冀美超 姜虹羽 董智雄 朱長軍

300387天津師范大學生命科學學院，天津市動植物抗性重點實驗室，天津師范大學分子細胞系統(tǒng)生物學重點實驗室

驅(qū)動蛋白KIF4A抑制胃癌細胞的侵襲作用

冀美超 姜虹羽 董智雄 朱長軍

300387天津師范大學生命科學學院，天津市動植物抗性重點實驗室，天津師范大學分子細胞系統(tǒng)生物學重點實驗室

目的應用胃癌細胞SGC-7901以及穩(wěn)定低表達驅(qū)動蛋白KIF4A的胃癌細胞SGC-shKIF4A，研究KIF4A對胃癌細胞侵襲能力的作用。方法使用蛋白免疫印跡法鑒定對照胃癌細胞SGC-shNC以及SGC-shKIF4A細胞內(nèi)KIF4A蛋白的表達水平，并通過細胞侵襲實驗計數(shù)這兩種細胞的侵襲能力。通過細胞免疫熒光染色法觀察在SGC-7901、SGC-shNC、SGC-shKIF4A細胞中皮層肌動蛋白（cortactin）的數(shù)量變化情況。結(jié)果與對照細胞SGC-shNC相比，SGC-shKIF4A細胞侵襲能力明顯增強；與其他細胞相比，SGC-shKIF4A細胞的cortactin數(shù)量明顯增多（P＜0.01），表明該細胞內(nèi)侵襲性偽足增多。結(jié)論驅(qū)動蛋白KIF4A具有抑制胃癌細胞的侵襲作用，這為KIF4A作為靶點應用于胃癌的預后預測以及有效治療奠定理論基礎(chǔ)。

KIF4A；皮層肌動蛋白；細胞侵襲；胃癌細胞

Fund program:General Program of National Natural Science Foundation of China(31271485)；Program for New Century Excellent Talents in University in China(NCET-11-1066);National Natural Science Foundation for Young Scientists of China(31301138);Tianjin Science and Technology of Small and Medium-sized Enterprise Technology Innovation Fund(14ZXCXSY00121)

0 引言

腫瘤是類常見多發(fā)疾病，其中惡性腫瘤是威脅人類健康最嚴重的疾病之一。我國現(xiàn)有癌癥患者300多萬，每年死于惡性腫瘤的患者約為130萬。胃癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一，我國及日本、韓國是胃癌高發(fā)區(qū)。我國每年新發(fā)病例約40萬例，占世界總發(fā)病例數(shù)的42%[1]。胃癌在我國惡性腫瘤中的發(fā)病率和病死率均居首位[2]。研究發(fā)現(xiàn)，90%以上的惡性腫瘤患者最終死于腫瘤轉(zhuǎn)移或復發(fā)。眾所周知，侵襲性和遠端轉(zhuǎn)移的特性是惡性腫瘤最主要的生物學特性，也是惡性腫瘤難以根治的主要原因。因此，研究調(diào)控腫瘤細胞侵襲能力的具體分子機制，建立有效的阻斷方式具有重要的臨床實踐指導價值。

染色體驅(qū)動蛋白分子KIF4A參與細胞有絲分裂過程中紡錘體的形成[3]、染色體的凝集與分離[4]、腦神經(jīng)元的發(fā)育與再生[5]、DNA的損傷應答[6]、免疫細胞的活化[7]、細胞骨架微管動態(tài)不穩(wěn)定性（microtubule dynamicinstability）的調(diào)控[8]及細胞內(nèi)的大分子運輸[9]等。早期研究發(fā)現(xiàn)，KIF4A蛋白與胃癌細胞的發(fā)生發(fā)展以及胃癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)[10-12]，但KIF4A蛋白對胃癌細胞侵襲能力的影響研究尚無報道。為此，筆者采用對照胃癌細胞SGC-shNC及穩(wěn)定低表達KIF4A胃癌細胞SGC-shKIF4A為實驗模型，研究KIF4A蛋白對胃癌細胞侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

RPMI1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（美國Hyclone公司），遺傳霉素（G418）（德國Calbiochen公司），特異性多克隆兔抗KIF4A抗體（天津師范大學分子細胞系統(tǒng)生物學重點實驗室自制），特異性單克隆鼠抗微管蛋白（tubulin）抗體（美國Sigma公司），特異性單克隆鼠抗皮層肌動蛋白（cortactin）抗體（美國Millipore公司），熒光標記或辣根過氧化物酶（HRP）標記的二抗和4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）（美國Invitrogen公司），胃癌細胞SGC-7901（美國ATCC），對照細胞株SGC-shNC和KIF4A穩(wěn)定低表達胃癌細胞系SGC-shKIF4A1、SGC-shKIF4A2、SGC-shKIF4A3（天津師范大學分子細胞系統(tǒng)生物學重點實驗室構(gòu)建）[13]，Transwell小室（北京優(yōu)尼康生物科技有限公司），基質(zhì)膠（matrigel）（美國BD Biosciences公司）。TS-100FL倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

SGC-7901細胞用含體積分數(shù)為10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，SGC-shNC、SGC-shKIF4A1、SGC-shKIF4A2和SGC-shKIF4A3細胞均用含體積分數(shù)為10%胎牛血清、質(zhì)量濃度為0.1 mg/ml G418的RPMI1640培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，采用含質(zhì)量濃度為0.2 g/L EDTA的胰酶消化細胞并進行傳代。

1.2.2 鑒定各細胞的KIF4A蛋白表達量

分別收集1×105個SGC-shNC、SGC-shKIF4A1、SGC-shKIF4A2、SGC-shKIF4A3細胞，用全細胞裂解液（質(zhì)量濃度為20 g/L十二烷基硫酸鈉（SDS），體積分數(shù)為10%的甘油，50 mmol/L Tris-Cl，體積分數(shù)為1%的β-巰基乙醇，質(zhì)量濃度為0.4 g/L的溴酚藍）裂解細胞；取適量的細胞裂解液進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）、轉(zhuǎn)膜至聚偏氟乙烯膜；用質(zhì)量濃度為50 mg/ml的脫脂奶粉/Tris緩沖鹽溶液（Tris-buffer saline,TBS）封閉1 h，然后加入質(zhì)量濃度為30 mg/ml的脫脂奶粉/TBST（TBS+吐溫20）孵育一抗2 h或4℃過夜，再加入對應的二抗雜交；洗膜后加入ECL及H2O2（體積比為1 000∶1）的混合液中孵育2 min，曝光。

1.2.3 細胞侵襲實驗

在6 cm細胞培養(yǎng)皿中分別種入適量的SGC-shNC、SGC-shKIF4A1、SGC-shKIF4A2、SGC-shKIF4A3細胞，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；待細胞完全貼壁正常生長后，對細胞進行饑餓培養(yǎng)24 h；在進行饑餓處理的同時，在Transwell小室的上室鋪100 μl體積分數(shù)為2%的基質(zhì)膠（基質(zhì)膠用無血清無抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基配制），將鋪好基質(zhì)膠的Transwell小室放于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中；將細胞饑餓處理24h后，采用含質(zhì)量濃度為0.2g/LEDTA的胰酶消化細胞，用含體積分數(shù)為10%胎牛血清的培養(yǎng)基終止胰酶反應，800 r/min離心3 min，棄去培養(yǎng)基；加入1 ml無血清無抗生素的培養(yǎng)基將細胞吹勻，用血球計數(shù)板計數(shù)5×104個細胞接種于Transwell小室上室中，向下室中加入800μl含體積分數(shù)為30%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10~24h；棄去Transwell小室上室的培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline,PBS）洗Transwell小室上下部兩次，每次5min；棄去PBS，棉簽輕輕擦去Transwell小室上室的細胞；下室加入800 μl甲醇固定10 min，棄去甲醇；用質(zhì)量濃度為10 g/L的伊紅染色5 min，棄去伊紅，PBS洗小室1次，每次5 min；刀片切下小室的膜，鋪展在載玻片上，于顯微鏡下觀察。

1.2.4 細胞免疫熒光觀察

向鋪有細胞爬片的24孔板中每孔接種3×104個細胞，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；取出爬片，每孔用500 μl PBS洗3次，每次5 min，棄去PBS；用500 μl體積分數(shù)為4%的福爾馬林固定液固定細胞15min，棄去固定液，用500μlPBS洗3次，每次5 min；加入含有0.1 mol/L甘氨酸的PBS終止固定反應；取出爬片，加100 μl封閉液（體積分數(shù)為10%山羊血清，體積分數(shù)為0.4%TritonX-100，1×PBS）封閉30 min，棄去封閉液；加入100 μl PBS-TX（含體積分數(shù)為0.1%Triton X-100的PBS）洗3次，每次5 min，棄去PBS-TX；加入100 μl PBS-TX稀釋的一抗稀釋液（體積比為1∶1 000）室溫孵育2 h；一抗孵育完成后，加入100 μl PBS-TX洗3次，每次5 min；加入100 μl PBS-TX稀釋的二抗稀釋液（體積比為1∶1 000）室溫避光孵育1 h，棄去二抗稀釋液；加入50 μl PBS-TX稀釋的DAPI（1 μg/ml）染色5 min，棄去DAPI；加入100 μl PBS-TX洗3次，每次5 min，棄去PBS-TX；在載玻片上滴加5 μl抗淬滅劑，將爬片細胞面朝向抗淬滅劑放在載玻片上，吸取多余液體，用指甲油封片，于熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，應用單因素方差分析進行組間比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Western Blot及Scion Image軟件比較短發(fā)夾RNA穩(wěn)定表達細胞株中KIF4A蛋白含量

由圖1A可知，筆者所在實驗室構(gòu)建的4種細胞株中，KIF4A蛋白質(zhì)的表達量存在明顯不同。SGC-shNC細胞作為對照細胞，其KIF4A蛋白的含量明顯高于3種KIF4A短發(fā)夾RAN（shRNA）穩(wěn)定表達的SGC-shKIF4細胞株。應用Scion Image圖像分析軟件對圖1A中的蛋白條帶進行定量分析，以SGC-shNC細胞內(nèi)KIF4A與tubulin含量的比值為1，SGC-shKIF4A1、SGC-shKIF4A2和SGC-shKIF4A3細胞內(nèi)KIF4A與tubulin含量的比值分別是0.208± 0.015、0.263±0.079、0.399±0.145（圖1B）。統(tǒng)計學分析結(jié)果表明，SGC-shNC與SGC-shKIF4A1、SGC-shKIF4A2、SGC-shKIF4A3細胞株中KIF4A蛋白含量間差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而SGC-shKIF4A1、SGC-shKIF4A2和SGC-shKIF4A3細胞株中KIF4A蛋白含量間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。綜上所述，SGC-shKIF4A細胞株中KIF4A蛋白的含量明顯降低，可用于KIF4A對不同細胞侵襲能力影響的研究。

2.2 細胞侵襲實驗

KIF4A是一種染色體結(jié)合驅(qū)動蛋白分子，其功能多樣，并與很多人類重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。前期研究工作發(fā)現(xiàn)，KIF4A與胃癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移相關(guān)[10-12]。但關(guān)于KIF4A是否影響胃癌細胞的侵襲過程尚無報道。為了研究KIF4A對胃癌細胞侵襲過程的影響，筆者以SGC-shNC、SGC-shKIF4A1、SGC-shKIF4A2及SGC-shKIF4A3細胞株為實驗模型進行細胞侵襲實驗研究，并對下室層面的細胞進行計數(shù)。結(jié)果顯示，在10倍鏡下觀察，SGC-shKIF4A1、SGC-shKIF4A2和SGC-shKIF4A3細胞株的侵襲細胞數(shù)約是SGC-shNC的7～10倍，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。表明SGC-shKIF4A細胞株內(nèi)KIF4A的表達被抑制后，胃癌細胞侵襲能力增強。（圖2）

圖1Western Blot比較SGC-shNC和SGC-shKIF4A細胞中KIF4A蛋白的表達水平

2．3SGC-shKIF4A細胞中cortactin蛋白分子數(shù)量增加

侵襲性偽足（invadopodia）是細胞侵襲的重要結(jié)構(gòu)，它可通過調(diào)控細胞外基質(zhì)的降解促進細胞的侵襲。Cortactin蛋白分子對于侵襲偽足的形成及功能是必不可少的，是侵襲性偽足結(jié)構(gòu)的重要組成部分，同時也是常用的侵襲性偽足的標記蛋白[14]。為了研究KIF4A是否通過影響侵襲偽足的形成進而影響細胞的侵襲能力，筆者對不同細胞株中的cortactin蛋白分子進行免疫熒光染色。鑒于細胞侵襲實驗結(jié)果表明SGC-shKIF4A的3種細胞株侵襲能力間差異無統(tǒng)計學意義，故選擇其中的一種細胞株進行實驗。筆者采用免疫熒光染色法對SGC-7901、SGC-shNC及SGC-shKIF4A1細胞株中的cortactin蛋白分子進行染色，并在熒光顯微鏡下觀察計數(shù)侵襲性偽足的數(shù)量（圖3A，黃色箭頭代表cortactin蛋白分子），并通過SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析（圖3B）。結(jié)果顯示，SGC-7901、SGC-shNC和SGC-shKIF4A1細胞株中cortactin蛋白分子數(shù)量分別為30.08±0.85、32.67±0.86、50.33±1.07；與SGC-7901和SGC-shNC細胞株比較，SGC-shKIF4A1細胞株中的cortactin蛋白分子數(shù)量明顯增加（P＜0.01），即侵襲性偽足的數(shù)量增多（圖3B），說明細胞的侵襲能力增強。

3 討論與結(jié)論

驅(qū)動蛋白分子KIF4A是一種多功能馬達蛋白分子，參與調(diào)控細胞有絲分裂、胞內(nèi)大分子的轉(zhuǎn)運以及神經(jīng)元發(fā)育再生等多個細胞基本生命過程。筆者所在實驗室最早報道KIF4A與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[15]。通過對胃癌以及對應的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織進行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)在40例胃癌病例中，有26例患者淋巴結(jié)中KIF4A的表達低于原發(fā)灶癌組織。通過免疫組織化學染色法分析KIF4A在23例胃癌患者組織標本中的表達情況，結(jié)果顯示KIF4A在癌組織中與相應的癌旁組織相比低表達，并與胃癌的病理分化程度密切相關(guān)。進一步比較40例胃癌組織與其對應的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌組織中KIF4A的表達情況，發(fā)現(xiàn)65%（26/40）的轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)癌組織中KIF4A的表達低于其對應的原發(fā)灶癌組織[11]。此外，KIF4A的低表達還與胃癌臨床病理分期（TNM分期）密切相關(guān)[11]。這些研究結(jié)果表明，KIF4A在臨床胃癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮負調(diào)控作用，預示著驅(qū)動蛋白分子KIF4A可作為診斷治療胃癌的新型生物分子靶點。

在本研究中，筆者應用實驗室構(gòu)建的驅(qū)動蛋白KIF4A穩(wěn)定低表達的胃癌細胞，通過細胞侵襲實驗，并經(jīng)統(tǒng)計學分析，發(fā)現(xiàn)KIF4A穩(wěn)定低表達細胞株的細胞侵襲能力明顯強于對照組，說明KIF4A與細胞的侵襲能力負相關(guān)。免疫熒光染色結(jié)果表明，KIF4A穩(wěn)定低表達細胞株中cortactin蛋白分子的數(shù)量增多。而cortactin蛋白分子對于侵襲性偽足的形成及功能是必須的，將cortactin蛋白招募到細胞膜上是侵襲斑形成的重要步驟[14]，因此KIF4A可能通過調(diào)節(jié)cortactin的功能及定位從而對侵襲性偽足的功能及形成有所影響，進而影響細胞侵襲能力，但其具體的分子機制尚不清楚，有待于進一步的研究。本研究率先發(fā)現(xiàn)了驅(qū)動蛋白KIF4A抑制胃癌細胞的侵襲作用，為KIF4A作為靶點應用于胃癌臨床預后預測和有效治療奠定理論基礎(chǔ)。

利益沖突無

（圖2、3見插頁3-5）

[1]鄒文斌,李兆申.中國胃癌發(fā)病率及死亡率研究進展[J].中國實用內(nèi)科雜志,2014,34(4)：408-415. Zou WB,Li ZS.Progress of the incidence and mortality rate of gastric cancer in China[J].Chin J Pract Intern Med,2014,34(4)： 408-415.

[2]張玉超,申虎,雷海龍,等.胃癌治療的研究進展[J].中外醫(yī)療, 2010,29(14)：191-192．DOI：10.3969/j.issn.1674-0742.2010.14.154. Zhang YC,Shen H,Lei HL,et al.Progress of therapy for gastric cancer[J].Chin Fore Med Treat,2010,29(14)：191-192.DOI：10.3969/ j.issn.1674-0742.2010.14.154.

[3]Zhu C,Jiang W.Cell cycle-dependent translocation of PRC1 on the spindle by Kif4 is essential for midzone formation and cytokinesis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A,2005,102(2)：343-348.DOI：10.1073/ pnas.0408438102.

[4]Mazumdar M,Sundareshan S,Misteli T.Human chromokinesin KIF4A functions in chromosome condensation and segregation[J].J Cell Biol,2004,166(5)：613-620.DOI：10.1083/jcb.200401142.

[5]Midorikawa R,Takei Y,Hirokawa N.KIF4 motor regulates activitydependent neuronal survival by suppressing PARP-1 enzymatic activity[J].Cell,2006,125(2)：371-383.DOI：10.1016/j.cell.2006.02. 039.

[6]Wu G,Zhou L,Khidr L,et al.A novel role of the chromokinesin Kif4A in DNA damage response[J].Cell Cycle,2008,7(13)：2013-2020.DOI：10.4161/cc.7.13.6130.

[7]Bernasconi P,Cappelletti C,Navone F,et al.The kinesin superfamily motor protein KIF4 is associated with immune cell activation in idiopathic inflammatory myopathies[J].J Neuropathol Exp Neurol, 2008,67(6)：624-632.DOI：10.1097/NEN.0b013e318177e5fd.

[8]Hu CK,Coughlin M,Field CM,et al.KIF4 regulates midzone length during cytokinesis[J].Curr Biol,2011,21(10)：815-824.DOI：10.1016/ j.cub.2011.04.019.

[9]Martinez NW,Xue X,Berro RG,et al.Kinesin KIF4 regulates intracellular trafficking and stability of the human immunodeficiency virus type 1 Gag polyprotein[J].J Virol,2008,82(20)：9937-9950. DOI：10.1128/JVI.00819-08.

[10]Mazumdar M,Lee JH,Sengupta K,et al.Tumor formation via loss of a molecular motor protein[J].Curr Biol,2006,16(15)：1559-1564. DOI：10.1016/j.cub.2006.06.029.

[11]劉海燕,李陪,高輝,等.染色體驅(qū)動蛋白KIF4A對胃癌細胞遷移和轉(zhuǎn)移的影響[J]．山東大學學報(醫(yī)學版),2013,51(12)：25-28. DOI：10.6040/j.issn.1671-7554.0.2013.549. Liu HY,Li P,Gao H,et al.Effect of chromokinesin KIF4A on gastric carcinoma migration and metastasis[J].J Shandong Univ (Health Sci),2013,51(12)：25-28.DOI：10.6040/j.issn.1671-7554.0. 2013.549.

[12]胡曉晴,梁爽爽,冀美超,等.染色體驅(qū)動蛋白KIF4A抑制胃癌細胞的遷移運動[J].山東大學學報(理學版),2015,50(11)：1-7. DOI：10.6040/j.issn.1671-9352.0.2014.376. Hu XQ,Liang SS,Ji MC,et al.Chromokinesin KIF4A inhibits migration of gastric cancer cells[J].J Shandong Univ(Nat Sci),2015, 50(11)：1-7.DOI：10.6040/j.issn.1671-9352.0.2014.376.

[13]鐘鎧澤,趙健,李陪,等.染色體驅(qū)動蛋白KIF4A穩(wěn)定低表達胃癌細胞系的構(gòu)建及鑒定[J].國際生物醫(yī)學工程雜志,2014,37(1)：22-25.DOI：10.3760/cma.j.issn.1673-4181.2014.01.005. Zhong KZ,Zhao J,Li P,et al.Construction and identification of chromokinesin KIF4A knockdown gastric cancer cell lines[J].Int J Biomed Eng,2014,37(1)：22-25.DOI：10.3760/cma.j.issn.1673-4181. 2014.01.005.

[14]Crowley JL,Smith TC,Fang Z,et al.Supervillin reorganizes the actin cytoskeleton and increases invadopodial efficiency[J].Mol Biol Cell,2009,20(3)：948-962.DOI：10.1091/mbc.E08-08-0867.

[15]Gao J,Sai N,Wang C,et al.Overexpression of chromokinesin KIF4 inhibits proliferation of human gastric carcinoma cells both in vitro and in vivo[J].Tumour Biol,2011,32(1)：53-61.DOI：10.1007/ s13277-010-0090-0.

Chromokinesin KIF4A as a tumor suppressor by inhibiting cell invasion

Ji Meichao,Jiang Hongyu,Dong Zhixiong,Zhu Changjun
College of Life Sciences,Tianjin Normal University;Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance;Key Laboratory of Molecular and Cellular System Biology,Tianjin Normal University,Tianjin 300387,China

Zhu Changjun,Email:837175800@qq.com

ObjectiveTo explore the role of chromokinesin KIF4A in gastric cancer cell invasion using gastric cancer cells SGC-7901 and chromokinesin KIF4A deficient gastric cancer cells(SGC-shKIF4A).Methods Expression levels of KIF4A in controlling gastric cancer cells(SGC-shNC)and SGC-shKIF4A cells were determined by Western Blot.Invasion of gastric cancer cells were assessed using Transwell invasion assay and the number of cells passing through the matrigel was counted.Changing numbers of cortactin in SGC-7901,SGC-shNC,and SGC-shKIF4A cells were analyzed by immunofluorescence staining.ResultsCompared to the SGC-shNC cells,invasion ability of SGC-shKIF4A cells was increased.Compared to other cells,the numbers of cortactin in SGC-shKIF4A cells was also increased suggesting invadopodia in these cells was increased(P＜0.01).ConclusionsChromokinesin KIF4A acts as a tumor suppressor by inhibiting gastric cancer cells invasion and the results provides strong evidences for KIF4A serving as one of potent targets for gastric cancer prognostics and treatment in clinic.

KIF4A;Cortactin;Cell invasion;Gastric cancer cell

朱長軍，Email：837175800@qq.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．03．003

國家自然科學基金面上項目（31271485）；2011年教育部“新世紀優(yōu)秀人才支持計劃”（NCET-11-1066）；國家自然科學基金青年基金項目（31301138）；天津市科技型中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新資金資助項目（14ZXCXSY00121）

2016-02-15）