歐陽鳳

（河南工學(xué)院 河南新鄉(xiāng) 453003）

斑馬魚在發(fā)育毒理學(xué)中應(yīng)用的安全性評估

歐陽鳳

（河南工學(xué)院 河南新鄉(xiāng) 453003）

目前，斑馬魚胚胎已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于發(fā)育毒理學(xué)研究領(lǐng)域，并取得顯著的研究成果。在胚胎發(fā)育的致畸、致死原因中，以血管、心臟和神經(jīng)發(fā)育的研究最為廣泛。斑馬魚在血管、心臟和神經(jīng)發(fā)育這幾個領(lǐng)域研究中的應(yīng)用處于起步階段，本文主要分析總結(jié)斑馬魚胚胎在血管、心臟和神經(jīng)發(fā)育毒理學(xué)研究中的應(yīng)用。

斑馬魚 胚胎發(fā)育 毒理學(xué) 應(yīng)用

在發(fā)育毒理學(xué)研究領(lǐng)域中，小鼠、爪蟾、斑馬魚等都是較為常用的動物。雖然小鼠在現(xiàn)代遺傳學(xué)研究中發(fā)揮出重要作用，但由于小鼠的胚胎位于母體子宮深處，因此在研究中無法實(shí)現(xiàn)發(fā)育過程的動態(tài)觀察。爪蟾是胚胎學(xué)研究的良好對象，但由于繁殖較慢，其應(yīng)用存在時間限制。這就表明上述模型動物不適用于發(fā)育毒理學(xué)的研究。斑馬魚由于個體小、周期產(chǎn)卵，且產(chǎn)卵周期短、產(chǎn)卵量高、卵大、體外受精、體外發(fā)育等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于胚胎學(xué)、發(fā)育生物學(xué)、分析生物學(xué)、毒理學(xué)等領(lǐng)域的研究中，被喻為是較為理想的研究型脊椎動物，具有很高的科研價值和應(yīng)用前景。對于發(fā)育早期胚胎發(fā)育的研究，斑馬魚的應(yīng)用具有顯著優(yōu)勢，有利于促進(jìn)有關(guān)早期胚胎發(fā)育調(diào)控事件的研究進(jìn)展。

1　斑馬魚的生物學(xué)特征

斑馬魚俗稱花條魚、藍(lán)條魚、斑馬擔(dān)尼魚，隸屬鯉科、短擔(dān)尼魚屬。斑馬魚起源于印度，是一種小型的熱帶魚類，染色體數(shù)目為50，成體長約3～4cm，孵出后約3個月能夠成熟。成熟的雌魚每隔一周可產(chǎn)幾百粒卵子。卵子均為體外受精，體外發(fā)育，胚胎發(fā)育同步，且速度快，良好發(fā)育的溫度為25～31℃［1］。細(xì)胞培養(yǎng)是獲得毒理機(jī)制信息的有效途徑，其缺陷是無法反映體內(nèi)細(xì)胞的自然環(huán)境。采用生物有機(jī)體配合基因功能操作，能夠快速有效地獲得毒性機(jī)制。如果運(yùn)用哺乳動物作為模型，則會增加研究成本，不利于大規(guī)模的實(shí)驗(yàn)研究，在此情況下斑馬魚顯現(xiàn)出巨大的優(yōu)勢。斑馬魚胚胎的透明性和體外發(fā)育是其最大優(yōu)勢，有利于對胚胎毒性和畸形效應(yīng)的動態(tài)研究。在德國，斑馬魚胚胎已經(jīng)成為水質(zhì)監(jiān)測的標(biāo)準(zhǔn)模式生物，取代傳統(tǒng)運(yùn)用成魚進(jìn)行毒理學(xué)試驗(yàn)的研究，充分發(fā)揮出斑馬魚的應(yīng)用價值。

2　斑馬魚作為毒理模式動物的優(yōu)勢

相比于哺乳動物胚胎，斑馬魚胚胎作為發(fā)育毒理學(xué)的模式動物具有以下優(yōu)勢：

2.1胚胎取材方便

性成熟的斑馬魚在光刺激的環(huán)境下能夠影響其交配行為，主要利用適當(dāng)?shù)恼{(diào)節(jié)光周期，或合理控制雌魚和雄魚的接觸時間，就能有效控制斑馬魚的產(chǎn)卵時間，其中一尾雌魚平均一次能夠產(chǎn)100～300枚卵，在這種高產(chǎn)量下一天可以獲得足夠的斑馬魚胚胎，目前還沒有一種哺乳動物具有如此高的排卵量。受精卵的保存主要采用96孔板，有效節(jié)約保存成本和空間，這位大量的試驗(yàn)研究提供方便的取材，促進(jìn)高通量研究的順利進(jìn)行。

2.2胚胎發(fā)育迅速

斑馬魚的良好發(fā)育溫度為25～31℃，在此環(huán)境下受精后，胚胎會于40min后完成首次分裂，接著每15min逐漸完成每一次的分裂。經(jīng)24小時胚胎中斑馬魚的腦室、眼睛、耳朵等器官及細(xì)胞均能顯著呈現(xiàn)出來，這1小時的發(fā)育相當(dāng)于人類1個月的胚胎發(fā)育［2］。

2.3易于觀察操作

斑馬魚的胚胎主要在體外發(fā)育，胚胎具有較高的透明度，這種特點(diǎn)方便對其發(fā)育過程及影響因素的觀察。試驗(yàn)研究可以動態(tài)觀察胚胎發(fā)育的過程，例如運(yùn)用示蹤標(biāo)記的方法動態(tài)觀察某個基因的時空表達(dá)情況。斑馬魚受精卵的直徑約為1mm，這為顯微注射和細(xì)胞移植等操作提供有利條件，除此以外，在后期胚胎上還能夠運(yùn)用基因調(diào)控技術(shù)、全胚胎表達(dá)圖譜和胚胎原位雜交技術(shù)等，為多個系統(tǒng)的發(fā)育、功能和疾病研究提供模型。

3　斑馬魚在發(fā)育毒理學(xué)中應(yīng)用

3.1斑馬魚胚胎在血管發(fā)育毒理學(xué)研究中的應(yīng)用

血管發(fā)生和血管生成是斑馬魚血管發(fā)育的兩個重要過程，其中血管發(fā)生是指內(nèi)皮細(xì)胞前體進(jìn)行分化，并初步形成血管；血管發(fā)育是指初步形成的血管內(nèi)皮細(xì)胞逐漸發(fā)芽，并形成新的毛細(xì)血管。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）主要作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，并對血管生長調(diào)控起到良好作用。目前研究主要集中于對斑馬魚VEGF-A的試驗(yàn)研究，VEGF-A具有促進(jìn)斑馬魚胚胎血管發(fā)生、生長、造血等作用。

首先，斑馬魚能夠在短時間內(nèi)形成完整的循環(huán)系統(tǒng)，縮短試驗(yàn)所需時間，提高研究效率。其次，斑馬魚在剛開始發(fā)育時期能夠充分運(yùn)用氧氣的被動擴(kuò)散完成呼吸，不需要任何功能性的心血管系統(tǒng)和造血系統(tǒng)，這相比與哺乳動物其胚胎的成活率更高，這就表明斑馬魚胚胎更加適合研究心血管系統(tǒng)早期發(fā)育缺陷和發(fā)育關(guān)鍵基因功能等。第三，斑馬魚可以作為外源化學(xué)物導(dǎo)致心血管系統(tǒng)畸形研究的模式動物。例如在乙醇的血管發(fā)育毒性研究領(lǐng)域，研究發(fā)現(xiàn)［3］給予斑馬魚胚胎乙醇，胚胎底索分泌的Ang-1和Radar等血管生成因子顯著減少，從而影響DA的形成穩(wěn)定性，這表明乙醇會影響斑馬魚底索的發(fā)育。第四，斑馬魚胚胎的血管發(fā)育毒性研究對于臨床藥物安全性的評價具有顯著意義。例如在抗血管生成藥物的助溶劑研究中，分別采用二甲基亞砜、丙酮、甲醇、異丙醇有機(jī)溶劑處理斑馬魚胚胎，結(jié)果顯示，二甲基亞砜、丙酮適宜濃度小于等于0.1%，甲醇適宜濃度小于等于1%，異丙醇并不能適用于斑馬魚的抗血管生成，有利于抗腫瘤藥物有機(jī)助溶劑的篩選。另一項(xiàng)研究證實(shí)了抗癌藥物力達(dá)霉素對斑馬魚胚胎血管生成具有顯著的抑制作用。最后，斑馬魚血管具有透明性，能夠動態(tài)觀察胚胎中血流動力學(xué)參數(shù)，便于觀察斑馬魚發(fā)育的整個過程，這對于獲取毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有顯著優(yōu)勢。例如研究給予斑馬魚胚胎不同濃度的咪唑安定，其中1mg·L-1的咪唑安定對胚胎血管發(fā)育無影響，10mg·L-1用量會引起體節(jié)間和尾部血管的發(fā)育受到抑制，20mg·L-1用量會造成發(fā)育停滯，這為咪唑安定藥物對血管毒性作用提供研究依據(jù)。

3.2斑馬魚胚胎在心臟發(fā)育毒理學(xué)研究中的應(yīng)用

斑馬魚在發(fā)育過程中首先發(fā)揮作用的器官就是心臟，心臟控制循環(huán)功能。斑馬魚心臟的發(fā)育過程主要包括初始分化、出現(xiàn)心跳、血液循環(huán)、出現(xiàn)新光卷曲、心臟功能發(fā)育完全這幾個階段。心臟發(fā)育是一個復(fù)雜的過程，需要細(xì)胞增殖、遷移、分化及相互作用，還需要多個基因的表達(dá)和調(diào)控。斑馬魚胚胎心臟可以作為化學(xué)物毒性的靶器官，主要利用斑馬魚心臟的透明性進(jìn)行動態(tài)觀察，也被廣泛應(yīng)用于中藥的安全性評估、環(huán)境中有機(jī)污染物的心臟發(fā)育毒性的研究中。

首先，斑馬魚胚胎心臟應(yīng)用于中藥的安全性評價。例如一項(xiàng)研究［4］將斑馬魚胚胎作為模型動物，研究中藥雷公藤紅素的心臟毒性，結(jié)果顯示，雷公藤紅素的毒性作用主要表現(xiàn)為心臟線性化、心膜出血、心區(qū)細(xì)胞堆積等不良反應(yīng)，且斑馬魚的心率呈現(xiàn)下降趨勢。另一項(xiàng)研究給予斑馬魚中藥桔?？傑?，研究結(jié)果顯示斑馬魚的心率逐漸減緩，離子通道中的基因表達(dá)水平也顯著降低。其次，斑馬魚胚胎廣泛應(yīng)用于環(huán)境持久性POPs的心臟發(fā)育毒性評價中。研究已經(jīng)證實(shí)，“福美雙”殺菌劑的毒性主要表現(xiàn)在會引起心囊水中和心率下降，心臟發(fā)育毒性會隨著計量的變化而變化。一項(xiàng)研究［5］運(yùn)用斑馬魚胚胎研究多環(huán)芳烴（PAHs）毒性，結(jié)果顯示多環(huán)芳烴的毒性表現(xiàn)具有多樣性，不同種類的PAHs的心臟發(fā)育毒性是不同的，但靶器官均為心血管系統(tǒng)。其中BAP的毒性作用主要表現(xiàn)為心動過緩、心包水腫、心肌細(xì)胞CYP1A顯著升高等，BKF的毒性作用表現(xiàn)為心包水腫、循環(huán)缺陷、房室回流受阻等，BEP的毒性標(biāo)志為較低的CYP1A信號，其余無顯著心臟毒性和畸形發(fā)生。第三，斑馬魚胚胎應(yīng)用于納米材料的心臟發(fā)育毒性研究中。一項(xiàng)研究給予斑馬魚胚胎納米銀、納米金和納米鉑處理，納米銀和納米鉑材料的毒性主要表現(xiàn)為心率降低，納米銀還會造成心臟畸形、循環(huán)障礙等，而納米金在處理實(shí)驗(yàn)下沒有發(fā)現(xiàn)顯著的毒性作用，這將為環(huán)境保護(hù)提供參考數(shù)據(jù)。

3.3斑馬魚胚胎在神經(jīng)發(fā)育毒理學(xué)研究中的應(yīng)用

斑馬魚胚胎時期能夠觀察到一些運(yùn)動行為，例如游動、逃避反射等，這些運(yùn)動行為伴隨發(fā)育進(jìn)程逐漸產(chǎn)生。其神經(jīng)發(fā)育的過程重要表現(xiàn)為胚胎出現(xiàn)持續(xù)性的肌肉收縮、對于頭部刺激能夠快速轉(zhuǎn)動尾巴、對于機(jī)械刺激能夠游動、游動速度達(dá)到最大、對觸覺表現(xiàn)出成熟的逃避反射，這些行為學(xué)發(fā)育特點(diǎn)是神經(jīng)發(fā)育毒性研究的重要參考。

有于斑馬魚胚胎具有顯著的透明性，因此其模型動物主要適用于常規(guī)檢測方法中，并將細(xì)胞、分子及遺傳學(xué)等方法相結(jié)合，對神經(jīng)發(fā)育毒性進(jìn)行研究和評價。國外研究運(yùn)用7種化學(xué)物質(zhì)研究斑馬魚胚胎的神經(jīng)發(fā)育毒性，發(fā)現(xiàn)斑馬魚行為學(xué)是一種較為簡單并能夠分析神經(jīng)整合功能的方法，逐漸形成多種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。國?nèi)一項(xiàng)研究［6］觀察二氫葉酸還原酶基因?qū)Π唏R魚胚胎顱腦發(fā)育情況的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對顱腦發(fā)育產(chǎn)生較大的影響。另一項(xiàng)研究表明，下調(diào)原鈣粘附蛋白18（PCDH18）基因?qū)Π唏R魚的神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生影響，其中PCDH18a和PCDH18b均參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的全過程。國外研究還運(yùn)用斑馬魚胚胎作為重金屬、農(nóng)藥等環(huán)境毒物對神經(jīng)系統(tǒng)毒理機(jī)制的研究模型，研究發(fā)現(xiàn)，將斑馬魚胚胎早期暴露與鎘環(huán)境中，會引起小腦發(fā)育不全，毒性病理基礎(chǔ)為小腦畸形和中后腦分界不清晰等；鉛污染在斑馬魚胚胎神經(jīng)發(fā)育中也具有顯著的毒性，可以引起游動或行動遲緩等，這都將為金屬鎘對哺乳動物神經(jīng)發(fā)育的毒性研究提供參考依據(jù)。除此以外，面對當(dāng)前日益研究的環(huán)境污染問題，斑馬魚胚胎能夠廣泛應(yīng)用于重金屬、有機(jī)農(nóng)藥等毒性研究中，為高等脊椎動物的生長環(huán)境研究提供有效幫助，為環(huán)境監(jiān)測發(fā)揮出積極作用。

4　結(jié)語

斑馬魚由于自身明顯的優(yōu)勢，已經(jīng)逐漸成為發(fā)育毒理學(xué)研究中廣泛應(yīng)用的脊椎動物模型，并有效促進(jìn)發(fā)育毒理學(xué)研究進(jìn)展的加快。本文從血管、心臟和神經(jīng)發(fā)育系統(tǒng)出發(fā)，分析總結(jié)斑馬魚胚胎在實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用。但斑馬魚模型也存在一定的局限性，這是由于斑馬魚胚胎、幼魚和成魚之間存在差異，在化學(xué)篩選過程中要在不同生長階段進(jìn)行藥物實(shí)驗(yàn)，因此會造成結(jié)果的不明確；其次，斑馬魚具有親水性和親脂性，無法吸收疏水性小分子化合物，因此在篩選化學(xué)物時要注意斑馬魚皮膚問題，加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的準(zhǔn)確性和科學(xué)性，促進(jìn)斑馬魚在發(fā)育毒理學(xué)應(yīng)用的安全性。

［1］于力群，王厚鵬，朱作言，等.生長激素/催乳素家族配體和受體成員在斑馬魚早期胚胎中的表達(dá)比較和交叉活性分析［J］.水生生物學(xué)報，2014（5）：809-818.

［2］于學(xué)慧，張世棟，張承梅. 發(fā)育生物學(xué)的理想動物模型——斑馬魚［J］.中國實(shí)驗(yàn)動物學(xué)雜志，2001（3）：172-175.

［3］Asharani P V，Yi L，Zhiyuan G，et al.Comparison of the toxicity of silver，gold and platinum nanoparticles in developing zebrafish embryos.［J］.Nanotoxicology，2011（1）：43-54.

［4］李運(yùn)彩，張松林，白芳銘，等.氯代苯和烷基酚類化合物斑馬魚毒性的定量構(gòu)效關(guān)系分析［J］.南方水產(chǎn)，2010（3）：19-23.

［5］嚴(yán)麗鋒，顧愛華.利用斑馬魚胚胎進(jìn)行發(fā)育毒理學(xué)研究的進(jìn)展［J］.東南大學(xué)學(xué)報：醫(yī)學(xué)版， 2012， 31（3）：346-350.

［6］王蕊， 殷浩文.斑馬魚胚胎發(fā)育中適宜的毒理學(xué)指標(biāo)分析［J］. 環(huán)境與職業(yè)醫(yī)學(xué)，2004，21（2）：88-89.

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1674-2060（2016）05-0086-02

歐陽鳳（1976—），女，重慶人，碩士研究生，講師，研究方向：動物資源保護(hù)與利用。