蔡繼翔，劉　燁，梁明才，楊　林

(哈爾濱工業(yè)大學化工學院，哈爾濱 150090)

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單細胞凝膠電泳應用研究進展

蔡繼翔，劉燁，梁明才，楊林*

(哈爾濱工業(yè)大學化工學院，哈爾濱 150090)

摘要：單細胞凝膠電泳技術是被廣泛使用的檢測 DNA 損傷的技術，其具有靈敏度高、簡便、經濟、快速等各種優(yōu)點。在近 30 年來，該技術廣泛被應用于遺傳毒理、環(huán)境監(jiān)測、醫(yī)學診斷等研究及各類實驗證實方面。近些年單細胞凝膠電泳與熒光原位雜交等其他技術相結合后更是拓寬了它的應用范圍，本文主要介紹了單細胞凝膠電泳的原理及優(yōu)劣，并重點闡明了其在遺傳毒理學、細胞凋亡、環(huán)境監(jiān)測、群體生物學、臨床診斷與治療，生物信息學領域上的應用，并討論了它的發(fā)展前景。

關鍵詞：單細胞凝膠電泳；優(yōu)勢；應用；發(fā)展

單細胞凝膠電泳(Single cell gel electrophoresis，SCGE)，又稱彗星實驗，是一種快速并大通量的檢測DNA損傷的方法。20世紀70年代末 Rydberg 和 Johanson 最早報道利用該方法直接定量檢測單個細胞 DNA 損傷[1]。首先將靶細胞包埋于低熔點瓊脂糖中，利用裂解液裂解，在弱堿性解旋液作用下使 DNA解螺旋，中和后，利用丫啶橙染色并用光度計測定單雙鏈，對比檢測DNA損傷情況。但最終因其操作難度問題，該方法未能廣泛應用。

為了提升此方法的敏感性，1984年，Ostling和 Johanson發(fā)展了微凝膠電泳技術，該方法與現在的SCGE方法較為接近。同樣，首先將細胞加入到低熔點瓊脂糖中，將凝膠固定在載玻片后在裂解液作用下裂解，然后在中性(后發(fā)展堿性)條件下進行電泳，若有DNA 斷裂片段，則其會向陽極移動，從而形成彗星尾巴，此DNA損傷程度與彗星尾長度成正相關。該方法從誕生之初已歷經30多年，隨著時間的推移，這種方法已得到改進，但現在仍沒有完全標準化。

1單細胞凝膠電泳原理

造成細胞 DNA 斷裂的原因比較復雜。其中，化學介質，如氧自由基(Reactive oxygen species ,ROS) 是極其重要的因素。一般地，細胞在氧自由基作用下，細胞內的 DNA 直接受到損傷，引起高級結構的變化，致使其超螺旋結構松散。SCGE方法首先利用細胞裂解液，破壞檢測細胞細胞膜，從而使內部小分子的 DNA及其他成分因膜破壞而進入凝膠，但細胞中的大分子核 DNA 會仍留在原位，核骨架會使其固定在原位。如果檢測細胞 DNA 未出現損傷問題，結果圖片會顯示較為規(guī)則的圓形的熒光團，無拖尾現象，表明核 DNA 完整地停留在核基質中。若檢測細胞 DNA 受到損傷，在堿性電泳液 (pH > 13)的作用下，DNA 由雙鏈解螺旋變?yōu)閱捂?，在電泳作用下，損傷細胞DNA的單鏈斷裂并且會向陽極遷移，形成拖尾。同樣，細胞核 DNA 受損傷程度越高，產生的斷鏈及DNA碎片會越多，最后熒光檢測得到的彗星尾越長和彗尾越亮[2]。該實驗最終通過熒光顯微鏡觀察結果圖片有無彗星及彗尾的亮度、長度、彗尾比例等，判斷檢測細胞 DNA 是否受到損傷及損傷程度。

2單細胞凝膠電泳優(yōu)劣

SCGE 在分析細胞DNA損傷方面相對快速、簡單和敏感。其能夠結合其他DNA損傷相關技術，例如交聯(lián)ALS，從而更全面地進行細胞遺傳學分析。

與其他的遺傳毒理學檢測方法相比，SCGE 主要存在以下優(yōu)點：(1)數據可以以單細胞水平顯示說明；(2)所需樣本量少，只需要一小部分細胞；(3)適用范圍廣泛，幾乎適用所有的真核細胞群；(4)測定結果敏感，操作簡單，成本較低；(5)結果獲得較為快速，若干小時可得到結果；(6) 具有多種檢測功能，結果圖較為直觀，易分析。

最近對SCGE研究發(fā)現，其不僅僅可以識別致癌物，而且可以測試細胞中DNA的損壞程度。在自然界中，有許多化學物質是致癌物質，但并不是每一種致癌物質都會造成DNA破碎，有些致癌物只會造成DNA損害，SCGE可以在細胞進行修補時，發(fā)現這一類的致癌物質，這是以往的測試都無法做到的。

盡管SCGE有許多優(yōu)點，但目前該方法主要通過結果圖片分析進行DNA損傷檢測，并沒有一個完全可靠的生物標記物確定DNA損傷。因此，一般需要與其他方法聯(lián)用使結果更加明確。另一方面，使用 SCGE 方法的實驗室很多，但實驗不盡相同，這就導致的不同實驗室SCGE分析結果之間的可比性較差。SCGE自誕生開始，其具體方法都在不斷探索和進步，整個實驗方法仍沒有完全標準化，因其涉及領域較為廣泛，所以，標準化較為困難。

3單細胞凝膠電泳應用

3.1遺傳毒理學應用

SCGE 可檢測 DNA 交聯(lián)、氧化性損傷與DNA 切除修復缺陷等多種類型的 DNA 損傷，因此該方法是研究遺傳毒理學極為適用的方法之一[3]。

在遺傳毒理學領域，大量的研究人員采用堿性SCGE來評估化學物質在體外或體內實驗中的基因毒性。彗星實驗可用于在體外研究中檢測各種正常和轉化的人類、動物和植物細胞。當然它同樣適用于人類功能細胞，包括白細胞和淋巴細胞及其他組織細胞，如上皮細胞、生殖細胞、結腸細胞、胰島細胞、腺癌細胞等。SCGE也能夠檢測不同的細胞系及不同類型的癌細胞，如結腸癌、膀胱前列腺癌、黑色素瘤、神經膠質瘤等等[4]。標準的體內堿性SCGE可以很容易地適應調查生殖器官的細胞。多研究表明，在生殖細胞誘變劑的風險評估方面，彗星試驗方法具有明顯優(yōu)勢[5]。

SCGE 在動物細胞DNA損傷及相關研究方面也卓有成效。因其所需實驗樣本少，任何組織及器官均能被用于檢測，所以已有大量的檢測工作被完成。其中，嚙齒動物更加被頻繁地檢測，但其他動物，如狗、羊、蝌蚪和魚同樣能夠被較好檢測。SCGE方法已經應用于動物的多個器官和組織，包括血液、骨骼、大腦、胃腸粘膜、腎、肝、肺、鼻粘、卵巢、皮膚、脾臟和睪丸等[6]。

Speit 等使用SCGE的研究表明，當 DNA 鏈中出現一個修復通路出現問題，DNA整鏈都有可能出現嚴重受損[7]。當前, 在檢測出某種物質特別是化學物質對 DNA 修補的影響方面，除去SCGE方法，其他方法都不能準確地進行分析測定。目前只有彗星分析法能夠精確地測出 DNA 修復功能[8]，并及時發(fā)現致畸物質。彗星分析法還可用來確定某種物質是否是毒性物質, 并明確人體 DNA 損傷或修補受其影響的程度?？衫肧CGE進行人體白細胞的體外實驗，如果被測物質是有毒物質，那么 DNA 將出現損傷，而出現損傷的 DNA 在結果上會顯示彗星形狀[9]?；瘜W品測試在這一領域的數量迅速增加，至今已有大量化學物質進行了遺傳毒理學方面的檢測，如重金屬、各類農藥、亞硝胺等。

3.2DNA損傷及細胞凋亡的研究應用

因為SCGE的特點，該方法幾乎被用來評估任何類型的真核細胞的DNA修復能力及包括雙、單鏈斷裂的不同的DNA損傷情況。中性和堿性的SCGE可分別用于分析和評估單鏈及雙鏈DNA的損傷修復。同樣，該方法可用于檢測電離輻射引起的單和雙鏈斷裂及細胞修復。

有研究采用堿性SCGE方法檢測健康受試者在受輻射情況下，外周血淋巴細胞DNA損傷和修復的。該方法具有能夠分析單個細胞的優(yōu)勢，能夠明確DNA受損細胞分布及程度。同樣，可以直接使用該方法對如紫外線輻射導致的不同程度的DNA鏈斷裂進行化驗檢查。堿性SCGE可用來檢測DNA切除修復、DNA合成抑制劑鏈終止劑的作用。也有實驗用該方法試驗各類酶治療損傷DNA細胞的效果。

因為SCGE方法的高靈敏度，也被應用于研究凋亡的DNA片段。細胞凋亡是人體自我保護的一種形式，如果存在一個細胞DNA損傷過于嚴重，已經無法修補，凋亡程序就會觸發(fā)。如果缺失細胞凋亡功能或細胞凋亡功能紊亂，那么DNA損傷細胞會繼續(xù)復制，從而危及生物體全身。凋亡功能的喪失可能會導致癌癥的發(fā)生。相比于其他方法，單細胞凝膠電泳技術能夠更快速并且準確地檢測到已喪失凋亡功能的細胞，也可以提供細胞自殺過程的早期資料[10]，以上優(yōu)點使該方法在研究細胞凋亡方面具有重要作用，出現凋亡現象的細胞DNA 在結果圖中會顯示初期為嚴重的細胞拖尾現象，其尾部占有比重極高。SCGE方法還可通過計數統(tǒng)計等方法快速測定凋亡細胞的比例。

3.3環(huán)境污染監(jiān)測中的應用

隨著科技發(fā)展，環(huán)境污染愈發(fā)嚴重，而且環(huán)境污染與生物細胞DNA 損害關系密切，嚴重環(huán)境污染可能導致周圍生物癌變，因此人們對環(huán)境污染監(jiān)測越來越重視。環(huán)境污染中的生物、物理、化學因素都能導致細胞 DNA損傷，引起基因突變和細胞癌變。所以判斷細胞 DNA 是否出現損傷情況在環(huán)境監(jiān)測方面尤為重要。SCGE能夠檢測不同生物不同細胞的不同類型的遺傳毒性損傷情況。其具有利用少量細胞提供數據、結果敏感、實驗快速、成本低、效率高等優(yōu)點，因此彗星實驗方法被廣泛用于環(huán)境污染物的監(jiān)測中。

在空氣污染物方面，二氧化硫及飄塵是最主要的監(jiān)測指標。SO2能引起 DNA 損傷的出現，而且進一步研究分析二者存在一定的劑量效應關系。張愛華等[11]用SCGE檢測燃煤引起的砷中毒患者血細胞 DNA 的損傷情況，結果表明砷能引起人體血細胞 DNA 單鏈斷裂。

大量研究報告表明SCGE在檢測水生環(huán)境中極具潛力。過去的5年的研究發(fā)現，和其他常用的遺傳生態(tài)毒理學生物標志物相比，在對水生生物遺傳毒理檢測更具敏感性[12]。有研究使用SCGE檢測利用工業(yè)用水所培養(yǎng)細胞的DNA損傷情況。由于其高靈敏度，SCGE已被廣泛用于魚和貽貝細胞的實驗室標準檢測中。SCGE也同樣被利用于水質檢測中[13]。

近年來，SCGE，在評估暴露人群的DNA損傷方面已成為一個重要的工具。SCGE已作為首選方法適用于人群為基礎的環(huán)境污染研究中。在對個體暴露于空氣污染物、金屬、農藥、輻射等有害異物研究中，有研究利用SCGE檢測廢物回收站附近動物，發(fā)現其腦DNA損傷概率顯著上升。利用堿性SCGE方法測定不同土壤樣本中的蚯蚓DNA損傷情況從而作為土壤污染的指標。由于SCGE方法的方便操作，因此，DNA損傷的報告通常由該方法檢測，SCGE的成功反映在過去30年，環(huán)境監(jiān)測領域有越來越多的研究、報告使用其進行檢測[14]。

生產過程中同樣會產生各類有毒物質。一般主要通過DNA損傷檢測來確定這些物質是否具有致癌性或致突變性。生產中的某些物質可直接導致 DNA 斷裂。而另一些物質則需在體內經代謝活化后會存在致癌性。王濤等[15]利用體外活化系統(tǒng)，利用SCGE方法檢測了黃曲霉毒素、苯并(a)芘等9種間接致突變物與DNA 損傷程度的關系，其結果具有顯著性。

由此可見，在環(huán)境監(jiān)測中，用SCGE檢測 DNA 損傷的應用范圍極其廣泛，其對環(huán)境污染物的影響檢測尤為重要[16]。

3.4人群監(jiān)測

SCGE可用于群體生物學檢測，全美通訊網項目招募了近100名研究小組共享數據集。利用SCGE，通過其在生物監(jiān)測研究中多樣化的應用，檢測人類的DNA損傷水平與環(huán)境和職業(yè)接觸毒性藥物，飲食和其他因素的關系[17]。

SCGE能夠應用于人群監(jiān)測的主要原因是其所需樣本數量少，只要明確年齡、工作環(huán)境等因素，只需要從研究對象獲得少量細胞就能夠進行研究。大量實驗主要通過檢測有核血細胞的DNA損傷來進行評價。有研究利用SCGE方法檢測20歲人群淋巴細胞DNA損傷情況。研究調查200名健康人，利用堿性彗星方法檢測DNA遷移的程度，發(fā)現吸煙者的血液淋巴細胞DNA受損率顯著增加，且其中男性比率高于女性。

彗星分析法與其他分析法最顯著的區(qū)別是SCGE可檢測正常人群并明確修復情況。其能測出 DNA 損傷程度，其他測試法只能明確某一種物質是否會導致DNA損傷，卻無法測出其損傷程度，更無法測出 DNA 修補的情況及速度[18]。

3.5臨床診斷與治療監(jiān)測

利用中性SCGE可檢測接受放射治療的病人的腫瘤細胞及一般細胞的DNA損傷情況，該方法已在何杰金氏病、非霍奇金淋巴瘤、鱗狀細胞癌或腺癌方面有所應用。由于該方法所需樣本較少，所以只要少量血液或固體組織就能進行判斷。采用堿性SCGE，可檢測在輻照條件下乳腺癌的缺氧細胞數量，該方法在此條件下具有較高敏感性[19]。同樣，也有利用堿性彗星實驗方法確定白內障晶狀體上皮細胞DNA損傷。

在腫瘤研究方面，DNA 損傷和 DNA 修復缺陷是癌癥發(fā)生的分子基礎。許多基礎研究與臨床研究，采用SCGE，來研究各種各樣的腫瘤細胞對各類 DNA 損傷制劑的生物學效用，并得到重要的結果，使得腫瘤科學家得知最佳干預的時機。

在腫瘤放療敏感性研究方面，由于腫瘤對于放療反應是存在差異，預測腫瘤對于放療的敏感性長期追求的目標，有多種因素可影響腫瘤的放療效果，尚無一種方法來預測腫瘤對于放療是否發(fā)生反應，而SCGE在目前被基礎和臨床腫瘤治療學推崇的最最先進的技術。同樣，在腫瘤化療敏感性預測方面，由于腫瘤細胞對于各種化學藥物的反應是存在極其大的差異，因此無論在腫瘤的治療之前，尤其是在治療的過程中，及時了解腫瘤治療的進程，藥量的大小，治療方案選定，SCGE是國際治療所推薦的方法。

利用SCGE檢測DNA損傷的程度與治療的結果的聯(lián)系還有待建立。在未來，SCGE可能可以作為研究新藥物和抗腫瘤之間的相互作用機制分析的重要方法。

3.6高通量生物信息學研究的實驗驗證

生物信息學是一門收集、分析遺傳數據并進行相關研究的學科，生物信息學特指數據庫類的工作，其研究需要大量數據的支持。從某種角度而言，生物信息學是把基因組DNA序列信息分析作為源頭的。

生物信息學是建立在分子生物學的基礎上的，而SCGE方法在分子生物學上應用廣泛。尤其在研究DNA損傷及修復的相關生物信息學方面，SCGE作用尤為顯著。在研究動物、人體DNA損傷相關基因及其通路的信息學研究方面，SCGE對各類實驗都能夠起到驗證作用。

4單細胞凝膠電泳發(fā)展

Santos 等人于1997 年創(chuàng)立了彗星電泳和熒光原位雜交技術聯(lián)用(Comet-FISH)[20]。該方法是在原有SCGE方法基礎上加以改善，其主要變化是在解旋和電泳完成后加入了原位雜交這一步驟，從而能夠在檢測 DNA 上確定特殊的基因序列，之后可以通過熒光顯微鏡鏡檢測得到目的基因DNA 片段是否存在損傷。如果FISH 標記的熒光信號只是出現在彗星頭部，這就表明目的基因所處的DNA片段無損；如果在彗星尾部發(fā)現該基因所標記熒光信號，這就表明目的基因所處DNA存在損傷情況。熒光原位雜交一般是通過寡聚核苷酸或 cDNA探針在 DNA 變性以及復性的過程中通過識別目的基因、匹配目的序列基因從而雜交成功，但是這一技術的關鍵所在是如何能夠與在低熔點瓊脂糖中包埋的目的DNA 雜交。Santos等人通過使用化學變性法，在加入探針前，先將整個載玻片在變性液中放置30min，然后再將其置于中和液內中和，通過不同梯度乙醇進行脫水處理，最后加入探針雜交。

Reite等人[21]利用該方法技術檢測了病人口咽癌細胞中EGFR 基因的表達，從而證實了在口咽癌細胞中，EGFR 基因存在表達現象。

隨著SCGE方法的不斷發(fā)展，為了讓我們更加細致，明確地分析SCGE實驗結果圖，分析尾矩、尾部DNA、頭部DNA含量等。國內外已經研發(fā)了各類分析軟件。除了部分昂貴的商業(yè)軟件外，也出現了一些免費的彗星分析軟件。如 CASP軟件，其能夠測量彗星強度、尾長、頭面積、尾面積、尾部DNA含量、尾矩等多項參數，而且軟件操作簡便、快捷，便于使用。

同樣，隨著SCGE方法的發(fā)展及不斷使用，各種SCGE試劑盒也應運而生，使該方法的操作更加簡單，方便。

5展望

相比其他實驗方法，在DNA損傷檢測方面，SCGE是一種敏感、可靠而且快速方法。它可以檢測DNA雙單鏈斷裂，可精確到單個細胞。鑒于其總體特征及優(yōu)勢，在過去的十幾年里，該方法發(fā)展迅速，已廣泛應用于各個方面。

SCGE在基因毒性、臨床、DNA修復、環(huán)境生物監(jiān)測、人工監(jiān)測和生物信息學等領域的發(fā)展前景幾乎是無限的。在未來，SCGE還可能會影響其他重要領域，并不斷發(fā)展。

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Research progress about the application of single cell gel electrophoresis

CAI Jixiang, LIU Ye, LIANG Mingcai, YANG Lin*

(SchoolofChemicalEngineering,HarbinInstituteofTechnology,Harbin150090,China)

Abstract：The single cell gel electrophoresis is a common technology for the detection of DNA damage.It has the advantages of high sensitivity,economic,easy and fast.In the past 30 years three decades,this technology has been widely used in genetic toxicology,environmental monito-ring,medical diagnostics and nutrition research.Recently,single-cell gel was widely used in many fields by combining with fluorescence in situ hybridization.This article reviewed the applications of single cell gel electrophoresis in various fields,and discussed its development prospect.

Keywords：Single cell gel electrophoresis；Advantage；Application；Development

收稿日期：2015-11-19；修回日期：2016-04-12.

基金項目：國家自然科學基金面上項目(No.31371755)。

作者簡介：蔡繼翔，男，碩士研究生，研究方向：功能性食品；E-mail:nb200zhengjf@163.com. *通信作者：楊林，女，教授，博士生導師，研究方向：食品安全與功能研究；E-mail: ly6617@hit.edu.cn.

doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2016.02.05

中圖分類號：Q523

文獻標志碼：A

文章編號：1672-5565(2016)02-095-05