李筠

（深圳農(nóng)業(yè)科技促進(jìn)中心 廣東深圳 518000）

與時(shí)俱進(jìn)的SSR分子標(biāo)記技術(shù)及其在水稻中的應(yīng)用

李筠

（深圳農(nóng)業(yè)科技促進(jìn)中心 廣東深圳 518000）

SSR標(biāo)記又稱為微衛(wèi)星標(biāo)記，具有共顯性、多態(tài)性高、易檢測等優(yōu)點(diǎn)，是目前被廣泛應(yīng)用的一種分子標(biāo)記。隨著分子生物技術(shù)的不斷發(fā)展，SSR分子標(biāo)記技術(shù)也日趨成熟完善，有條件的實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)了高通量自動(dòng)化的技術(shù)流程。SSR分子標(biāo)記技術(shù)在水稻DNA指紋圖譜的構(gòu)建和品種真實(shí)性鑒定、遺傳圖譜的構(gòu)建、基因的定位和圖位克隆以及分子標(biāo)記輔助選擇育種等方面有著廣泛的應(yīng)用。

SSR分子標(biāo)記 水稻 DNA指紋圖譜

SSR標(biāo)記（simple sequence repeat）也稱為微衛(wèi)星標(biāo)記，是分子標(biāo)記中的一種，是指以少數(shù)幾個(gè)核苷酸（2～4個(gè)）為單位的串聯(lián)重復(fù)序列。SSR分子標(biāo)記技術(shù)在水稻研究中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，利用該技術(shù)構(gòu)建的DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫，為品種真實(shí)性鑒定、種質(zhì)資源鑒定，育種材料確權(quán)等提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。同時(shí)，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)繪制水稻遺傳圖譜，進(jìn)而研究水稻具有重要農(nóng)藝性狀的基因，對這些基因進(jìn)行QTL分析、精細(xì)定位和圖位克隆，進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種等，為水稻分子設(shè)計(jì)育種奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，最終將可實(shí)現(xiàn)“想要怎樣的稻米，即可創(chuàng)造怎樣的稻米”的夢想。

1　SSR分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)

目前，分子標(biāo)記可分為四大類：一是基于DNA-DNA雜交的分子標(biāo)記，如RFLP標(biāo)記；二是基于PCR與限制性酶切技術(shù)結(jié)合的分子標(biāo)記，如AFLP標(biāo)記、CAPS標(biāo)記等；三是基于PCR的分子標(biāo)記，包括隨機(jī)引物PCR標(biāo)記（如RAPD標(biāo)記）和特異引物PCR標(biāo)記（如SSR標(biāo)記、STS標(biāo)記）；四是基于DNA測序的標(biāo)記，如SNP，Indels，EST標(biāo)記。與第一、二類分子標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）在染色體上覆蓋率高，數(shù)量多，且是共顯性標(biāo)記；（2）在基因座位上存在著豐富的等位基因，即多態(tài)性高。例如，水稻RFLP座位的等位基因數(shù)為2-4個(gè)，而SSR標(biāo)記的等位基因數(shù)為2-25個(gè)。從多態(tài)性信息含量（PIC）來衡量，RFLP的PIC值為0.39，而SSR標(biāo)記的PIC為0.69；（3）實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較好，結(jié)果可靠性高；（4）基于PCR技術(shù)上的操作，具有快速、簡便、低成本的特點(diǎn)。與第四類分子標(biāo)記相比，SSR標(biāo)記雖然在染色體上的覆蓋率不及SNP標(biāo)記，但SNP標(biāo)記的研究畢竟起步晚，在水稻很多方面的應(yīng)用中仍處于研發(fā)階段，且開發(fā)SNP標(biāo)記的成本目前也相對較高。因此SSR標(biāo)記是一類比較理想的分子標(biāo)記，目前正廣泛應(yīng)用于水稻的研究中。

2　SSR分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展

2.1SSR分子標(biāo)記電泳技術(shù)的發(fā)展

SSR分子標(biāo)記技術(shù)在實(shí)驗(yàn)操作過程中，主要包括4個(gè)步驟：樣品制備、DNA提取、PCR擴(kuò)增和PCR產(chǎn)物檢測。經(jīng)過多年的發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)非常成熟。以前，PCR產(chǎn)物檢測采用的是聚丙烯酰凝膠電泳技術(shù)，包括變性膠和非變性膠兩種方法。然而，不管采用哪一種方式，都需要經(jīng)過制膠、染色和顯影的步驟，實(shí)驗(yàn)過程相對繁瑣，耗時(shí)長，而且未能直觀分析片段大小的精確值，難以區(qū)分差異2bp以下的片段。現(xiàn)在，PCR產(chǎn)物檢測可以采用毛細(xì)管電泳技術(shù)，實(shí)驗(yàn)操作簡便，能精確知道每個(gè)材料SSR標(biāo)記的片段大小值，而且可以實(shí)現(xiàn)多重毛細(xì)管電泳，例如在人類基因組研究上可以實(shí)現(xiàn)24重電泳，在玉米的研究上可以實(shí)現(xiàn)10重電泳，而在水稻的研究上可以實(shí)現(xiàn)4-5重電泳，大大提高了實(shí)驗(yàn)效率，省時(shí)省力且結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.2從人工操作到高通量自動(dòng)化流程的發(fā)展

實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)流程自動(dòng)化是SSR分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展的一個(gè)重要趨勢。以前實(shí)驗(yàn)過程完全是靠人工來完成，現(xiàn)在各種自動(dòng)化儀器的引進(jìn)，在解放勞動(dòng)力的同時(shí)，避免了人為因素造成實(shí)驗(yàn)過程操作的失誤。DNA提取過去采用的是SDS法，CTAB法等，均可提取高質(zhì)量DNA；現(xiàn)在可采用DNA自動(dòng)化提取技術(shù)，當(dāng)前比較流行的是磁珠法核酸純化技術(shù)，該方法采用了納米級(jí)磁珠微珠，這種磁珠微珠的表面標(biāo)記了一種官能團(tuán)，通過同核酸發(fā)生吸附反應(yīng)來達(dá)到提取和純化DNA的目的［1］。PCR擴(kuò)增過去完全是人工操作，每次實(shí)驗(yàn)需要實(shí)驗(yàn)人員按擴(kuò)增體系比例配置引物、DNA樣品、酶，ddH2O等，現(xiàn)在可以采用自動(dòng)移液工作站，可自動(dòng)實(shí)現(xiàn)96通道的快速操作。PCR反應(yīng)也從過去的2個(gè)小時(shí)減少到30分鐘。目前大型種業(yè)先鋒、孟山都公司已實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，每天處理的用于玉米育種的單個(gè)分子標(biāo)記數(shù)據(jù)達(dá)到20萬個(gè)，國內(nèi)各省市科研院所，種子管理站也逐漸引進(jìn)自動(dòng)化儀器，實(shí)現(xiàn)高通量自動(dòng)化流程。

3　SSR分子標(biāo)記技術(shù)在水稻研究中的應(yīng)用

3.1水稻DNA指紋圖譜的構(gòu)建和品種真實(shí)性鑒定

構(gòu)建DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫可從分子水平上鑒別新品種與已審定品種是否存在差異，從而科學(xué)、快速的判定品種間的特異性、一致性和穩(wěn)定性；也可用于市場上真假品種的鑒定。目前，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻所已利用48對SSR標(biāo)記基本完成對3000多份水稻主推品種的指紋圖譜構(gòu)建；而最早是在2001年，中國水稻所于永紅應(yīng)用篩選出的4對SSR引物，建立了雜交水稻不育系寧2A以及寧2B的DNA指紋圖譜［2］，通過與其他廣泛應(yīng)用的雜交水稻親本材料的遺傳關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)寧2A、2B具有秈稻的遺傳成分，從而在分子水平上解釋了該材料與秈稻親和性較高的原因。而后陸續(xù)有研究單位利用SSR分子標(biāo)記構(gòu)建水稻品種的DNA指紋圖譜，四川、重慶、安徽、深圳等省市也分別對參加省區(qū)試和歷年推廣的水稻品種構(gòu)建了DNA指紋圖譜［3］。

2007年，農(nóng)業(yè)部頒布了水稻品種真實(shí)性鑒定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)“NY/T 1433-2007”，利用12對基礎(chǔ)核心引物和12對擴(kuò)展核心引物對水稻品種進(jìn)行鑒定。隨著SSR標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展和DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的日益完善，2014年，農(nóng)業(yè)部重新修訂水稻品種真實(shí)性鑒定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)為“NY/T 1433-2014”，從24對SSR標(biāo)記增加為48對SSR標(biāo)記，從待測樣品與標(biāo)準(zhǔn)樣品的逐一進(jìn)行兩兩比較的方法，增加了另一種方法，待測樣品與DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫的比較。這樣，SSR標(biāo)記對種子生產(chǎn)、經(jīng)營、使用、管理等活動(dòng)已起到重要作用。

3.2遺傳圖譜的構(gòu)建

最先用于水稻遺傳圖譜構(gòu)建的標(biāo)記是RFLP標(biāo)記，始于1988年美國康奈爾大學(xué)發(fā)表的連鎖圖，而后在日本RGP網(wǎng)站也公布了連鎖圖，且?guī)缀鯙镃APS標(biāo)記代替。這兩張連鎖圖是各自獨(dú)立構(gòu)建的，所用標(biāo)記和群體類型不同，因而不能互相參照。隨后，隨著SSR分子標(biāo)記的廣泛應(yīng)用，美國康奈爾大學(xué)構(gòu)建了水稻微衛(wèi)星標(biāo)記連鎖圖，圖上的微衛(wèi)星標(biāo)記達(dá)2740多個(gè)，而華南農(nóng)業(yè)大學(xué)分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室利用網(wǎng)上序列資料設(shè)計(jì)SSR引物對這些標(biāo)記稀少的區(qū)域進(jìn)行了填充和整合，重新構(gòu)建了一幅包括719個(gè)SSR標(biāo)記的圖譜，這個(gè)圖譜上SSR標(biāo)記的分布較均勻，為水稻分子育種的準(zhǔn)確性提供了保證。

3.3基因定位和圖位克隆的應(yīng)用

通過遺傳圖譜的構(gòu)建，很多SSR標(biāo)記在染色體上的位置已經(jīng)確定，因此只要確定基因與分子標(biāo)記之間的連鎖關(guān)系，就可以確定基因在染色體上的位置。水稻基因定位包括主效基因的定位和微效基因的QTL分析兩方面，前者如控制水稻花粉不育基因S-a，S-b，S-c，S-d，S-e的定位，后者是一些數(shù)量性狀基因的定位。

1986年，劍橋大學(xué)的Coulson等提出圖位克隆的概念，又稱為定位克隆，該方法無須事先知道基因的DNA序列，利用SSR分子標(biāo)記就可以直接對自然變異的基因進(jìn)行精細(xì)定位，進(jìn)而進(jìn)行克隆。水稻方面，各個(gè)性狀的基因已有很多被克隆，如水稻粒長粒寬相關(guān)的GS3，GW5，GS5，GW8基因；控制水稻抽穗期的Ghd7，Hd1，Ehd1，Hd3a，OsMADS50，RFT1Hd6，DTH8，DTH2等基因，控制稻米品種的WX，ALK基因等都已被圖位克隆。

3.4分子標(biāo)記輔助選擇育種（MAS）的應(yīng)用

SSR分子標(biāo)記最直接的用途是對水稻重要農(nóng)藝性狀進(jìn)行輔助選擇（marker-aided or assisted selection，MAS），也就是利用目標(biāo)性狀基因與分子標(biāo)記之間的緊密連鎖關(guān)系進(jìn)行間接選擇。結(jié)果十分可靠，且MAS一般可在育種早代時(shí)期完成，從而大大縮短育種周期，提高了育種效率［4］。

例如水稻產(chǎn)量性狀相關(guān)基因中，與粒寬GW5 緊密連鎖的SSR標(biāo)記為RM3328和RM513，位于第5染色體短臂間［5］；Xue等找到與每穗粒數(shù)Ghd7緊密連鎖的SSR標(biāo)記為RM5436和RM2256［6］；與粒寬GS5緊密連鎖的SSR標(biāo)記為RM593和RM574［7］；與每穗實(shí)粒數(shù)相關(guān)的DEP1連鎖的SSR標(biāo)記為第9染色體上的RM3770和RM7424［8］。利用這些分子標(biāo)記，能對育種材料進(jìn)行快速的篩查，為分子設(shè)計(jì)育種奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

4　結(jié)語

經(jīng)過多年的發(fā)展，SSR分子標(biāo)記技術(shù)在水稻研究中扮演著非常重要的角色，大力的促進(jìn)水稻研究工作的前行。SSR分子標(biāo)記技術(shù)也在日益發(fā)展，目前在有條件的大型種業(yè)公司或者經(jīng)費(fèi)充足的科研院所，該技術(shù)已逐漸實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、高通量的流程，然而它也有弊端，就是這些進(jìn)口儀器相對昂貴，且試劑耗材成本高，因此我們要加強(qiáng)儀器和試劑耗材方面的技術(shù)攻克，開發(fā)國內(nèi)先進(jìn)的儀器和高質(zhì)量的試劑，同時(shí)對該技術(shù)各個(gè)環(huán)節(jié)的條件進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化和完善，減少時(shí)間和成本。另一方面，SSR標(biāo)記的開發(fā)需要知道DNA序列才能設(shè)計(jì)引物，應(yīng)該實(shí)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)室間已開發(fā)引物的共享，攜手努力，這樣才能更快更好的致力于水稻的研究工作。

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Q75

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1674-2060（2016）05-0088-02

李筠（1984—），女，廣東省汕頭市人，助理農(nóng)藝師，定向博士在讀，研究方向：植物分子育種。