鄧庭進(jìn),尹 華*,葉錦韶,彭 輝,劉芷辰(.華南理工大學(xué)環(huán)境與能源學(xué)院,工業(yè)聚集區(qū)污染控制與生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 50006；.暨南大學(xué)環(huán)境學(xué)院,廣東 廣州 506；.暨南大學(xué)化學(xué)系,廣東 廣州 506)

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Pseudomonas putida細(xì)胞對(duì)微囊藻毒素-LR的脅迫響應(yīng)

鄧庭進(jìn)1,尹 華1*,葉錦韶2,彭 輝3,劉芷辰1(1.華南理工大學(xué)環(huán)境與能源學(xué)院,工業(yè)聚集區(qū)污染控制與生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510006；2.暨南大學(xué)環(huán)境學(xué)院,廣東 廣州 510632；3.暨南大學(xué)化學(xué)系,廣東 廣州 510632)

摘要：將1.0g/L的微囊藻毒素-LR(MC-LR)降解菌惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida)置于含不同濃度MC-LR的體系中,研究了體系中菌體細(xì)胞完整性和生物量的變化,考察了MC-LR對(duì)細(xì)胞的氧化脅迫以及抗氧化酶的響應(yīng).結(jié)果表明,MC-LR能夠增大P. putida細(xì)胞質(zhì)膜通透性,造成膜損傷,導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)外流,使細(xì)胞完整性遭到破壞;同時(shí),MC-LR能夠引起P. putida細(xì)胞的氧化脅迫,隨著毒素暴露時(shí)間的延長(zhǎng),活性氧自由基(ROS)和膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量顯著升高,具有明顯的劑量效應(yīng).超氧化物歧化酶(SOD)活性在MC-LR的誘導(dǎo)下有一個(gè)先升后降的過(guò)程,表現(xiàn)為對(duì)低濃度污染物的主動(dòng)響應(yīng),而高濃度(2.5mg/L)MC-LR作用5d后,ROS積累到相當(dāng)高水平,對(duì)細(xì)胞代謝功能造成破壞,使SOD活性下降,并加速細(xì)胞的死亡,P. putida生物量與對(duì)照相比,下降了將近50％.

關(guān)鍵詞：微囊藻毒素-LR；惡臭假單胞菌；氧化脅迫；生物量；毒性

* 責(zé)任作者, 教授, huayin@scut.edu.cn

微囊藻毒素(MCs)是富營(yíng)養(yǎng)化污染的次生代謝產(chǎn)物,其結(jié)構(gòu)為環(huán)狀七肽,具有很強(qiáng)的生物毒性.研究表明,世界上25％～70％的藍(lán)藻水華能夠產(chǎn)生藻毒素[1],對(duì)環(huán)境危害極大.目前,有關(guān)MCs的毒性研究大多集中在動(dòng)物、高等植物上[2-4],而其對(duì)微生物的作用機(jī)制研究還很有限,大量細(xì)菌、真菌、浮游植物等微生物與藻毒素共存于富營(yíng)養(yǎng)化水體中,兩者相互接觸,勢(shì)必存在相互影響[5-6].楊翠云等[7-8]研究發(fā)現(xiàn)MCs能夠促進(jìn)溶菌酶對(duì)大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的細(xì)胞膜滲透性,增加細(xì)胞內(nèi)可溶性糖和可溶性蛋白的外滲.尹黎燕等[9]研究顯示,MC-LR可對(duì)煙草BY-2細(xì)胞造成氧化脅迫,并激發(fā)細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng).另一方面,產(chǎn)毒藻類普遍存在于富營(yíng)養(yǎng)化水環(huán)境中,能夠?yàn)槲⑸锏母街L(zhǎng)及生物修復(fù)提供條件,然而,MCs的產(chǎn)生與藍(lán)藻水華暴發(fā)具有同步性,二者呈極顯著正相關(guān)[10],MCs對(duì)微生物的作用是否會(huì)影響到水華污染水域的修復(fù)作用,是亟待解決的科學(xué)問(wèn)題.

當(dāng)前,MCs的微生物降解去除是科學(xué)研究的熱點(diǎn),而關(guān)于MCs對(duì)菌體的毒性作用研究較少.袁媛等[11]研究發(fā)現(xiàn),MC-LR能抑制降解菌的生長(zhǎng),導(dǎo)致MC-LR的降解率下降.Ding等[12]利用純微囊藻毒素作用于菌體中,發(fā)現(xiàn)藻毒素能夠引起菌體細(xì)胞的氧化脅迫,并破壞菌體線粒體和電子傳遞鏈.本文選取我國(guó)藍(lán)藻水華中常見(jiàn)且毒性最強(qiáng)的MC-LR作為MCs代表物,利用本實(shí)驗(yàn)室前期分離、篩選得到的對(duì)MC-LR有降解作用的惡臭假單胞菌純菌株(Pseudomonas putida)為研究對(duì)象,分析MC-LR對(duì)菌體細(xì)胞的毒性脅迫影響,并考察細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的響應(yīng)機(jī)制,以期為進(jìn)一步揭示MCs對(duì)菌體的作用機(jī)制和生理毒性影響,探明藻毒素對(duì)生態(tài)環(huán)境中藻菌之間的作用影響提供一定的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與材料

實(shí)驗(yàn)菌種:惡臭假單胞菌(Pseudomonas putida),由本課題組從廣州市某發(fā)生水華的人工湖底泥中篩選馴化得到,該菌對(duì)MC-LR有良好的降解效果[13].

MC-LR儲(chǔ)備液由實(shí)驗(yàn)室制備,其提取和純化方法參照文獻(xiàn)[14].

營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基:牛肉膏 3g,蛋白胨 10g,NaCl 5g,蒸餾水 1000mL,pH為7.4～7.6.

無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MSM):K2HPO40.02g, NaH2PO40.1g, MgSO4·7H2O 0.05g, NH4NO30.02g, CaCl20.05g,水1000mL.

絕對(duì)計(jì)數(shù)管(TruCOUNT Tubes)購(gòu)于Becton–Dickinson (SanJose, CA, USA);2',7'-二氯二氫熒光素二乙酯(DCFH-DA)購(gòu)于Sigma-Aldrich公司.超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)試試劑盒、丙二醛(MDA)測(cè)試試劑盒均購(gòu)于南京建成生物研究所.

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)(KDC-160HR,安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司);紫外分光光度計(jì)(UVmini-1240,日本島津公司);高效液相色譜(CBM-20A,日本島津公司);流式細(xì)胞儀(FACSDiva,美國(guó)BD公司);超聲破壁儀(SCIENTZ-ⅡD,寧波新芝科技有限公司).

1.3 P. putida的毒素處理

將活化后的P. putida投加到MC-LR質(zhì)量濃度分別為0,0.5,2.5mg/L的滅菌無(wú)機(jī)鹽基礎(chǔ)培養(yǎng)基中,使體系最終為20mL,菌體質(zhì)量濃度為1.0g/L,于30℃、130r/min搖床中恒溫振蕩培養(yǎng).以不加MC-LR的MSM體系作為空白對(duì)照.

1.4 MC-LR對(duì)P. putida細(xì)胞完整性的影響

分別取毒素處理0,12,24,48,72,96,120h后的樣品,測(cè)定其在260nm處的吸光度值,以表征細(xì)胞完整性的變化.每組設(shè)置3個(gè)平行,進(jìn)行2次重復(fù)實(shí)驗(yàn).

1.5 MC-LR對(duì)P. putida細(xì)胞的氧化脅迫

1.5.1 MC-LR作用下P. putida細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基(ROS)的測(cè)定 分別取毒素處理第0,1,2,3, 4,5d樣品,離心收集菌體,用10mg/L溶菌酶處理后,用雙蒸水清洗2～3遍,用PBS重懸,加入200μL DCFH-DA染液,混勻,37℃避光孵育20min;加入500μL PBS洗滌,置于1000r/min下離心5min,棄上清液,加入200μL PBS,混勻,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)樣品中生成的DCF熒光強(qiáng)度[15].

1.5.2 MC-LR作用下P. putida細(xì)胞內(nèi)丙二醛(MDA)的測(cè)定 毒素處理后于0,24,48,72,96, 120h進(jìn)行取樣,離心收集菌體,用PBS清洗后重懸,置于0℃冰-水混合水浴中,超聲破壁.超聲破壁儀功率為:450W,工作3s,間隙3s,破壁150次.取混合懸液利用丙二醛測(cè)試試劑盒測(cè)定MDA含量.

1.6 MC-LR作用下P. putida超氧化物歧化酶S0D的響應(yīng)變化

1.6.1 P. putida細(xì)胞酶液的制備 將P.putida菌體培養(yǎng)液離心過(guò)濾,收集菌體,用0.9％的生理鹽水清洗3次.洗滌后的菌體收集于離心管中,加入生理鹽水10mL,置于0℃的冰-水混合水浴中,超聲破壁.將破碎后混合懸液離心15min (8000r/ min,4℃),上清液即為所需酶液.參照考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定制備酶液中可溶性蛋白含量,用牛血清蛋白(BSA)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白[16].

1.6.2 超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定 分別取毒素處理后第0,1,2,3,4,5d樣品,離心收集菌體,根據(jù)1.6.1進(jìn)行酶液的制備,并利用試劑盒測(cè)定SOD酶活性.

1.7 MC-LR對(duì)P. putida細(xì)胞生物量的影響

取毒素處理后第0,2,4,6d樣品,離心收集底部菌體細(xì)胞,用PBS洗滌后重懸,稀釋2000倍后, 取300μL加入絕對(duì)計(jì)數(shù)管中,渦旋震蕩使樣品與管中的內(nèi)參物熒光微球混勻后上機(jī)檢測(cè).

每根絕對(duì)計(jì)數(shù)管中含有已知數(shù)量的內(nèi)參物——熒光微球,通過(guò)流式細(xì)胞儀可以直接檢測(cè)到儀器進(jìn)樣中P. putida細(xì)胞的數(shù)目和熒光微球的數(shù)目,得出數(shù)據(jù)后,通過(guò)公式(1)換算即可直接得出每個(gè)樣品中P. putida的細(xì)菌數(shù)目[17]:

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所獲數(shù)據(jù)利用SPSS 17.0和One-Way ANOVA法進(jìn)行相關(guān)性分析和差異顯著性分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 MC-LR對(duì)P. putida細(xì)胞完整性的影響

正常狀態(tài)下的細(xì)胞,細(xì)胞質(zhì)膜是完整閉合的,胞內(nèi)物質(zhì)被封閉起來(lái),只通過(guò)主動(dòng)運(yùn)輸或離子交換等方式與外界進(jìn)行物質(zhì)交換.當(dāng)細(xì)胞質(zhì)膜被損壞時(shí),細(xì)胞質(zhì)膜通透性會(huì)增大,某些胞內(nèi)大分子物質(zhì)會(huì)流出,這些胞內(nèi)物質(zhì)中如DNA、RNA等在波長(zhǎng)260nm的發(fā)射光照射下能夠被檢出,因此,可以把測(cè)得的吸光度值變化情況作為間接判斷細(xì)胞質(zhì)膜完整性是否受到損壞的依據(jù)[18].

由圖1可知,在未添加MC-LR的對(duì)照體系中,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),吸光度值略微上升,這可能是由于培養(yǎng)到后期,部分細(xì)胞逐漸衰老,少量細(xì)胞出現(xiàn)死亡破裂現(xiàn)象,胞內(nèi)物質(zhì)外流,從而導(dǎo)致所測(cè)吸光度值升高,反映出P. putida的完整性受到一定程度的破壞.而對(duì)于經(jīng)不同濃度MC-LR處理的實(shí)驗(yàn)組,測(cè)得的吸光度值增加的現(xiàn)象較對(duì)照出現(xiàn)得更早,且隨著MC-LR濃度的增加,吸光度值上升幅度更大(P<0.05),這表明MC-LR導(dǎo)致了胞內(nèi)物質(zhì)的大量外流,破壞了P. putida細(xì)胞的完整性,分析原因,一方面,可能是因?yàn)镸C-LR能作用于P. putida的細(xì)胞質(zhì)膜,使細(xì)胞質(zhì)膜通透性增大[14],從而使胞內(nèi)物質(zhì)更易流出;另一方面,MC-LR可能致使細(xì)胞發(fā)生極化現(xiàn)象,使細(xì)胞遭受損傷,加速細(xì)胞的破裂和死亡,最終使得胞內(nèi)物質(zhì)大量流出,細(xì)胞的完整性遭到破壞.

圖1　MC-LR對(duì)P. putida細(xì)胞完整性的影響Fig.1 Effect of MC-LR on the cell integrity of P. putida　*表示與對(duì)照組有顯著性差異(P<0.05),下同

2.2 MC-LR對(duì)P. putida細(xì)胞的氧化脅迫

活性氧自由基ROS(Reactive Oxygen Species)是一類包括超氧陰離子自由基、羥基自由基、過(guò)氧化氫等在內(nèi)的高反應(yīng)性分子[19].在正常情況下,ROS為細(xì)胞提供正常的生理環(huán)境,而細(xì)胞內(nèi)過(guò)量和長(zhǎng)時(shí)間的ROS作用能破壞胞內(nèi)蛋白,引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用,并因此形成脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物[20].丙二醛(MDA)是膜脂過(guò)氧化最重要的產(chǎn)物之一,它的產(chǎn)生能加劇膜的損傷,因此,可以通過(guò)ROS和MDA的含量了解膜脂過(guò)氧化的程度,以間接反映P. putida細(xì)胞及膜系統(tǒng)受氧化脅迫的損傷程度[21].

圖2和圖3分別為培養(yǎng)體系中不同MC-LR濃度下P. putida細(xì)胞內(nèi)ROS和MDA隨時(shí)間的變化情況.由圖中可以看出,MC-LR可引起細(xì)胞ROS和MDA含量增多,差異具有顯著性(P<0.05),且表現(xiàn)出一定的劑量效應(yīng),即MC-LR濃度越高,ROS和MDA增加越明顯.

圖2中,將P. putida投加至空白對(duì)照體系中,由于細(xì)胞進(jìn)入新的培養(yǎng)環(huán)境而產(chǎn)生氧化脅迫,而菌體細(xì)胞通過(guò)自身的調(diào)節(jié)機(jī)制,很快適應(yīng)了新的環(huán)境.因此,表現(xiàn)為ROS含量略微增加,但維持在較低水平.

圖2　MC-LR對(duì)P. putida細(xì)胞活性氧自由基的影響Fig.2 Effect of MC-LR on ROS of P. putida

經(jīng)MC-LR處理后的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞從第2d 起,ROS含量急劇上升,顯著高于對(duì)照組,并在整個(gè)培養(yǎng)階段都維持在較高水平,表明P. putida細(xì)胞受到了新的氧化脅迫,而這種脅迫正是由MC-LR所引起的.低濃度的MC-LR(0.5mg/L)毒性處于一個(gè)較低水平,對(duì)ROS的激發(fā)作用較小,對(duì)菌體的毒害作用也有限,但會(huì)隨著暴露時(shí)間的增加而出現(xiàn)ROS的累積,最終使ROS含量逐漸上升.當(dāng)把加入體系中的MC-LR濃度提高到2.5mg/L時(shí),菌體ROS水平經(jīng)過(guò)第1d的自動(dòng)調(diào)整期之后,迅速呈現(xiàn)直線增長(zhǎng).Xiong等[22]發(fā)現(xiàn),高濃度的MC-LR毒害性增大,能導(dǎo)致細(xì)胞膜系統(tǒng)變性,進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的損傷,迅速破壞細(xì)胞內(nèi)的自我防御機(jī)制.因此,高濃度MC-LR使P. putida處于不利環(huán)境,激發(fā)并積累大量活性氧自由基,毒素暴露5d后,ROS含量超過(guò)空白對(duì)照將近2倍多,對(duì)細(xì)胞的氧化脅迫程度大大加深.

圖3　MC-LR作用下P. putida細(xì)胞丙二醛的變化Fig.3 Effect of MC-LR on MDA content of P. putida

膜脂過(guò)氧化是藻毒素誘導(dǎo)氧化損傷的另一個(gè)表征[23].由圖3可知,對(duì)照組的膜脂過(guò)氧化程度(以MDA含量表示)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)階段保持較低水平,這與ROS的形成相似.利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)毒素處理組MDA含量的變化和ROS含量變化情況作相關(guān)性分析,得出其相關(guān)性為0.959,在0.01水平上顯著正相關(guān),說(shuō)明P. putida細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的程度與ROS的變化也存在一致性,均受到MC-LR劑量效應(yīng)的影響與時(shí)間效應(yīng)的累積作用.這是因?yàn)楦邼舛鹊腗C-LR具有很強(qiáng)的生物毒性,能通過(guò)產(chǎn)生活性氧來(lái)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,使得細(xì)胞受到氧化脅迫[24],影響細(xì)胞的活性,細(xì)胞功能遭到破壞,導(dǎo)致活性氧自由基ROS的升高和積累,并發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用,造成細(xì)胞膜電位的去極化損傷和通透性的變化,從而使膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的含量增加,這些結(jié)果與Ding等[12]的研究是一致的.

2.3 MC-LR對(duì)P. putida細(xì)胞抗氧化性酶活的影響

超氧化物歧化酶(SOD)是普遍存在于生物中的抗膜脂質(zhì)過(guò)氧化的保護(hù)性酶.研究表明,高濃度的污染物能夠?qū)е录?xì)胞內(nèi)活性氧自由基的過(guò)度積累,并引起氧化脅迫,造成細(xì)胞質(zhì)膜系統(tǒng)脂質(zhì)和蛋白的過(guò)氧化失活,并導(dǎo)致DNA等斷裂,最終使細(xì)胞發(fā)生死亡[19].而SOD能快速將超氧陰離子自由基氧化還原為H2O2和O2,H2O2則進(jìn)一步經(jīng)抗氧化酶分解為H2O和O2,從而限制自由基的過(guò)量積累,消除活性氧自由基對(duì)細(xì)胞的傷害.

圖4　MC-LR對(duì)P. putida細(xì)胞超氧化物歧化酶的影響Fig.4 Effect of MC-LR on SOD activity of P. putida

如圖4所示,在空白對(duì)照體系中,SOD酶活性處于比較平穩(wěn)的狀態(tài),在0～2d有略微上升,但波動(dòng)不大,3d以后略有下降,說(shuō)明在空白體系中SOD酶沒(méi)有受到顯著誘導(dǎo)或抑制作用,變化不明顯.而在添加MC-LR的體系中,P. putida受到氧化脅迫,由2.2可知,細(xì)胞內(nèi)氧自由基濃度上升,誘導(dǎo)抗氧化酶系統(tǒng)做出反應(yīng),因此,在0～2d SOD酶活性也會(huì)隨著上升,以清除胞內(nèi)自由基,減輕細(xì)胞損傷.而隨著藻毒素暴露時(shí)間的延長(zhǎng),從第2d開(kāi)始,SOD酶活性出現(xiàn)明顯的下降(P<0.05).由于細(xì)胞內(nèi)氧自由基濃度超過(guò)一定的范圍,抗氧化體系酶活不能及時(shí)清除,一方面,SOD與MC-LR相結(jié)合,參與了MC-LR的解毒和ROS的清除[25],消耗大量的SOD;另一方面,過(guò)量的自由基會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的氧化脅迫,破壞細(xì)胞,損傷細(xì)胞功能,使得抗氧化體系酶活性降低,SOD供應(yīng)不足[9],最終導(dǎo)致SOD整體活性下降,且MC-LR濃度越高,下降越明顯.

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)合前人研究,可以得出,菌體抗氧化酶活可能受到誘導(dǎo)而升高,也有可能受到抑制,對(duì)于一定濃度范圍內(nèi)的MC-LR作用,P. putida細(xì)胞表現(xiàn)出主動(dòng)響應(yīng),而當(dāng)污染物濃度過(guò)高時(shí),表現(xiàn)為對(duì)毒素的被動(dòng)脅迫.

2.4 MC-LR對(duì)P. putida細(xì)胞生物量的影響

本實(shí)驗(yàn)采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)和絕對(duì)計(jì)數(shù)管(TruCount tube)相結(jié)合,對(duì)培養(yǎng)體系中的P. putida生物量進(jìn)行定量檢測(cè).該方法是利用特殊熒光信號(hào)對(duì)懸液中的單細(xì)胞或生物粒子進(jìn)行標(biāo)記,再通過(guò)流式細(xì)胞儀對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)和分析,從而實(shí)現(xiàn)高速、逐一的細(xì)胞定量分析和分選[26],比傳統(tǒng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)方法速度更快,精度更高,且更準(zhǔn)確無(wú)誤.

圖5　絕對(duì)計(jì)數(shù)流式檢測(cè)(0d)Fig.5 Flow cytometry diagram of P. putida　A．對(duì)照; B. 0.5mg/L MC-LR; C. 2.5mg/L MC-LR

圖5為流式細(xì)胞儀熒光檢測(cè)結(jié)果圖,圖中熒光信號(hào)由兩部分構(gòu)成,其中R1部分為絕對(duì)計(jì)數(shù)管中微球的熒光信號(hào),R2部分為檢測(cè)樣品中P. putida的熒光信號(hào).由于絕對(duì)計(jì)數(shù)管中微球的數(shù)量為已知量,因此,通過(guò)樣品信號(hào)和微球信號(hào)的對(duì)比,即可計(jì)算出樣品中P. putida的數(shù)量,再通過(guò)樣品的稀釋倍數(shù)換算,便可得出培養(yǎng)體系中P. putida的準(zhǔn)確生物量.

MC-LR對(duì)體系中P. putida細(xì)胞生物量的影響如圖6所示,在培養(yǎng)過(guò)程中P. putida細(xì)胞的生物量變化情況可以反映出菌體對(duì)MC-LR作用的響應(yīng).由圖可知,體系中P. putida細(xì)胞的數(shù)目均呈下降趨勢(shì).在空白體系中,當(dāng)P. putida 從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,由于環(huán)境的變化及外界營(yíng)養(yǎng)的突然匱乏,導(dǎo)致菌體短時(shí)間內(nèi)適應(yīng)較差,從而發(fā)生菌體失活或死亡破裂等情況,使得細(xì)胞數(shù)目略有減少;而隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng),越來(lái)越多細(xì)胞進(jìn)入衰老期,死亡破裂的細(xì)胞逐漸增多,導(dǎo)致體系中P. putida的生物量進(jìn)一步減少.

圖6　MC-LR對(duì)體系中 P. putida 細(xì)胞數(shù)目的影響Fig.6 Effect of MC-LR on biomass of P. putida

而MC-LR的加入,使得上述情況變得更加明顯,且加入的MC-LR濃度不同,對(duì)P. putida生物量的影響作用也不同,且差異具有顯著性(P< 0.05).當(dāng)向體系中加入0.5mg/L的MC-LR時(shí),與空白對(duì)照相比,菌體生物量有略微的下降,這是由于污染物對(duì)P. putida細(xì)胞具有脅迫作用,加速了細(xì)胞的衰亡,使菌體細(xì)胞提前進(jìn)入衰亡期,但是當(dāng)污染物濃度處于較低水平時(shí),其影響作用也較小;而當(dāng)加入體系中的MC-LR濃度提高到2.5mg/L 時(shí),污染物的毒性脅迫作用進(jìn)一步加強(qiáng),表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng).P. putida在高濃度MC-LR的毒害下,活性降低并發(fā)生細(xì)胞凋亡[12],細(xì)胞膜通透性逐漸增大,細(xì)胞完整性遭到破壞,且隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng),污染物作用的時(shí)間效應(yīng)加劇了細(xì)菌的死亡和消融,從而使得P. putida生物量迅速減少.

3 結(jié)論

3.1 MC-LR作用于P. putida的細(xì)胞質(zhì)膜,使細(xì)胞質(zhì)膜通透性增大,細(xì)胞遭受損傷,細(xì)胞的完整性遭到破壞.

3.2 MC-LR可引起細(xì)胞ROS含量的增多和積累,使P. putida遭受氧化脅迫,繼而發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用,使膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的含量增加.P. putida細(xì)胞膜脂過(guò)氧化的程度與ROS的變化也存在一致性,均受到MC-LR劑量效應(yīng)的影響與時(shí)間效應(yīng)的累積作用.

3.3 對(duì)于低濃度(0.5mg/L)的MC-LR作用,P. putida細(xì)胞表現(xiàn)出主動(dòng)響應(yīng),細(xì)胞抗氧化酶SOD誘導(dǎo)升高;而當(dāng)污染物濃度過(guò)高時(shí)(2.5mg/L),其毒性脅迫作用增強(qiáng),SOD酶活性受到抑制而降低,且導(dǎo)致P. putida生物量的減少.

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Response of Pseudomonas putida cells to MC-LR stress.

DENG Ting-jin1, YIN Hua1*, YE Jin-shao2, PENG Hui3, LIU Zhi-chen1(1.Key Laboratory on Pollution Control and Ecosystem Restoration in Industry Clusters, Ministry of Education College of Environment and Energy, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China；2.College of Environment, Jinan University, Guangzhou 510632, China；3.Department of Chemistry, Jinan University, Guangzhou 510632, China). China Environment Science, 2016,36(2)：603～609

Abstract：The cell integrity and biomass changes of Pseudomonas putida, a MC-LR degrading bacterium, were studied by inoculating 1.0g/L bacterium into systems with different concentrations of MC-LR. The oxidative stress of MC-LR on bacterial cell and the responses of antioxidase were also investigated. The results showed that membrane permeability of P. putida increased under the influence of MC-LR, causing membrane damage, which resulted in the outflow of intracellular substances and the destruction of cell integrity. Also, MC-LR could induce the oxidative stress on the cells of P. putida. With prolonged exposure to MC-LR, reactive oxygen species (ROS) and malondialdehyde (MDA), a product of membrane lipid peroxidation, evidently accumulated in the system, and had obvious dose-effect relationship. Under the effect of MC-LR, the activity of superoxide dismutase (SOD) increased first and then declined, exhibiting an active response to MC-LR of low level. However, after contacting higher concentrations (2.5mg/L) of MC-LR for 5d, ROS accumulation was so high as to cause damage to the metabolism of cells. As a result, SOD activity was suppressed and cells suffered mass mortality, and the biomass decreased by 50％ compared with the control.

Key words：microcystin-LR；Pseudomonas putida；oxidative stress；biomass；toxicity

作者簡(jiǎn)介：鄧庭進(jìn)(1989-),男,湖南郴州人,華南理工大學(xué)碩士研究生,主要研究方向?yàn)樗廴镜奈⑸镄迯?fù).

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金委-廣東省聯(lián)合基金重點(diǎn)項(xiàng)目(U0933002);廣東省自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目(S2013020012808)

收稿日期：2015-07-02

中圖分類號(hào)：X172

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-6923(2016)02-0603-07