馮素萍 武耀廷

（海南熱帶海洋學(xué)院 海南三亞 572200）

橡膠樹分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)研究進(jìn)展

馮素萍 武耀廷

（海南熱帶海洋學(xué)院 海南三亞 572200）

橡膠樹是一類大規(guī)模化種植具有商業(yè)化特征的產(chǎn)膠植物，有著較高的種植價值。但因其常規(guī)育種周期較長，使得其育種工作的發(fā)展受到很大限制。最近幾年，橡膠樹分子標(biāo)記開發(fā)和利用工作在其應(yīng)用上取得了一定進(jìn)展，推動了育種工作的進(jìn)展。本文就橡膠樹的分子標(biāo)記在遺傳多樣性、構(gòu)建遺傳圖譜、基因定位、輔助育種、品種鑒定方面等方面的遺傳育種研究中做一總結(jié)，并對我國目前橡膠樹分子標(biāo)記方向的發(fā)展勢態(tài)進(jìn)行展望。

橡膠樹 分子標(biāo)記 輔助育種 進(jìn)展

1　遺傳育種研究中橡膠樹的分子標(biāo)記

1.1遺傳多樣性

對育種的工作人員來講，種質(zhì)資源遺傳的多樣性和親緣信息是整個工作的基礎(chǔ)，也是關(guān)鍵。在以前的多樣性分析試驗中，大多數(shù)用用同工酶作為標(biāo)記，但是同工酶有組織特異性和發(fā)育特異性，而且，能提供的標(biāo)記數(shù)量不多?，F(xiàn)在采用的DNA多態(tài)分子標(biāo)記法解決了上述難題。有學(xué)者采用RFLP技術(shù)分別對73個魏克漢品種和95個野生品種做了DNA測定后得出結(jié)論：盡管魏克漢的多樣性低于野生品種，但是這個多樣性的數(shù)量已經(jīng)較高。在對72魏克漢品種和92個野生品種的試驗過程中，31個探針和內(nèi)切酶的結(jié)合一共生成了124RFLP標(biāo)記，且都具有多態(tài)性［1］。數(shù)據(jù)顯示，魏克漢品種和野生品種具有很近的親緣關(guān)系，這些多態(tài)性的標(biāo)記可以將所選擇的野生品種根據(jù)其地理位置分成三大類。同時，還有學(xué)者在對一百零八個橡膠樹的無性系進(jìn)行標(biāo)記分析后得出結(jié)論：野生品種遺傳的多樣性高于人工栽培的品種［2］。有學(xué)者認(rèn)為，雖然魏克漢品種遺傳基礎(chǔ)差、人為干預(yù)程度高，但是其遺傳多樣性仍然較為豐富［3］。有學(xué)者用35個引物對24個品種進(jìn)行試驗，得出結(jié)論，多態(tài)性帶在總擴(kuò)增帶的比例高達(dá)88%［4］。

1.2構(gòu)建遺傳圖譜

現(xiàn)在，很多樹種都建立了完整的高密度的遺傳圖譜。它是定位基因、構(gòu)建物理圖譜、根據(jù)圖譜研究相關(guān)基因等工作的重要前提［5-8］。以橡膠樹為例，科學(xué)家已經(jīng)研究出它的圖譜。有學(xué)者用雙向擬測交的方式建立了該圖譜，該圖譜在RB260XR038范圍內(nèi)的106株子一代樹群進(jìn)行，它包括18個連鎖群，由如下標(biāo)記構(gòu)成：301個RFLP標(biāo)記、388個AFLP標(biāo)記、18個衛(wèi)星標(biāo)記、10個同工酶標(biāo)記；每個標(biāo)記間的圖距是3cM，就覆蓋基因組的總圖距而言，此數(shù)值為2144cM［9］。將334株子一代作為研究材料，學(xué)者Prapan也構(gòu)建了相應(yīng)的遺傳圖譜，該圖譜由SSR標(biāo)記和AFLP標(biāo)記構(gòu)成，前者有247個，后者有198個［9］。有學(xué)者將雜交組合GT1×IAN873的195個親一代群體作為研究材料進(jìn)行了AFLP圖譜的構(gòu)建，其中就連鎖圖譜的總圖距而言，此數(shù)值為1455.57cM，而每個標(biāo)記間的圖距是5.58cM［9］。學(xué)者王惠軍也進(jìn)行了相關(guān)研究，不僅將其18個連鎖群遺傳圖譜做了相應(yīng)的構(gòu)建，還對SRAP標(biāo)記和SSR標(biāo)記進(jìn)行了定位，前者有61個，后者有7個。就此圖譜而言，其覆蓋基因組長度的值是774 cM，就其平均圖距而言，其值為11.38 cM，就單個連鎖群的遺傳長度而言，其值控制在51-85 cM，而就該群的標(biāo)記數(shù)而言，其值有2-8個，同時有著0.5-25.5 cM的圖距。該連鎖群的偏分離的標(biāo)記有18個，占有26.5%的比例［3］。學(xué)者馮素萍將94個子一代群體作為研究材料，對橡膠樹進(jìn)行了遺傳圖譜的構(gòu)建，該圖譜有91個SSR標(biāo)記，覆蓋的連鎖群為18個，有1937.06 cM的圖距，有著107.61 cM的連鎖群平均長度，就每個連鎖群而言，有標(biāo)記2-16個，每個標(biāo)記間的距離為21.29cM；而就每個連鎖群的長度而言，控制在9.33-550.83 cM之間。雖然這些遺傳圖譜都有著一定的缺陷，有待進(jìn)一步完善，但是為橡膠樹更進(jìn)一步的QTL定位以及選擇分子標(biāo)記輔助都奠定了一定的地基［10］。

1.3基因定位

要想對基因進(jìn)行定位，首先要建立一張高密度的基因圖譜，利用圖譜定位的機(jī)理和傳統(tǒng)遺傳學(xué)較為相似，都是利用分析標(biāo)記特征和目標(biāo)性狀的重組值來預(yù)估標(biāo)記和性狀之間的關(guān)聯(lián)及遺傳距離。運(yùn)用多個連鎖反應(yīng)，就可把掌控某一個性狀基因的精準(zhǔn)位置確定下來。有學(xué)者在對PB260品種和種內(nèi)雜種RO38以及它們的195株子一代個體進(jìn)行了監(jiān)測抗南美葉疫病的QTL定位，他們在PB260樹種中發(fā)現(xiàn)了一個抗性QTL，在RO38中找到了8個抗性QTL，子一代樹種不僅遺傳了親本的抗性，同時自己產(chǎn)生了兩個新的抗性［11-13］。采用復(fù)合區(qū)間作圖的方法，學(xué)者和麗崗進(jìn)行了橡膠樹多個性狀的QTL定位，其中，與莖圍有著相關(guān)性的QTLs有13個，與干膠含量有著相關(guān)性的QTLs有2個，與乳膠蔗糖有著相關(guān)性的QTLs有10個，與無機(jī)磷含量有著相關(guān)性的QTLs有10個，與膠乳硫醇含量有著相關(guān)性的QTLs有10個［2］。這些工作為更好的克隆相關(guān)基因以及輔助分子標(biāo)記進(jìn)行育種的選擇工作奠定了堅實的力量。

1.4輔助育種

運(yùn)用分子標(biāo)記來輔助選擇，它是指運(yùn)用對與目標(biāo)基因緊密關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記基因型進(jìn)行分析來綜合判定是否有目標(biāo)基因的存在［14-17］。這種選擇的方式比較間接，不容易受到其他基因效應(yīng)和外界環(huán)境因素的影響，所以利用這一方法得出的結(jié)論很可靠，同時，因為這一過程是在早期進(jìn)行，所以很大程度上縮短了育種的時間，進(jìn)一步加快了整個育種的速度［18］。試驗證明，在番茄的回交育種時，每個回交過程產(chǎn)生30個植株，使用分子標(biāo)記的輔助方法進(jìn)行選擇，只需要三代，就能完全恢復(fù)成親本的基因型，要是采用傳統(tǒng)的回交進(jìn)行育種的話，至少需要六代。學(xué)者陳守才等通過對11個抗白粉病品系和11個感病品系進(jìn)行分析它們的RAPD結(jié)果，找到一個和抗白粉病關(guān)聯(lián)的OPV-390標(biāo)記。還有學(xué)者在對上述兩個橡膠樹進(jìn)行AFLP分析后得出結(jié)論，找到一個和抗白粉病相連鎖的標(biāo)記，它大約有320bp大?。?9］。另一位學(xué)者在子一代樹種中找到一個與矮生關(guān)聯(lián)的標(biāo)記，它大約是1.4kb大小。上述這些標(biāo)記的相繼發(fā)現(xiàn)，為下一步橡膠樹抗病分子的育種打好基礎(chǔ)［20］。

1.5品種鑒定

一段時間以來，人們往往是通過分辨橡膠樹的外部形態(tài)的特征來區(qū)別橡膠樹的品種，當(dāng)其外部形態(tài)差別較為微小時，這一方法明顯就派不上用場。因為一個物種的多個品種之間有相當(dāng)數(shù)量的不同的DNA分子標(biāo)記，所以根據(jù)某一個品種的特殊標(biāo)記來把它和其他品種進(jìn)行區(qū)分鑒定，這種方法更科學(xué)，更精準(zhǔn)。有學(xué)者運(yùn)用人源微衛(wèi)星探針對選出的73個魏克漢品種進(jìn)行了分析研究，結(jié)果顯示，這73個品種都能很輕松的就分別開來，同時，同一品種的DNA完全吻合［9］。另一學(xué)者運(yùn)用RFLP標(biāo)記的方法能夠?qū)⑷贩N區(qū)分開來［1］。上述實驗證明，使用DNA標(biāo)記的方法來甄別橡膠樹的種類是科學(xué)的。

2　我國目前在橡膠樹分子標(biāo)記方向的發(fā)展勢態(tài)

我國分子標(biāo)記用于橡膠樹研究的時間比較晚，和國外先進(jìn)的地區(qū)比較差距不少。為了進(jìn)一步推進(jìn)橡膠樹的分子標(biāo)記研究的進(jìn)程，提升試驗植株的精確度，減短育種的周期，提高實驗的效率，進(jìn)一步推進(jìn)我國橡膠樹研究的發(fā)展，筆者認(rèn)為，應(yīng)從以下幾個方面著手：

2.1分析遺傳多樣性

橡膠樹的遺傳試驗的選種范圍很窄，這一關(guān)鍵也是阻礙我國橡膠樹研究的難題。怎樣才能增多遺傳試驗的選種范圍，只有充分發(fā)掘野生的橡膠樹品種。野生品種中富含有大量的優(yōu)質(zhì)基因，比如：抗病、抗寒、速生基因等等，運(yùn)用雜交的方式 讓野生基因和培育基因相結(jié)合，才能栽育出更適合實際生產(chǎn)需求的橡膠樹品種。分子標(biāo)記的方法可以甄別出橡膠樹的親緣關(guān)系怎樣，然后才能作為整個選配雜交品種的依據(jù)，以防盲目操作，提升工作的效率。

2.2選擇和特異性相關(guān)的分子標(biāo)記

橡膠樹傳統(tǒng)的育種過程由于受到橡膠樹本身屬性、生長過程長、育種早期受限等因素的影響，工作效率低，速度慢。分子標(biāo)記法和傳統(tǒng)育種方法相結(jié)合，育種周期明顯減短、速度顯著提升。特別是標(biāo)記和目的性狀結(jié)合，能明顯提升標(biāo)記選擇的精準(zhǔn)度。只有增多連鎖標(biāo)記的數(shù)量才能排除標(biāo)記的異常，這一方法在整個實驗植株中進(jìn)行選擇，能更好的分子標(biāo)記的方法用到實際育種過程中。

2.3建立遺傳圖譜

圖譜的建立是整個遺傳過程中一大關(guān)鍵組成部分，是整個過程的先決條件，同樣也是整個遺傳實踐操作過程的科學(xué)依據(jù)。隨著橡膠樹遺傳圖譜的完善，可以依據(jù)這一原則，可以更好地定位能提高質(zhì)量和數(shù)量性能的基因、克隆好的基因、明確基因功能等。這些功能最大限度地推進(jìn)我國在橡膠樹基因研究領(lǐng)域的進(jìn)程。

2.4編制DNA指紋圖譜

橡膠樹的DNA指紋象人的指紋一樣，具有個體差異性和較高的變異特點，這種方法不易受到外界氣候等環(huán)境地影響。給橡膠樹繪制DNA圖譜，建設(shè)指紋數(shù)據(jù)庫，能在日常生產(chǎn)過程精準(zhǔn)、快捷、便利地甄別品種。

3　展望

綜上所述，就橡膠樹分析標(biāo)記的開發(fā)以及應(yīng)用而言，在我國已經(jīng)取得一定成績，但不論是在數(shù)量方面，還是在種類方面，分子標(biāo)記都不能及時滿足橡膠生物學(xué)研究的相關(guān)需求。最近幾年，伴隨著測序以及組裝技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，有著更多的橡膠樹轉(zhuǎn)錄組和基因組測序數(shù)據(jù)產(chǎn)生，如此使得橡膠樹分子標(biāo)記的大規(guī)?；_發(fā)成為必然趨向，而分子標(biāo)記在數(shù)量以及種類方面的增加也將更好的推進(jìn)其在構(gòu)建遺傳圖譜、克隆和定位遺傳基因、分析遺傳多樣性、輔助育種的應(yīng)用，進(jìn)而使得橡膠樹的研究工作得以更好發(fā)展。

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S794.1

A

1674-2060（2016）05-0084-02

國家自然科學(xué)基金，31100495，橡膠樹分子標(biāo)記的開發(fā)、遺傳圖譜的構(gòu)建及膠乳產(chǎn)量相關(guān)性狀的QTL 定位；海南省自然科學(xué)基金，314084，基于巴西橡膠樹EST序列的抗性基因鑒定、標(biāo)記開發(fā)和初步應(yīng)用研究。

馮素萍（1972—），女，河南汝州人，博士，海南熱帶海洋學(xué)院教師，副教授，研究方向：橡膠樹分子育種研究。