秦新政，楊新平，陳 競，馮 蕾

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091)

26種阿勒泰大型真菌凝集素研究

秦新政，楊新平，陳 競，馮 蕾

(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所，烏魯木齊 830091)

【目的】調(diào)查阿勒泰大型真菌中的凝集素?！痉椒ā渴褂肨ris-HCl緩沖液和Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液對15科26種阿勒泰大型真菌的子實體進(jìn)行凝集素的粗提取。采用2%兔紅細(xì)胞懸液對這些大型真菌的凝集素提取液進(jìn)行凝血活性的評價?！窘Y(jié)果】絕大多數(shù)阿勒泰大型真菌的提取液顯示出了凝血活性，其中堿竹杯傘(Clitocybealkaliviolascens)、乳菇(Lactariusdeceptivus)、皺皮疣柄牛肝菌(Leccinumduriusculum)和非白紅菇(Russulaexalbicans)4種大型真菌的凝血活性最高，這些大型真菌的凝血活性與其科屬分類無直接相關(guān)性。它們的糖特異性和熱穩(wěn)定性也差異顯著。【結(jié)論】26種阿勒泰大型真菌的凝集類提取液的絕大多數(shù)具有凝血活性，因此阿勒泰大型真菌是極具潛力的凝集素來源。

大型真菌；凝集素；凝血活性

0 引 言

【研究意義】凝集素是一類分布廣泛的非免疫起源的多價碳水化合物結(jié)合蛋白，具有以非催化的方式高度定向識別不同的糖結(jié)構(gòu)的能力[1]。由于凝集素能夠?qū)?xì)胞表面的糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行特異性結(jié)合，因此在生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，例如人ABO血型的鑒定、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)[2-4]等。動植物來源的凝集素的研究已有很多，而真菌來源的凝集素研究較少，近來的研究表明許多大型真菌來源的凝集素的糖結(jié)合特異性非常特殊，與動植物來源的凝集素有顯著不同[5]。為深入研究生物學(xué)的糖結(jié)構(gòu)，有必要發(fā)掘更多大型真菌來源的具有更高的糖結(jié)合特異性和更強(qiáng)的親和性的凝集素?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】凝集素最早從植物種子中分離得到，此后的研究發(fā)現(xiàn)凝集素廣泛存在于自然界中。Chandra等[6]建立的一個植物來源的凝集素數(shù)據(jù)庫就收集整理了來自241種植物的947種凝集素的蛋白和核酸序列。動物來源的凝集素研究也很廣泛[7]。相關(guān)研究涵蓋凝集素的核酸及蛋白序列的分析、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)以及碳水化合物結(jié)合特異性等。而真菌凝集素的研究相對較少[8]。最近的研究表明，大型真菌凝集素具有抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)功能[9,10]。凝集素分布于大型真菌菌絲體、孢子，但主要存在于子實體中，可以通過凝集素對動物或人紅細(xì)胞的凝集作用來檢測其存在[8]?！颈狙芯壳腥朦c】在世界范圍內(nèi)，大型真菌資源都未能得到充分認(rèn)識和開發(fā)。據(jù)估計，在自然界中存在14×104種大型真菌，其中只有10%是已知種屬[11]。新疆阿勒泰地區(qū)具有豐富的大型真菌資源，僅在喀納斯湖地區(qū)就發(fā)現(xiàn)了200種[12]。【擬解決的關(guān)鍵問題】從這些豐富的真菌資源中篩選高凝血活性的大型真菌，發(fā)掘新的真菌凝集素，對于充分開發(fā)阿勒泰地區(qū)豐富的大型真菌資源具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 大型真菌菌種

大型真菌共26種，采集于新疆阿勒泰地區(qū)哈巴河縣和富蘊(yùn)縣。菌種鑒定參照卯曉嵐《中國大型真菌》方法[13]。

1.1.2 生化試劑

Tris、EDTA、阿拉伯糖和菊糖購自Sigma公司；其它生化試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 大型真菌樣品預(yù)處理

大型真菌的子實體45℃烘干、粉碎、過篩(<0.5 mm)備用。

1.2.2 大型真菌凝集素的粗提取

提取溶液為0.025 mol/L Tris-HCl緩沖液(25 mL 1 mol/L Tris溶液，17.25 mL 1 mol/L HCl溶液，蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)pH至7.8)和0.01 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(91.5 mL 0.2 mol/L Na2HPO4，8.5 mL 0.2 mol/L NaH2PO4，蒸餾水定容至2 000 mL，調(diào)pH至7.8)[14]。

取各種大型真菌子實體干粉5 g分別加入以上兩種緩沖液100 mL，磁力攪拌器攪拌1 h，然后室溫浸提8 h，8 000 r/min離心15 min，上清液作為大型真菌凝集素的粗提液置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 大型真菌凝集素凝血活性檢測

2%兔紅細(xì)胞生理鹽水懸液：新西蘭大白兔耳緣靜脈取血，加入2%EDTA抗凝，2 500 r/min離心3 min，沉淀兔紅細(xì)胞，生理鹽水洗滌5次，棄上清，根據(jù)紅細(xì)胞的體積，用生理鹽水配制成2%兔紅細(xì)胞生理鹽水懸液，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

在96孔V型血凝板每孔中加入25 μL大型真菌凝集素粗提液，用生理鹽水進(jìn)行倍比稀釋，然后在每孔中加入等體積的2%兔紅細(xì)胞生理鹽水懸液，室溫靜置2 h后觀察結(jié)果。以血凝效價(能產(chǎn)生血凝的凝集素粗提液的最大稀釋倍數(shù))評價大型真菌的凝血活性[15]。

1.2.4 凝集素的糖特異性實驗

根據(jù)已經(jīng)發(fā)表的大型真菌凝集素糖特異性的研究結(jié)果[16-17]，實驗選取了11種常用于評價糖特異性的單糖及寡糖，分別是：阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、乳糖、麥芽糖、甘露糖、棉子糖、鼠李糖和菊糖。

大型真菌凝集素粗提液按照凝血活性檢測倍比稀釋后，于每孔中加入25 μL 0.2 mol/L的單糖及寡糖溶液(生理鹽水配制)，然后加入25 μL 2%兔紅細(xì)胞生理鹽水懸液，室溫靜置2 h后觀察結(jié)果。

1.2.5 凝集素的熱穩(wěn)定性實驗

將大型真菌凝集素粗提液置于恒溫水浴中，在40～100℃的溫度范圍內(nèi)，間隔10℃分別對樣品進(jìn)行溫育處理。然后檢測樣品的凝血活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 阿勒泰大型真菌凝血活性檢測

研究從阿勒泰地區(qū)采集鑒定26種大型真菌，涵蓋當(dāng)?shù)爻Ｒ姾筒糠窒∮写笮驼婢N類。使用兩種真菌凝集素提取緩沖液，即0.025 mol/L Tris-HCl緩沖液和0.01 mol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液對這些大型真菌的子實體進(jìn)行凝集素的粗提取。采用2%兔紅細(xì)胞懸液對這些大型真菌的凝集素粗提液進(jìn)行凝血活性的評價實驗，各種大型真菌的凝集素粗提液對2%兔紅細(xì)胞懸液的血凝效價結(jié)果為，檢測的26種大型真菌分別屬于15個科，絕大多數(shù)具有凝血活性。只有經(jīng)Tris-HCl緩沖液提取的斜蓋菇不具有凝血活性。其中血凝效價達(dá)到1 024的大型真菌有4種，分別是堿竹杯傘、乳菇(經(jīng)Tris-HCl緩沖液提取)、皺皮疣柄牛肝菌和非白紅菇。血凝效價低于1 024但達(dá)到128的大型真菌有7種，分別為野蘑菇(經(jīng)Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液提取)、皺柄白馬鞍菌(經(jīng)Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液提取)、硫磺菌、褐疣柄牛肝菌(經(jīng)Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液提取)、淺杯狀香菇、高大環(huán)柄菇(經(jīng)Tris-HCl緩沖液提取)和大白菇。表1

2.2 具有高凝血活性的大型真菌的分科比較

血凝效價最高的4種大型真菌，分別屬于口蘑科、紅菇科和牛肝菌科，其中紅菇科有2種。為了比較這3個科的大型真菌的凝血活性是否有明顯區(qū)別，對以上三科的11種大型真菌的凝血活性進(jìn)行了對比。表1，圖1～3

口蘑科大型真菌的凝血活性種間差別極大。其中凝血活性最高的堿竹杯傘的粗提液達(dá)到4 096(經(jīng)Tris-HCl緩沖液提取)和2 048(經(jīng)Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液提取)，而同屬于該科的香杏麗蘑粗提液的凝血活性只有8(經(jīng)Tris-HCl緩沖液提取)和32(經(jīng)Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液提取)。圖1

表1 大型真菌凝集素粗提液凝血活性

Table 1 Hemagglutination activities of crude extracts of higher fungi

菌種名稱Nameoffungi拉丁學(xué)名Latinname所屬科Family血凝效價HemagglutinationtitersTris-HClNa2HPO4-NaH2PO4野蘑菇Agaricusarvensis傘菌科(Agaricaceae)32128田頭菇Agrocybesmithii球蓋菇科(Strophariaceae)6432毒蠅鵝膏菌Amanitamuscaria鵝膏菌科(Amanitaceae)6464紅網(wǎng)牛肝菌Boletusluridus牛肝菌科(Boletaceae)1664香杏麗蘑Calocybegambosa口蘑科(Tricholomataceae)832皺鎖瑚菌Clavulinarugosa灰珊瑚菌科(Clavulinaceae)3232堿竹杯傘Clitocybealkaliviolascens口蘑科(Tricholomataceae)40962048斜蓋菇Clitopilusprunulus粉褶菌科(Entolomataceae)-32松生擬層孔菌Fomitopsispinicola擬層孔菌科(Fomitopsidaceae)1632皺柄白馬鞍菌Helvellacrispa馬鞍菌科(Helvellaceae)64128白緣絲蓋傘Inocybeleucoloma絲蓋傘科(Inocybaceae)1632毛柄庫恩菌Kuehneromycesmutabilis球蓋菇科(Strophariaceae)6464乳菇Lactariusdeceptivus紅菇科(Russulaceae)1024512松乳菇Lactariusdeliciosus紅菇科(Russulaceae)25664硫磺菌Laetiporussulphureus多孔菌科(Polyporaceae)512512皺皮疣柄牛肝菌Leccinumduriusculum牛肝菌科(Boletaceae)10241024褐疣柄牛肝菌Leccinumscabrum牛肝菌科(Boletaceae)64256淺杯狀香菇Lentinuscyathiformis多孔菌科(Polyporaceae)256256紫丁香蘑Lepistanuda口蘑科(Tricholomataceae)3232高大環(huán)柄菇Macrolepiotaprocera環(huán)柄菇科(Lepiotaceae)12864铦囊蘑Melanoleucacognata口蘑科(Tricholomataceae)6432卷邊網(wǎng)褶菌Paxillusinvolutus網(wǎng)褶菌科(Paxillaceae)816森林盤菌Pezizasylvestris盤菌科(Pezizaceae)464大白菇Russuladelica紅菇科(Russulaceae)128512非白紅菇Russulaexalbicans紅菇科(Russulaceae)4096128托柄灰錘Tulostomavolvulatum傘菌科(Agaricaceae)88

注：-表示無凝血活性

Note: - no hemagglutination activity

圖1 口蘑科大型真菌的凝血活性

Fig.1 Hemagglutination activities of Tricholomataceae

4種紅菇科大型真菌的凝血活性差別也很顯著，凝血活性最高的是非白紅菇，經(jīng)Tris-HCl緩沖液提取凝血活性達(dá)到4 096。而大白菇的Tris-HCl凝集素粗提液的凝血活性只有128。圖2

圖2 紅菇科大型真菌的凝血活性

Fig.2 Hemagglutination activities of Russulaceae

3種牛肝菌科大型真菌的凝血活性也有明顯差別，其中皺皮疣柄牛肝菌經(jīng)Tris-HCl和Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液提取凝血活性均能達(dá)到1 024，而紅網(wǎng)牛肝菌經(jīng)Tris-HCl緩沖液提取凝血活性只有16。

在研究中發(fā)現(xiàn)的4種凝血活性最高的大型真菌所屬的3個科的11種大型真菌的凝血活性差別極大，說明這些大型真菌的凝血活性與特定菌種有關(guān)，而與其科屬分類無關(guān)。圖3

圖3 牛肝菌科大型真菌的凝血活性

Fig.3 Hemagglutination activities of Boletaceae

2.3 具有高凝血活性的大型真菌粗提液的糖特異性

大多數(shù)凝集素的凝血活性會被某些單糖或寡糖特異性的抑制，這種特性被稱為凝集素的糖特異性(Sugar Specific)。糖特異性的存在不僅與凝集素和細(xì)胞表面結(jié)合位點有關(guān)，而且為提取和純化凝集素的載體選擇提供了重要的實驗依據(jù)。實驗選取了11種常用于評價糖特異性的單糖及寡糖，對以上4種具有高凝血活性的大型真菌粗提液的糖特異性進(jìn)行實驗。圖4

Ara, 阿拉伯糖; Fru, 果糖; Gal, 半乳糖; Glu, 葡萄糖; GalNAc, N-乙酰-D-半乳糖胺; Lac, 乳糖; Mal, 麥芽糖; Man, 甘露糖; Raf, 棉子糖; Rha, 鼠李糖; Inu, 菊糖

Ara, arabinose; Fru, fructose; Gal, galactose; Glu, glucose; GalNAc, N-acetyl-D-galactosamine; Lac, lactose; Mal, maltose; Man, mannose; Raf, raffinose; Rha, rhamnose; Inu, inulin

圖4 具有高凝血活性的大型真菌粗提液的糖特異性

Fig.4 Sugar specific of the extracts of higher fungi with high hemagglutination activity

堿竹杯傘粗提液的凝血活性可被N-乙酰-D-半乳糖胺和乳糖抑制，乳菇粗提液的凝血活性被N-乙酰-D-半乳糖胺抑制，皺皮疣柄牛肝菌粗提液的凝血活性被葡萄糖和乳糖抑制，而非白紅菇粗提液的凝血活性被菊糖抑制。圖4

2.4 具有高凝血活性的大型真菌粗提液的熱穩(wěn)定性

凝集素作為一種能夠和不同糖結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)，其凝血活性受溫度影響。檢測高凝血活性大型真菌粗提液在不同溫度下的凝血活性對凝集素的進(jìn)一步提取具有重要意義。4種具有高凝血活性的大型真菌粗提液(經(jīng)Tris-HCl緩沖液提取)在40～100℃的溫度范圍內(nèi)的凝血活性為，非白紅菇的粗提液經(jīng)90℃加熱后仍有凝血活性，乳菇和皺皮疣柄牛肝菌在70℃加熱后失去凝血活性，而堿竹杯傘在60℃加熱后失去凝血活性。實驗結(jié)果表明這4種大型真菌凝集素的熱穩(wěn)定性有顯著差異。表2

表2 具有高凝血活性大型真菌粗提液的熱穩(wěn)定性

Table 2 Thermal stability of the extracts of higher fungi with high hemagglutination activity

溫度Temperature(℃)堿竹杯傘Clitocybealkaliviolascens乳菇Lactariusdeceptivus皺皮疣柄牛肝菌Leccinumduriusculum非白紅菇Russulaexalbicans對照40961024102440964010241024512409650128256128409660-6432102470---25680---6490---16100----

注：-表示無凝血活性

Note: - no hemagglutination activity

3 討 論

早在1891年，第一種大型真菌凝集素環(huán)肽(Phallin)就從鬼筆鵝膏(Amanitaphalloides)分離出來[16]。隨后在研究毒蠅鵝膏(Amanitamuscaria)的毒性時進(jìn)一步確認(rèn)了凝集素的存在[17]。由于凝集素最早是作為能夠凝集動物細(xì)胞的凝血素被發(fā)現(xiàn)的。直到現(xiàn)在，凝血活性的檢測仍然是凝集素常用的和最簡易的檢測方法。這種檢測方法通過粗提取或純化的凝集素蛋白對哺乳動物紅細(xì)胞的凝集作用來檢測凝集素的凝血活性[8]。早期的真菌凝集素研究常和大型真菌的毒性相關(guān)聯(lián)。但后來從美味牛肝菌(Boletusedulis)、松乳菇(Lactariusdeliciosus)和野蘑菇 ( Agaricus arvensis )等食用菌中也分離到很多不同類型的凝集素[18]。這說明凝集素在大型真菌中的分布并不局限于有毒大型真菌。根據(jù)Singh等[19]的統(tǒng)計，已有336種大型真菌凝集素得到了分離和初步的研究[20]。其中144種來源于食用菌。Furukawa等[21]檢測了833種真菌對人紅細(xì)胞的凝集反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)其中的422種(47.8%)具有凝集素活性。Fumio等[22]檢測了110種日本大型真菌子實體的粗提液對人和兔紅細(xì)胞的凝集活性，發(fā)現(xiàn)其中94種(85%)具有凝集素活性。國內(nèi)的食藥用真菌的相關(guān)研究也證實大多數(shù)在國內(nèi)分布的大型真菌具有凝集素活性。劉鵬舉等[23]對17種市售食藥用大型真菌對兔紅細(xì)胞的凝血檢測結(jié)果證實其中大多數(shù)具有凝血活性。劉艷如等[24]檢測了12種食用菌對動物細(xì)胞的凝集反應(yīng)，其中10種具有凝血活性。關(guān)于野生大型真菌的研究，陳芝蘭等[25]對西藏林芝的35種大型野生真菌的凝血活性檢測結(jié)果表明，其中的29種(83%)具有凝血活性，該結(jié)果還表明，大型真菌中凝集素的分布與真菌是否具有毒性無關(guān)，且與分類科屬也無關(guān)。

新疆的廣闊地域以及多樣的地形地貌和氣候條件為大型真菌的生長分布提供了非常有利的條件。根據(jù)王俊燕[26]的調(diào)查，新疆具有豐富的大型真菌資源，共有大型真菌328種。其中僅在阿勒泰喀納斯湖地區(qū)就分布有200種大型真菌[12]。從這些豐富的真菌資源中篩選高凝血活性的大型真菌，發(fā)掘新的真菌凝集素，對于充分開發(fā)阿勒泰地區(qū)豐富的大型真菌資源具有重要的意義。

4 結(jié) 論

4.1 15科26種阿勒泰大型真菌的凝集素提取液的絕大多數(shù)具有凝血活性，其中凝血活性最高的4種大型真菌是堿竹杯傘(Clitocybealkaliviolascens)、乳菇(Lactariusdeceptivus)、皺皮疣柄牛肝菌(Leccinumduriusculum)和非白紅菇(Russulaexalbicans)。

4.2 由于4種凝血活性最高的大型真菌所屬的3個科的11種大型真菌的凝血活性差別極大，所以這些大型真菌的凝血活性與其科屬分類無直接相關(guān)性。

4.3 4種凝血活性最高的大型真菌粗提液的糖特異性和熱穩(wěn)定性差別顯著，這些特異性對于進(jìn)一步分離和純化其中不同的真菌凝集素具有指導(dǎo)性意義。

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Fund project:Supported by the Basic Science and Technology Research Support Funds of Non-profit Research Institutions of Xinjiang Uygur Autonomous Region "Investigation of Higher Fungi in Altay and Analysis Research on Their Metabolites"

Hemagglutinins of Higher Fungi in Altay

QIN Xin-zheng, YANG Xin-ping, CHEN Jing, FENG Lei

(ResearchInstituteofAppliedMicrobiology,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091,China)

【Objective】 The purpose of this research aims to investigate the hemagglutinins of higher fungi in Altay. 【Method】 Tris-HCl buffer and Na2HPO4-NaH2PO4buffer were used to extract hemagglutinins from fruit bodies of 26 species of higher fungi which belong to 15 families in Altay. These extracts were examined with 2% rabbit erythrocytes suspension. 【Result】Most of the extracts showed the hemagglutination activities. 4 species (Clitocybealkaliviolascens,Lactariusdeceptivus,LeccinumduriusculumandRussulaexalbicans) exhibited very high hemagglutination activity. At the same time, their hemagglutination activities were not directly related to their family's classification. There were significant differences in their sugar specific and thermal stability.【Conclusion】The results suggested that most of the extract of 26 species of higher fungi in Altay showed the hemagglutination activities.Therefore,Altay fungi would be promising sources of lectins.

higher fungi; hemagglutinins; hemagglutination activity

10.6048/j.issn.1001-4330.2016.01.019

2015-09-06

自治區(qū)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)項目“新疆阿勒泰地區(qū)大型真菌資源調(diào)查及代謝產(chǎn)物分析研究”

秦新政(1977-)，男，新疆人，副研究員，碩士，研究方向為發(fā)酵工程，(E-mail)qinxinzheng@163.com

楊新平(1968-)，男，新疆人，副研究員，研究方向為發(fā)酵工程，(E-mail)yangxin9337@yahoo.com.cn

S182 ；S646

A

1001-4330(2016)01-0142-07