何 偉，楊 華，崔元玗，孫曉軍，許建軍

(新疆農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091)

新疆番茄晚疫病原菌交配型鑒定及其對甲霜靈敏感性測定

何 偉，楊 華，崔元玗，孫曉軍，許建軍

(新疆農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/農(nóng)業(yè)部西北荒漠作物有害生物綜合治理重點實驗室，烏魯木齊 830091)

【目的】鑒定2011至2015年新疆阿克蘇、疏勒、葉城等地的晚疫病原菌交配型并測定病原菌對甲霜靈敏感性，掌握P.infestans種群在新疆是否有有性生殖存在，為番茄晚疫病的防治藥劑篩選和輪換，以及防治策略的制定提供科學依據(jù)。【方法】采集番茄的病害部位(病果、病葉和病莖)，在燕麥培養(yǎng)基上對其進行組織分離保存，采用對峙培養(yǎng)法鑒定保存菌株交配型，采用含藥平板法測定保存菌株敏感性?！窘Y果】阿克蘇市、疏勒縣、葉城縣和墨玉縣溫室采集樣品分離保存的37個菌株均為A1交配型，無A2交配型和自育型菌株。37個番茄晚疫病菌菌株中，敏感菌占總數(shù)的0%，中抗菌株占35.14%，抗性菌株占64.86%。抗性菌株的抗性水平都在1.8×103倍以上?！窘Y論】在自然條件下阿克蘇市、墨玉縣、葉城縣和疏勒縣等地番茄晚疫病菌沒有有性生殖發(fā)生，番茄晚疫病菌對甲霜靈具有較高抗性。

番茄晚疫??；交配型；敏感性

0 引 言

【研究意義】番茄晚疫病又稱番茄疫病，由致病疫霉(Phytophthorainfestans( Mont. ) De Bary)侵染所致。它是一種世界毀滅性的蔬菜病害，尼日利亞、日本、加拿大、美國和瑞士等國家對該病嚴重危害性均有報道。我國北京、山西、云南、貴州、山東、陜西、河南、河北等省市晚疫病普遍發(fā)生，且危害嚴重[1-3]。近年來，隨著新疆設施蔬菜規(guī)模的迅速發(fā)展，新疆設施面積不斷增加，設施蔬菜病害種類不斷增多，給新疆設施蔬菜生產(chǎn)造成嚴重損失。2011年12月和2012年3月在喀什地區(qū)英吉沙縣和疏勒縣溫室中番茄上發(fā)生的病害是由疫霉(Phytophthorainfestans)侵染引發(fā)的番茄晚疫病[4]。掌握新疆阿克蘇市、疏勒縣、葉城縣和墨玉縣等地的晚疫病原菌交配型并測定病原菌對甲霜靈敏感性，了解P.infestans種群在新疆是否有有性生殖存在，為番茄晚疫病的防治藥劑篩選和輪換，以及防治策略的制定提供科學依據(jù)。【前人研究進展】Niederhauser 等在1956年首次報道墨西哥發(fā)現(xiàn)A2 交配型，此后直到1984年，瑞士發(fā)現(xiàn) A2 交配型，隨后日本、英國、荷蘭、波蘭、美國、加拿大等國家也相繼發(fā)現(xiàn) A2 交配型的存在[5-6]。1996年，張志銘等[7]報道在北京、內(nèi)蒙、山西和云南等省區(qū)發(fā)現(xiàn)致病疫霉A2交配型，K．Y．RYU等[8]對云南省的致病疫霉進行交配型，發(fā)現(xiàn)了3個菌株為 A2交配型。楊宇紅等[9]對我國主要番茄產(chǎn)區(qū)晚疫病菌交配型進行了鑒定，結果表明目前我國番茄晚疫病菌仍以A1交配型為主，番茄晚疫病菌A2交配型僅在少數(shù)省份與地區(qū)被發(fā)現(xiàn)，并且其數(shù)量很少。甲霜靈(Metalaxyl)是苯基酰胺類殺菌劑，對卵菌具很高的活性，可有效地預防和控制晚疫病的發(fā)生，但其連續(xù)施用多年后，病原菌易產(chǎn)生抗藥性?？顾幮跃甑漠a(chǎn)生在生產(chǎn)上直接表現(xiàn)為藥效下降甚至失效，因此抗藥性發(fā)展是晚疫病防治的一個重要問題。芬蘭于1980年首次檢測到馬鈴薯晚疫病菌對甲霜靈的抗性，隨后美國、以色列、丹麥等地相繼發(fā)現(xiàn)抗藥性菌株?！颈狙芯壳腥朦c】目前，未見關于新疆番茄晚疫病菌交配型和其對甲霜靈抗性的報道，研究對新疆番茄晚疫病菌交配型和其對甲霜靈抗性進行鑒定和測定。【擬解決的關鍵問題】掌握新疆番茄晚疫病菌的交配型和其對甲霜靈抗性情況，為生產(chǎn)上藥劑篩選與防治提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣 本

2011至2015年，在番茄晚疫病發(fā)病盛期，從新疆主要番茄產(chǎn)區(qū)的溫室中采集具有典型晚疫病癥狀的莖，葉或果實，一般從每塊田地中隨機采集5～15個病樣，裝入樣本袋后迅速帶回實驗室內(nèi)進行分離。每個標樣記錄采集地點、日期、采集者、名稱等。

1.1.2 燕麥培養(yǎng)基

參照方中達的《植病研究方法》[10]，燕麥選擇性培養(yǎng)基:待基礎培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，加入利福平(20 mg/L)、氨卞青霉素(200 mg/L)和制霉菌素(100 mg/L)，混勻，倒平皿。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的分離與純化

將番茄晚疫病果或病莖用3%次氯酸鈉浸泡2～3 min，無菌水沖洗2～3次，剪取病健交界處0.5 cm2大小，放入含有抗生素的選擇性燕麥培養(yǎng)基平板上，在19～22℃條件下培養(yǎng)5～7 d，挑取菌絲在顯微鏡下觀察，并移植相應的菌塊到培養(yǎng)基上，在19～22℃條件下培養(yǎng)。并且進行純化保存[11]。

1.2.2 交配型測定

采取“對峙培養(yǎng)法”測定待測晚疫病菌菌株的交配型，用福建農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所陳慶河研究員提供的A430和P7330菌株分別作為番茄晚疫病菌A1交配型和A2交配型的標準菌株。采用直徑為5 mm打孔器打取菌齡相同的待測菌株塊與標準菌株塊，將兩菌塊相距1.5～2 cm對峙培養(yǎng)于燕麥培養(yǎng)基，于19～21℃條件下黑暗培養(yǎng)15 d左右，將培養(yǎng)平板置于顯微鏡下觀察卵孢子形成情況及結構特征。

交配型鑒定標準：與A1交配型標準菌株產(chǎn)生卵孢子的待測菌株為A2交配型；與A2交配型標準菌株產(chǎn)生卵孢子的待測菌株則為A1交配型；與A1、A2交配型標準菌株均產(chǎn)生卵孢子并且同一待測菌株兩菌塊對峙培養(yǎng)也產(chǎn)生卵孢子的待測菌株為自育菌株。

1.2.3 番茄晚疫病菌對甲霜靈的敏感性測定

1.2.3.1 甲霜靈抗性

供試菌株共37個菌株用于甲霜靈抗性測定，供試藥劑為75%甲霜靈(Metalaxyl，Ridomil又名瑞毒霉)(德國拜耳)。試驗采取生長速率法[12]，將晚疫病菌轉接在燕麥培養(yǎng)基上，在19～21℃條件下黑暗培養(yǎng)15 d左右，采用直徑5 mm的打孔器在燕麥平板上打取菌塊，分別移到含甲霜靈0、5 和100 μg/mL的燕麥平板中央，置于19～21℃培養(yǎng)，每處理重復3次，7 d后測定菌落生長量?？剐詼y定標準：含藥5和100 μg/mL平板上菌落生長量均≥40%對照生長量為抗性；兩者均≤40%，為敏感；含藥5 μg/mL平板上菌落生長量≥40%對照生長量≥含藥100 μg/mL平板上菌落生長量，為中度抗性[13]。

1.2.3.2 甲霜靈抗性水平

將所選菌株在燕麥培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)10 d，采用直徑5 mm打孔器沿菌落邊緣打取菌塊，抗性菌株分別移到含甲霜靈0、10、20、40、80、160、320 μg/mL的燕麥培養(yǎng)基平板上，敏感菌株分別移到含甲霜靈0、0.002 5、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 μg/mL的燕麥選擇性培養(yǎng)基上，置于19～21℃培養(yǎng)，每處理重復3次，7 d后測定菌落生長量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS軟件進行回歸分析，計算各菌株的EC50值，以抗性菌株的EC50值與敏感菌株的EC50值之比計算各抗性菌株的抗性水平。

2 結果與分析

2.1 番茄晚疫病交配型

對2011～2015年度在阿克蘇市、墨玉縣、疏勒縣和葉城縣采集樣本分離獲得的37個番茄晚疫病菌菌株分別與A430(A1)和P7330(A2)標準菌株進行對峙培養(yǎng)，鑒定交配型。試驗結果表明，阿克蘇市溫室番茄晚疫病菌13個菌株、疏勒縣溫室12個番茄晚疫病菌菌株和葉城縣溫室番茄晚疫病菌7個菌株、墨玉縣的5個菌株與A1交配型標準菌株對峙培養(yǎng)之后不產(chǎn)生卵孢子，但與A2交配型標準菌株對峙培養(yǎng)之后全部產(chǎn)生卵孢子，因此該37個菌株全部是A1交配型。表1

2.2 番茄晚疫病抗性

研究表明，阿克蘇市、墨玉縣、疏勒縣和葉城縣等地溫室采集分離的37個番茄晚疫病菌菌株中，敏感菌株為0株，占總數(shù)的0%，中抗菌株為13株，占35.14 %，抗性菌株為24株，占64.86%。墨玉縣溫室番茄晚疫病菌全部菌株為抗性菌株，阿克蘇市和墨玉縣番茄晚疫病菌菌株抗性菌株分別為76.93%和71.43%，疏勒縣番茄晚疫病菌菌株中抗菌株較多，所占比例為66.7%。表2

表1 不同地區(qū)番茄晚疫病菌交配型

Table 1 Mating type ofP.infestansin different areas

采集地點Collectionsites菌株數(shù)量Numberofstrains交配型MatingtypeA1A2阿克蘇市Akesu13130疏勒縣Shule12120葉城縣Yecheng770墨玉縣Moyu550

表2 不同地區(qū)番茄晚疫病菌對甲霜靈抗性測定結果

Table 2 Resistance determination results ofP.infestansto Metalaxyl in different parts

2.3 抗性菌株的抗性水平

3個抗性菌株的EC50值最低為1.417 6 g/mL，最高達1.990 4 g/mL。試驗中未出現(xiàn)敏感菌株，查閱參考文獻，以畢朝位報道中TBS-2131為敏感對照菌株[13]，其EC50值為0.000 81，求得各抗性菌株的抗性水平都在1.8×103倍以上，由此可以看出當?shù)胤淹硪卟【姿`抗性水平較高。墨玉縣番茄晚疫病菌菌株抗性水平最高，為2.5×103，疏勒縣番茄晚疫病菌菌株抗性水平最低。表3

表3 部分抗性菌株對甲霜靈抗性水平

Table 3 Resistance level of parts resistant strains toMetalaxyl

菌株編號Strainnumber采集地點Collectionsites毒力回歸方程Virulenceregressionequation相關系數(shù)RCoefficientofassociationEC50(g/mL)抗性水平Resistancelevelsl2012-7疏勒縣Y=3 9216+0 7608X0 97411 41761 8×103my2014-7墨玉縣Y=2 1685+1 4226X0 87281 99042 5×103aks2013-1阿克蘇Y=3 8445+0 6462X0 97901 78812 2×103Yc2014-3葉城縣Y=3 8632+0 6865X0 95701 75462 2×103

3 討 論

自1956年，墨西哥首次發(fā)現(xiàn)晚疫病菌A2交配型以來，荷蘭、日本、加拿大、美國、瑞士和中國等國家和地區(qū)先后發(fā)現(xiàn)A2交配型，但我國我國A2交配型總體數(shù)量很少，目前仍以A1交配型菌株為主。新疆尚未見有關晚疫病菌交配型的報道，近幾年新疆設施番茄發(fā)生番茄晚疫病，墨玉縣，葉城縣、疏勒縣和阿克蘇市番茄晚疫病菌僅有A1交配型存在，但是受分離菌株數(shù)量不多的影響，這還不能說明新疆其它地區(qū)在自然條件下沒有晚疫病菌A2交配型菌株的出現(xiàn)。要檢測新疆是否有A2交配型菌株出現(xiàn)，并進一步檢測在自然條件下是否發(fā)生了有性生殖，還需要進一步采集更多地點與更多數(shù)量的菌株，進行更多菌株交配型的鑒定與綜合分析。

番茄晚疫病的防治藥劑主要以苯酰胺類殺菌劑為主，甲霜靈的生物活性、內(nèi)吸性和持效期較同類其他化合物好，因此生產(chǎn)上被用作防治番茄晚疫病的主要藥劑，但其具有易產(chǎn)生抗藥性和作用位點單一的缺點。晚疫病菌對甲霜靈的抗性可以伴隨新的群體的產(chǎn)生或遷移而出現(xiàn)在眾多番茄產(chǎn)區(qū)[14]。新疆設施番茄晚疫病雖然是近年來新發(fā)生的一種病害，但其也存在對甲霜靈抗性的可能。研究中的番茄晚疫病菌無敏感型，多為抗性菌株，而新疆南部地區(qū)設施蔬菜用藥水平低，因此，番茄晚疫病菌對甲霜靈的抗性很可能是伴隨著群體的遷移而產(chǎn)生的。

4 結 論

目前，初步判斷新疆阿克蘇市、墨玉縣、葉城縣和疏勒縣等地番茄晚疫病菌在自然條件下沒有有性生殖的發(fā)生。番茄晚疫病菌A2交配型的出現(xiàn)將促使當?shù)胤淹硪卟【硇》N的組成更加復雜，因此，掌握當?shù)胤淹硪卟【慌湫妥兓瘜ιa(chǎn)上抗病品種的應用具有重要指導意義。

墨玉縣、和田市和阿克蘇市番茄晚疫病菌對甲霜靈具有較高抗性。新疆南疆地區(qū)未見番茄晚疫病的發(fā)生報道，現(xiàn)在發(fā)生危害嚴重，該病菌可能由于引種從外地傳來，因此檢測番茄晚疫病菌對甲霜靈的抗性，對番茄晚疫病的防治藥劑篩選和輪換，以及防治策略的制定等具有重要的指導意義。

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Fund project:Supported by the Open Fund of Key Laboratory of Integrated Management of Harmful Crop Vermin in China North-western Oasis, Ministry of Agriculture, P. R. China, (KFJJ20150101) and the Special Scientific Research Project of of Xinjiang Uygur Autonomous Region Science and Technology Program,(201130104-3)

Identification of Mating Type and Measure of Sensitivity of Metalaxyl toPhytophthorainfestansin Xinjiang

HE Wei，YANG Hua，CUI Yuan-yu， SUN Xiao-jun，XU Jian-jun

(ResearchInstituteofPlantProtection,XinjiangAcademyofAgricultural/KeyLaboratoryofIntegratedManagementofHarmfulCropVermininChinaNorth-westernOasis,MinistryofAgriculture,P.R.ChinaSciences,Urumqi830091,China)

【Objective】 This project aims to identify mating type and resistant levels ofPhytophthorainfestansto Metalaxyl in Akesu, Shule, Yecheng and master sexual reproduction existence of theP.infestanspopulation in Xinjiang from 2011 to 2015, thus providing scientific basis for medication screening and rotation for prevention and treatment of tomato late blight and the establishment of certain control strategy. provided scientific basis.【Method】Samples of tomato late blight were collected and separated by tissue preservation, and the mating type was identified by inhibitony activity in vitro to measure the resistance level by medicated tablet method.【Result】All the 37 strains of samples in Akesu, Moyu, Shule and Yecheng by separation preservation were A1 mating type, no A2 mating type and bred type. Test results of sensitive measurement of Metalaxyl showed that among the 37 tomato late blight fungus strains, the sensitive strain was 0%, the medium resistance strain was 35.14%, resistant strain was 64.86%. The resistance level of the resistance strain was higher than 1.8×103.【Conclusion】Preliminary judgment was made that there was no sexual reproduction under the natural condition in Akesu City, Moyu County, Yecheng County and Shule County at present and metalaxyl had high resistance toPhytophthorainfestans.

Phytophthorainfestans；mating type；sensitivity

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.01.003

2015-04-32

農(nóng)業(yè)部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室開放基金(KFJJ20150101) ；新疆維吾爾自治區(qū)“十二五”重大專項(201130104-3)

何偉(1980-)，男，安徽阜陽人，助理研究員，碩士，研究方向為蔬菜病蟲害防治，(E-mail)hewei_888y@yahoo.com.cn

崔元玗(1955-)，女，新疆烏魯木齊人，研究員，研究方向為蔬菜病蟲害防治，(E-mail)cuiyuanyu@126.com

S436.412

A

1001-4330(2016)01-0016-06