究中最受關(guān)注的分子遺傳學(xué)改變，并且在這3方面均與結(jié)直腸癌存在一致性[6]。微衛(wèi)星不穩(wěn)定、CpG 島甲基化在鋸齒狀腫瘤與腺癌的相關(guān)性研究已經(jīng)得到證實(shí)。但是KRAS、BRAF基因突變率在增生性息肉與鋸齒狀腺瘤比例不一，本研究顯示，大腸鋸齒狀病變中KRAS基因突變率為40.00%，BRAF基因突變率為6.67%。所有大腸鋸齒狀病變患者中有40例檢出KRAS基因突變，突變幾率為40.00%，其中KRAS基因12、13密碼子突變幾率是30.00%以及10.00%。這可能和以下3個(gè)因素有關(guān)：①大體形態(tài)：隆起型鋸齒狀腺瘤KRAS基因突變率較高，扁平型鋸齒狀腺瘤的KRAS基因突變率比較低。②解剖學(xué)分布：低微衛(wèi)性不穩(wěn)定的結(jié)直腸癌多位于左側(cè)結(jié)腸和直腸，伴較高頻率的KRAS基因突變；高度微衛(wèi)性不穩(wěn)定的結(jié)直腸癌多位于右側(cè)結(jié)腸，KRAS基因突變率低。③組織學(xué)分類：微泡型增生性息肉中80%BRAF基因突變，僅有4%KRAS基因突變；杯狀細(xì)胞型增生性息肉54%出現(xiàn)KRAS基因突變，BRAF基因突變水平很低或者缺乏。因此BRAF基因突變可能是鋸狀癌變途徑的特殊標(biāo)記物之一。

表3　KRAS、BRAF基因突變與大腸鋸齒狀病變患者臨床病理特征的關(guān)系/例

此外，本文研究還顯示，BRAF 基因突變?cè)?65歲患者以及大腸近端情況較多見(jiàn)，BRAF基因是絲/蘇氨酸激酶Raf家族的成員，70%的惡性黑色素瘤和 5%~15%結(jié)直腸癌有BRAF基因突變，而常見(jiàn)突變?yōu)閂600E，在既是高CpG島甲基化又是高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的腫瘤中，BRAF基因突變率高達(dá)94%，但在遺傳性非息肉性結(jié)直腸癌的高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性癌和腺瘤則沒(méi)有BRAF基因的突變。說(shuō)明遺傳性高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性癌與散發(fā)性高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性癌發(fā)生機(jī)制不同，BRAF基因突變檢測(cè)可用來(lái)區(qū)別高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是遺傳性或散發(fā)性。且BRAF基因突變與KRAS突變呈反相關(guān)關(guān)系，BRAF基因突變后蛋白過(guò)度表達(dá)失活由細(xì)胞色素C釋放引起的caspas通路的活化，從而抑制凋亡，當(dāng)細(xì)胞獲得其他突變后，活化的BRAF效應(yīng)就可驅(qū)動(dòng)細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

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(編輯：吳小紅)

Clinical Application of KRAS,BRAF Gene Mutation in Colorectal Serrated Lesions

LIYanju,CHENRong,ZHANGChunli,etal.AffiliatedHospitalofYan'anUniversity,Yan'an,716000

【Abstract】ObjectiveTo study the clinical application of KRAS and BRAF gene mutation in colorectal serrated lesions.Methods100 cases of colorectal serrated cases of paraffin embedded specimens after resection were selected.Mutation of KRAS and BRAF gene were detected by direct sequencing analysis.ResultsThe colorectal serrated lesions in the KRAS gene mutation rate were 40%,BRAF gene mutation rate was 6.67%.All patients with colorectal serrated lesions were found in 40 cases of KRAS gene mutation,mutation probability was 40%,of which 12,13 of the KRAS gene mutation rate was 30% and 10% respectively.The mutation rate of KRAS gene and the patient's gender and age,clinical and pathological features of the lesion,degree of differentiation and lymph node metastasis were not significantly related (P>0.05).BRAF gene mutation were mainly in patients> 65 or with proximal large intestine.(P<0.05).ConclusionWith the further study of KRAS,BRAF gene mutation,it has important clinical significance in guiding follow-up and evaluating prognosis.

【Key words】KRAS;BRAF;Gene mutation;Colorectal serrated lesions

(收稿日期2015-06-02修回日期 2015-12-21)

中圖分類號(hào)：R735.3+4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2016)04-0523-03

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2016.04.001

基金項(xiàng)目：延安大學(xué)附屬醫(yī)院研究生創(chuàng)新基金(編號(hào)：12YJ23)