張　瑋　李樹清

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科，云南　昆明　650032)

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糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶在缺血大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中的保護(hù)作用

張瑋李樹清1

(昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科，云南昆明650032)

〔摘要〕目的探討糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶1(SGK1)在大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中缺血再灌注中的保護(hù)作用。方法將海馬神經(jīng)元細(xì)胞根據(jù)氧糖剝奪(腦缺血)誘導(dǎo)時(shí)間不同分為正常海馬神經(jīng)元細(xì)胞組，氧糖剝奪誘導(dǎo)120 min組、氧糖剝奪誘導(dǎo)120 min后正常恢復(fù)10 min組、氧糖剝奪誘導(dǎo)120 min后正?；謴?fù)30 min組和氧糖剝奪誘導(dǎo)120 min后正常恢復(fù)60 min組。采用Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)對樣品進(jìn)行檢測，區(qū)分實(shí)驗(yàn)樣本中正常、壞死、凋亡細(xì)胞。結(jié)果隨著氧糖剝奪(腦缺血)時(shí)間的延長而神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的數(shù)量呈現(xiàn)不斷增加的趨勢；而隨著氧糖剝奪(腦缺血)時(shí)間的延長，SGK1在蛋白水平的表達(dá)出現(xiàn)不斷下降的趨勢；和對照組相比其神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的數(shù)量明顯減少；SGK1蛋白的過表達(dá)受到抑制。結(jié)論SGK1可以有效減少氧糖剝奪SD大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡，而SGK1調(diào)控神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的模式是通過PI3K/Akt/GSK3β信號通路來介導(dǎo)。

〔關(guān)鍵詞〕糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶1；神經(jīng)元細(xì)胞；缺血再灌注

研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注損傷是對組織造成損傷的主要因素，即再次恢復(fù)血液供應(yīng)，缺血組織灌注時(shí)造成的微血管和實(shí)質(zhì)器官的損傷〔1～3〕，本研究旨在探討糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的蛋白激酶1(SGK1)在大腦缺血再灌注過程中可能的保護(hù)機(jī)制。

1資料和方法

1.1樣本來源本研究用細(xì)胞為培養(yǎng)后的1日齡SD大鼠神經(jīng)元細(xì)胞。對SD大鼠采用椎脫臼處死法處死，用75%酒精浸泡消毒3～5 min；取出海馬神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的額分離及培養(yǎng)選用1日齡SD大鼠2只。通過對大鼠進(jìn)行消毒后處死，獲取了SD大鼠的海馬細(xì)胞，并進(jìn)行了體外培養(yǎng)。

1.2.2已分離培養(yǎng)的SD大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的免疫熒光鑒定采用海馬神經(jīng)元特異性抗微管相關(guān)蛋白2(MAP2)抗體免疫熒光來顯示分離和培養(yǎng)的結(jié)果，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，記錄每個(gè)視野中染色陽性的細(xì)胞占所有細(xì)胞的比值，超過95%的為陽性。

1.2.3通過氧糖剝奪誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡將海馬神經(jīng)元細(xì)胞根據(jù)氧糖剝奪誘導(dǎo)時(shí)間不同分為正常海馬神經(jīng)元細(xì)胞組，氧糖剝奪誘導(dǎo)120 min組、氧糖剝奪誘導(dǎo)120 min后正常恢復(fù)10 min組、氧糖剝奪誘導(dǎo)120 min后正常恢復(fù)30 min組和氧糖剝奪誘導(dǎo)120 min后正?；謴?fù)60 min組。采用Annexin V-FITC/PI流式細(xì)胞術(shù)對樣品進(jìn)行檢測，區(qū)分實(shí)驗(yàn)樣本中正常、壞死、凋亡細(xì)胞。

1.2.4Western印跡技術(shù)檢測上述步驟中各種細(xì)胞的SGK1表達(dá)實(shí)驗(yàn)對樣本進(jìn)行總蛋白提取與定量，根據(jù)SGK1的mRNA序列(序列號：NM_001193568.1)設(shè)計(jì)了該基因的全基因引物，獲得目的基因SGK1模板，構(gòu)建質(zhì)粒載體，并進(jìn)行過表達(dá)效率檢測。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS16.0進(jìn)行分析。

2結(jié)果

2.1氧糖剝奪誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡及SGK1表達(dá)情況NC代表未經(jīng)任何處理的培養(yǎng)過的SD大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞、OGD表示對培養(yǎng)過的SD大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行了120 min的氧糖剝奪，而10 min組、30 min組和60 min組則表示培養(yǎng)過的SD大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞在進(jìn)行了120 min的氧糖剝奪之后分別進(jìn)行了10 min、30 min和60 min的氧糖正常供給。各組凋亡情況及SGK1表達(dá)見表1，圖1。

2.2SGK1基因蛋白水平的過表達(dá)能阻止氧糖剝奪120 min的培養(yǎng)過的SD大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡與NC組比較，轉(zhuǎn)染SGK1過表達(dá)載體的細(xì)胞內(nèi)，可以SGK1導(dǎo)致mRNA的表達(dá)增加約5倍；在轉(zhuǎn)染了SGK1過表達(dá)病毒載體的細(xì)胞中，SGK1基因在蛋白水平的表達(dá)約超過未處理組的2.5倍。海馬神經(jīng)元分別轉(zhuǎn)染了空載體或編碼SGK1基因的表達(dá)載體；在轉(zhuǎn)染24 h后，SGK1在基因水平和蛋白質(zhì)水平的變化情況和NC相比具有顯著性差異。海馬神經(jīng)元分別轉(zhuǎn)染了空載體或編碼SGK1基因的表達(dá)載體24 h，然后進(jìn)行120 min的氧糖剝奪，然后使之恢復(fù)60 min；運(yùn)用流式細(xì)胞儀分析用膜聯(lián)蛋白V/PI雙染色法來檢測細(xì)胞凋亡情況。通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測SGK1和活化的金屬基質(zhì)蛋白酶(caspase)-3蛋白水平差異情況。見表2，表3，圖2。

表1　各組大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡及SGK1蛋白表達(dá)

圖1　SD大鼠SGK1表達(dá)情況

觀察指標(biāo)NC組Voctor組SGK1組F值P值基因水平1.00±0.131.02±0.122.71±0.6324.311<0.001蛋白水平1.05±0.101.03±0.115.43±1.3631.005<0.001

表3　SGK1過表達(dá)可保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞在

3討論

缺血性腦血管病是目前導(dǎo)致人類，尤其是老年人致死和致殘率最高的疾病之一。對于缺血性腦血管病當(dāng)前最主要的治療原則是對缺血區(qū)域進(jìn)行血液灌注〔4〕；然而近期發(fā)現(xiàn)對缺血性腦血管疾病的缺血再灌注非但沒有使組織功能恢復(fù)，反而會導(dǎo)致缺血所致的功能障礙和結(jié)構(gòu)破壞進(jìn)一步加重，這種現(xiàn)象即缺血再灌注損傷〔5〕，在各種模式生物〔6〕和人類〔7〕研究中都得到了一致的結(jié)果。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對體外培養(yǎng)的SD大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行氧糖剝奪可導(dǎo)致SD海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡數(shù)量的增加，而之后隨著再恢復(fù)氧糖供應(yīng)時(shí)間的增加，神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的數(shù)據(jù)則呈現(xiàn)進(jìn)一步加劇的趨勢。而SGK1的過表達(dá)則可以抑制SD大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞因氧糖剝奪導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡的趨勢。

另外本結(jié)果顯示，SGK1的過表達(dá)能顯著降低因氧糖剝奪導(dǎo)致的SD大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的數(shù)量，這一結(jié)果得到了熒光輔助細(xì)胞篩選分析的支持，提示Akt和GSK-β可對經(jīng)受缺血再灌注海馬神經(jīng)元細(xì)胞能起到保護(hù)作用。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-11-03修回〕

(編輯袁左鳴)

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〔中圖分類號〕R74

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)06-1300-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.06.009

通訊作者：李樹清(1953-)，男，博士生導(dǎo)師，教授，主要從事腦缺血與腦保護(hù)的研究。

基金項(xiàng)目：云南省科技廳應(yīng)用基礎(chǔ)研究基金(No.2013FB131)；云南省教育廳科研基金(No.2013Y281)

1昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理教研室

第一作者：張瑋(1975-)，男，博士，副主任醫(yī)師，主要從事急診醫(yī)學(xué)方面的研究。