李曉莉,　李曉敏,　劉金鑫,　楊久琳,　張　巖

(上海理工大學 系統(tǒng)生物醫(yī)學研究中心,上?！?00093)

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去卵巢合并單側(cè)輸尿管結(jié)扎誘導小鼠腎臟病變的研究

李曉莉,李曉敏,劉金鑫,楊久琳,張巖

(上海理工大學 系統(tǒng)生物醫(yī)學研究中心,上海200093)

摘要：為研究去卵巢合并單側(cè)輸尿管結(jié)扎引起小鼠腎臟的病理變化及可能機制,選取C57BL/6J雌性小鼠為研究對象,分別設立對照組和模型組.手術3周后,取腎臟樣本.使用H&E,Masson’s Trichrome兩種方法進行腎石蠟切片染色,通過RT-PCR技術檢測腎纖維化相關因子TGF-β,CTGF,VEGF,fibronectin,炎癥因子MCP-1,RANTES,腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)組分腎素(renin)、腎素受體(renin receptor)、血管緊張素原(AGT)的mRNA表達.結(jié)果顯示,模型組小鼠腎小球萎縮，腎小管腔隙體積增加、膨大，腎小管間質(zhì)纖維化.模型組小鼠腎臟fibronectin,MCP-1,RANTES的mRNA表達都顯著上調(diào),RAS組分renin receptor的基因表達顯著上調(diào).研究表明,去卵巢合并單側(cè)輸尿管結(jié)扎通過上調(diào)腎臟腎素受體表達,誘發(fā)腎臟纖維化與炎癥反應.

關鍵詞：去卵巢; 單側(cè)輸尿管結(jié)扎; 腎臟

單側(cè)輸尿管結(jié)扎作為誘導梗阻性腎病的研究方法在雄性小鼠中已得到廣泛應用[1-3].最近的實驗數(shù)據(jù)顯示,雌激素具有重要的保護腎功能的作用[4],雌激素代謝系統(tǒng)紊亂易引起女性患慢性腎臟病[5].雌激素受體基因敲除小鼠生長到9月齡時即發(fā)生腎小球纖維化,而雌激素類似物17β-雌二醇通過作用于細胞外信號,調(diào)節(jié)激酶(ERK)信號通路抑制由TGF-β或TNF-α刺激的腎小球足細胞損傷與凋亡[6],選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑Raloxifene顯示較好的腎保護作用[7].以上研究都表明雌激素具有重要的調(diào)控腎組織形態(tài)、生理功能的作用.

中老年婦女由于絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平顯著下降,導致患有慢性腎臟病的風險提高.本文通過建立雌激素缺乏狀態(tài)下行單側(cè)輸尿管結(jié)扎術,引起小鼠腎臟的病理變化,并對其可能機制進行初步探索.對該問題的研究與闡述,有助于認識絕經(jīng)后婦女發(fā)生慢性腎臟病的組織病變特征,同時,對于相關藥物研發(fā)提供了潛在的實驗動物模型.

1材料與方法

1.1試劑與儀器

1.1.1試劑

H&E試劑從上海太陽生物技術有限公司購得.Masson三色染色試劑盒從南京森貝伽生物科技有限公司購得.引物均由上海賽百盛基因技術有限公司合成.去除植物雌激素的動物飼料AIN-93M由美國Research Diets公司制備與提供.RNA抽提試劑Trizol、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶由美國Invitrogen公司購得,其他RT-PCR試劑從Fermentas公司購得.

1.1.2儀器

勻漿器(Miccra,德國);常規(guī)PCR儀(Applied Biosystem,美國);凝膠成像系統(tǒng)(SynGene,英國);正置熒光顯微鏡(Leica,德國);超微量紫外、可見分光光度計(Thermo,美國).

1.2動物處理

3月齡C57BL/6J雌性小鼠,體重19～21 g.適應環(huán)境1周后,根據(jù)體重隨機分為以下2組:假手術組(n= 6);去卵巢合并單側(cè)輸尿管結(jié)扎組(n= 7).實驗期間,所有動物喂飼不含植物雌激素的飼料AIN-93M.術后3周處死,迅速取出雙側(cè)腎臟,一份放入4%甲醛固定液待組織形態(tài)檢測,另一份放入1.5 mL離心管并于-80 ℃保存.

1.3提取RNA

將腎臟置于1 mL Trizol中,通過勻漿器碾碎,根據(jù)說明書操作步驟提取總RNA.經(jīng)超微量紫外分光光度計測定RNA濃度,并測定260,280 nm處吸光度(A)值,A260/A280的比值在1.8～2.0之間,表明該RNA質(zhì)量較好.

1.4RT-PCR

取4 μg總RNA于20 μL反應體系內(nèi),經(jīng)M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶制備cDNA,擴增腎纖維化相關因子TGF-β,CTGF,VEGF,fibronectin,炎癥因子MCP-1,RANTES,以及腎素-血管緊張素系統(tǒng)組分腎素(renin)、腎素受體(renin receptor,RR)血管緊張素原(AGT),以GAPDH作為內(nèi)參基因.加1 μL cDNA模板于20 μL PCR反應體系內(nèi),反應程序最初于94 ℃變性3 min開始,最后于72 ℃延伸2 min結(jié)束.中間PCR循環(huán)包括:變性94 ℃、15 s;退火56 ℃、20 s;延伸72 ℃、20 s.PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳后,使用凝膠成像系統(tǒng)檢測基因表達、拍照并定量.

1.5腎臟組織形態(tài)學檢測

1.5.1切片制備

腎臟由甲醛溶液取出,經(jīng)脫水、透明、浸蠟處理后進行石蠟包埋,蠟塊完全凝固后放入-20 ℃?zhèn)溆?切3 μm的樣本切片,展平,烘干備用.

1.5.2蘇木精&伊紅(H&E)染色

將切片依次放入二甲苯、濃度梯度的乙醇(100%,90%,70%),隨后，放入蘇木精水溶液中染色1 min.染完蘇木精后,用蒸餾水洗去切片上多余的染色劑,進行伊紅染色.完成染色后的片子快速經(jīng)由低濃度到高濃度的酒精進行脫水,最后經(jīng)二甲苯使切片透明.切片干燥后用中性樹脂和蓋玻片進行封片.待樹脂干燥后,即在正置顯微鏡下觀察并拍照.

1.5.3Masson’s Trichrome染色

同上經(jīng)脫蠟處理后,根據(jù)說明書操作步驟將脫完蠟的切片依次放入Masson’s Trichrome染色試劑盒各組分中進行染色.完成染色的片子經(jīng)脫水、透明、封片處理,待樹脂干燥后在正置顯微鏡下觀察及拍照.

1.6統(tǒng)計學方法

2實驗結(jié)果

2.1腎組織切片H&E染色

腎組織石蠟切片經(jīng)H&E染色并在鏡下觀察(見圖1),發(fā)現(xiàn)模型組小鼠腎小球明顯萎縮(a),使得腎小球腔隙增加(b),同時,手術處理后的小鼠由于輸尿管結(jié)扎,引起腎小管腔隙體積增加、膨大(c).

圖1　腎組織石蠟切片蘇木精&伊紅染色

2.2腎組織切片Masson’s Trichrome染色

腎組織石蠟切片經(jīng)Masson’s Trichrome染色并在鏡下觀察(見圖2).相對于對照組,發(fā)現(xiàn)模型組小鼠腎小管間質(zhì)較多處出現(xiàn)藍色陽性信號,表明模型組小鼠腎間質(zhì)纖維化嚴重.

圖2　腎組織石蠟切片Masson’s Trichrome染色

2.3腎組織纖維化因子、炎癥因子的基因表達

纖維粘連蛋白fibronectin是組織纖維化的指標,而單核細胞趨化因子-1(MCP-1)、趨化因子RANTES參與腎臟炎癥反應、介導白細胞的游走和浸潤.基因表達檢測結(jié)果顯示,模型組小鼠腎臟fibronectin(P=0.031),MCP-1(P=0.015),RANTES(P= 0.029)的mRNA表達都顯著上調(diào)(見圖3),而前纖維化因子TGF-β,CTGF,VEGF的基因表達在兩組間的差異不顯著(數(shù)據(jù)未提供).

2.4腎組織腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)組分基因表達

腎組織RAS組分RR，AGT,renin的基因表達檢測結(jié)果顯示,模型組小鼠腎臟RR的基因表達顯著上調(diào)(見圖4,P= 0.035),但AGT，renin在兩實驗組間的表達沒有顯著差異.

圖3　腎臟纖維化因子、炎癥因子的基因表達

圖4　腎臟RAS組分的基因表達

3討論

絕經(jīng)后婦女由于體內(nèi)雌激素水平顯著下降,性激素系統(tǒng)代謝紊亂,是多種慢性病如骨質(zhì)疏松、心血管疾病、糖尿病等發(fā)生、發(fā)展的主要誘因[8-9].近來,研究顯示雌激素缺乏提高了女性患慢性腎臟病的風險[5].本文通過雙側(cè)去卵巢術作為模擬絕經(jīng)后婦女體內(nèi)雌激素缺乏的實驗模型,并結(jié)合單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)誘導梗阻性腎病研究去卵巢小鼠腎臟病變特征以及可能的病理機制.

本研究顯示,去卵巢合并UUO術后3周,由于輸尿管結(jié)扎,尿液不能順利排出,在管腔中滯留,造成小鼠腎小管膨脹、擴張.同時,發(fā)現(xiàn)腎小球嚴重萎縮,腎小管間質(zhì)纖維化嚴重,說明去卵巢合并UUO后,腎小球、腎間質(zhì)都發(fā)生顯著病理改變,這些同去卵巢合并糖尿病腎病大鼠[10]、去卵巢DSS(高敏感型鹽攝入Dahl)大鼠[11]、去卵巢合并腎性高血壓大鼠[12]的腎臟病理特征類似.本文研究發(fā)現(xiàn)去卵巢合并單側(cè)輸尿管結(jié)扎小鼠模型同樣能夠較好地模擬臨床腎臟病變.

本研究從(前)纖維化因子、炎癥因子、腎素-血管緊張素系統(tǒng)等角度探討了去卵巢合并UUO致腎臟病理改變的可能機制.研究發(fā)現(xiàn),去卵巢合并UUO上調(diào)腎纖維粘連蛋白fibronectin表達,但并沒有引起前纖維化因子TGF-β,CTGF,VEGF的異常表達,這與之前報道的UUO雄性小鼠其腎臟前纖維化因子表達顯著上調(diào)的結(jié)果不一致[1].因此,今后的研究有必要關注UUO致腎臟病變的分子通路是否存在性別差異性.

研究組前期研究顯示,RAS活性升高能夠誘發(fā)腎臟的纖維化、炎癥反應[1,13-14].此外,最近的許多研究都證明,腎素受體在腎臟疾病中具有重要意義[15].在糖尿病引起的終末期腎臟病患者的腎臟中,RR表達上調(diào)[16].RR表達上調(diào)還能夠刺激促纖維化因子的表達,加重腎臟纖維化[17].結(jié)合本實驗結(jié)果,去卵巢合并UUO誘導RR表達升高,而RR介導了腎素/腎素原的致組織病變的生物學作用[18].因此,去卵巢合并UUO通過上調(diào)RR表達,進而誘發(fā)由fibronectin介導的腎臟纖維化的發(fā)生,同時,導致炎癥趨化因子MCP-1,RANTES表達增強,提示去卵巢合并UUO潛在的致腎臟炎癥的作用.

因此,本實驗建立的去卵巢合并UUO的小鼠模型表現(xiàn)出臨床腎臟病變的主要特征,去卵巢合并UUO主要通過上調(diào)腎素受體表達,誘發(fā)腎臟纖維化與炎癥反應,這為今后的藥物研發(fā)提供了潛在的作用靶點.

參考文獻：

[1]Zhang Y,Kong J,Deb D K,et al.Vitamin D receptor attenuates renal fibrosis by suppressing the renin-angiotensin system[J].Journal of the American Society of Nephrology,2010,21(6):966-973.

[2]Zhang Y,Wu S Y,Gu S S,et al.Changes of renal vitamin D metabolic enzyme expression and calcium transporter abundance in obstructive nephropathy[J].Nephrology,2011,16(8):710-714.

[3]Gu S S,Zhang Y,Chen X,et al.Trabecular bone deterioration at the greater trochanter of mice with unilateral obstructive nephropathy[J].Asian Journal of Andrology,2013,15(4):564-566.

[4]Hutchens M P,Kosaka Y,Zhang W,et al.Estrogen-mediated renoprotection following cardiac arrest and cardiopulmonary resuscitation is robust to GPR30 gene deletion[J].PLoS One,2014,9(6):e99910.

[5]Satta E,Magno C,Galì A,et al.Sexual dysfunction in women with diabetic kidney[J].International Journal of Endocrinology,2014,2014:346834.

[6]Doublier S,Lupia E,Catanuto P,et al.Testosterone and 17β-estradiol have opposite effects on podocyte apoptosis that precedes glomerulosclerosis in female estrogen receptor knockout mice[J].Kidney International,2011,79(4):404-413.

[7]Melamed M L,Blackwell T,Neugarten J,et al.Raloxifene,a selective estrogen receptor modulator,is renoprotective:a post-hoc analysis[J].Kidney International,2011,79(2):241-249.

[8]Goyal S,Baruah M,Devi R,et al.Study on relation of metabolic syndrome with menopause[J].Indian Journal of Clinical Biochemistry,2013,28(1):55-60.

[9]Kumawat M,Sharma T K,Singh N,et al.Study of changes in antioxidant enzymes status in diabetic post menopausal group of women suffering from cardiovascular complications[J].Clinical Laboratory,2012,58(3/4):203-207.

[10]Mankhey R W,Bhatti F,Maric C.17β-Estradiol replacement improves renal function and pathology associated with diabetic nephropathy[J].American Journal of Physiollogy Renal Physiology,2005,288(2):F399-F405.

[11]Maric C,Sandberg K,Hinojosa-Laborde C.Glomerulosclerosis and tubulointerstitial fibrosis are attenuated with 17β-estradiol in the aging Dahl salt sensitive rat[J].Journal of the American Society of Nephrology,2004,15(6):1546-1556.

[12]Ji H,Menini S,Zheng W,et al.Role of angiotensin-converting enzyme 2 and angiotensin(1-7)in 17β-oestradiol regulation of renal pathology in renal wrap hypertension in rats[J].Experimental Physiology,2008,93(5):648-657.

[13]Zhang Y,Deb D K,Kong J,et al.Long-term therapeutic effect of vitamin D analog Doxercalciferol on diabetic nephropathy:strong synergism with AT1 receptor antagonist[J].American Journal of Physiology Renal Physiology,2009,297(3):F791-F801.

[14]Zhang Z Y,Zhang Y,Ning G,et al.Combination therapy with AT1 receptor blocker and vitamin D analog markedly ameliorates diabetic nephropathy:blockade of compensatory renin increase[J].Proceedings of the National Academy Sciences of United States of America,2008,105(41):15896-15901.

[15]杜然,丁國華.腎素(原)受體及其與腎臟疾病相關的研究進展[J].醫(yī)學研究雜志,2013,42(7):174-176.

[16]Takahashi K,Yamamoto H,Hirose T,et al.Expression of(pro)renin receptor in human kidneys with end-stage kidney disease due to diabetic nephropathy[J].Peptides,2010,31(7):1405-1408.

[17]Feldt S,Batenburg W W,Mazak I,et al.Prorenin and renin-induced extracellular signal-regulated kinase 1/2 activation in monocytes is not blocked by aliskiren or the handle-region peptide[J].Hypertension,2008,51(3):682-688.

[18]Zhang Y,Wang Y L,Chen Y Z,et al.Inhibition of renin activity by aliskiren ameliorates diabetic nephropathy in type 1 diabetes mouse model[J].Journal Diabetes Mellitus,2012,2(3):353-360.

Pathological Effects of Ovariectomy Combined with Unilateral Ureteral Obstruction on Kidney of Mice

LI Xiaoli,LI Xiaomin,LIU Jinxin,YANG Jiulin,ZHANG Yan

(Center for Systems Biomedical Sciences,University of Shanghai for Science and Technology,Shanghai 200093,China)

Abstract：To study the pathological change and the potential mechanism of ovariectomy with unilateral ureteral obstruction on kidney of mice,the female C57BL/6J mice were divided into a control group and a model group.The kidney samples were obtained in 3 weeks after operation.The paraffin kidney slices were stained by H&E and Masson’s Trichrome.The mRNA expressions of fibrotic factors,including TGF-β,CTGF,VEGF and fibronectin,the inflammation factors including MCP-1 and RANTES,and the renin-angiotensin system(RAS)components including renin,renin receptor,AGT,were measured by RT-PCR.The results show that,for the mice of model group,the atrophy of glomerular,the enhancement and inflation of renal tubules,and the tubular interstitial fibrosis can be observed and the mRNA expression of fibronectin,MCP-1,RANTES and renin receptor in kidney are also obviously increased.In conclusion,the ovariectomy combined with unilateral ureteral obstruction may induce the renal fibrosis and inflammation by up-regulating the renin receptor in kidney.

Keywords：ovariectomy; unilateral ureteral obstruction; kidney

中圖分類號：R 361+.2; R 364.5

文獻標志碼：A

通信作者：張巖(1978-),男,副研究員.研究方向:藥理學.E-mail:medicineyan@aliyun.com

基金項目：上海市科委浦江人才計劃資助項目(10PJ1407700)

收稿日期：2014-10-11

DOI：10.13255/j.cnki.jusst.2016.01.017

文章編號：1007-6735(2016)01-0098-05

第一作者： 李曉敏(1990-),女,碩士研究生.研究方向:藥理學.E-mail:1187117257@qq.com