陳卓 王海 肖寶 胡春艷 務(wù)圣潔 樊帆 秦玉 朱敦皖 張琳華

300192天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津市生物醫(yī)學(xué)材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

·論著·

葉酸靶向載紫杉醇磷脂-聚合物雜化納米粒的制備及其體外細(xì)胞評(píng)價(jià)

陳卓 王海 肖寶 胡春艷 務(wù)圣潔 樊帆 秦玉 朱敦皖 張琳華

300192天津，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津市生物醫(yī)學(xué)材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

目的制備具有葉酸靶向性的載紫杉醇磷脂-聚合物雜化納米粒（PTX-FLPNPs），并研究其對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT-6的細(xì)胞毒性及體外細(xì)胞吞噬。方法以聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯（PCL-PEG-PCL）、二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇（DSPE-mPEG2000）和葉酸偶聯(lián)的磷脂（Folate-PEG（2000）-DSPE）為藥物載體，通過薄膜水化法自組裝制備PTX-FLPNPs，并對(duì)其進(jìn)行表征；使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察比較葉酸受體高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞EMT-6對(duì)葉酸靶向及無靶向雜化納米粒的吞噬作用；采用MTS法研究PTX-FLPNPs對(duì)EMT-6細(xì)胞的細(xì)胞毒性。結(jié)果成功制備了PTX-FLPNPs，其呈球形，粒徑均勻，具有明顯的“核-殼”結(jié)構(gòu)。投藥量為30%的PTX-FLPNPs的平均粒徑為（279.9±8.7）nm，多分散系數(shù)為0.173±0.021，Zeta電位為（-17.5±1.1）mV，載藥量為（27.36±0.91）%，包封率為（91.16±1.12）%。細(xì)胞吞噬實(shí)驗(yàn)表明，葉酸受體高表達(dá)的EMT-6細(xì)胞對(duì)葉酸靶向的雜化納米粒的吞噬作用明顯強(qiáng)于無靶向的雜化納米粒（P＜0.05）。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PTX-FLPNPs的細(xì)胞毒性低于紫杉醇注射劑，且對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果優(yōu)于無靶向的雜化納米粒。結(jié)論P(yáng)TX-FLPNPs具有較高載藥量及包封率，粒徑均勻，可通過主動(dòng)靶向作用介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞，并增加藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度，是一種能有效抑制腫瘤的靶向載藥納米制劑。

紫杉醇；磷脂-聚合物雜化納米粒；葉酸靶向；細(xì)胞吞噬；細(xì)胞毒性

Fund program:General Program of National Natural Science Foundation of China(81571793,51373199); Natural Science Foundation of Tianjin(15JCZDJC38300)

0 引言

紫杉醇（paclitaxel，PTX）是從紅豆杉科紅豆杉屬植物紫杉的樹皮中分離得到的天然二萜類抗癌藥，主要用于卵巢癌、乳腺癌及非小細(xì)胞肺癌的臨床治療[1]。由于PTX在水中溶解度極低，臨床用聚氧乙烯蓖麻油和乙醇等比例混合的溶劑溶解后給藥，但該助溶劑會(huì)引發(fā)嚴(yán)重過敏反應(yīng)以及神經(jīng)毒性和腎毒性等不良反應(yīng)[2]。因此，設(shè)計(jì)更易被患者接受的PTX新型制劑以減少傳統(tǒng)助溶劑引發(fā)的毒副作用成為一個(gè)重要的研究方向，如脂質(zhì)體、微乳、納米粒及包合物等[3-7]。

磷脂-聚合物雜化納米粒（lipid-polymer hybrid nanoparticles，LPNPs）是一種同時(shí)兼?zhèn)渲|(zhì)體及聚合物膠束優(yōu)點(diǎn)而避免兩者缺點(diǎn)的新型藥物載體[8]。LPNPs具有能增溶疏水性藥物的疏水性聚合物內(nèi)核；外層被磷脂層包裹，使其具有良好的生物相容性、穩(wěn)定性以及體內(nèi)長(zhǎng)循環(huán)特性；表面還可用具有靶向能力的配體修飾獲得主動(dòng)靶向功能[9-10]。

葉酸（folic acid，F(xiàn)A）是細(xì)胞增殖時(shí)參與堿基合成的必需維生素，其受體在多種癌細(xì)胞表面過度表達(dá)[11-12]，而在人體正常組織中的表達(dá)高度保守。葉酸具有無毒、無免疫原性、穩(wěn)定性好、與受體親和力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，且通過葉酸與其受體的特異性結(jié)合，可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞作用攝取藥物[13]。因此，葉酸也成為目前應(yīng)用最多的用于主動(dòng)靶向修飾的配體[14-15]。

本研究采用聚己內(nèi)酯-聚乙二醇-聚己內(nèi)酯（PCL-PEG-PCL）、二硬脂?；字Ｒ掖及?甲氧基聚乙二醇（DSPE-mPEG2000）、偶聯(lián)葉酸的磷脂（Folate-PEG（2000）-DSPE）為藥物載體，通過薄膜水化法使其自組裝以制備具有葉酸靶向性的載紫杉醇磷脂-聚合物雜化納米粒（PTX-FLPNPs），研究腫瘤細(xì)胞對(duì)其的吞噬效果及其對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

PCL-PEG-PCL聚合物（PCL相對(duì)分子質(zhì)量為4 000 u，PEG相對(duì)分子質(zhì)量為8 000 u）（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所基因工程實(shí)驗(yàn)室合成），DSPE-mPEG2000、Folate-PEG（2000）-DSPE（美國(guó)Avanti Polar Lipids公司），PTX注射劑（6 mg/ml）（北京協(xié)和藥廠），PTX原料藥（純度＞99%）（中國(guó)重慶美聯(lián)制藥有限公司）,無葉酸的RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶（美國(guó)Gibco公司），尼羅紅（Nile Red，NR）（美國(guó)Sigma公司），4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）染色液、微絲綠色熒光探針（Actin-Tracker Green）、免疫熒光染色二抗稀釋液、免疫染色固定液、免疫染色洗滌液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），MTS試劑（美國(guó)Promega公司），其他試劑均為市售分析試劑。

Eyela N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本東京理化公司），VCX-130PB超聲波細(xì)胞破碎儀（美國(guó)Sonics& Materials公司），J-25高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司），Nano-ZS粒度分析儀（英國(guó)Malvern公司），Tecnai-F20透射電子顯微鏡（荷蘭FEI公司），高效液相色譜儀（high performance liquid chromatography, HPLC）（美國(guó)Waters公司），LSM710全光譜型激光掃描共聚焦顯微鏡（德國(guó)Carl ZEISS公司），F(xiàn)TS-3L真空冷凍干燥機(jī)（美國(guó)US Filter公司），CO2培養(yǎng)箱（日本SANYO公司）。

1.2 方法

1.2.1 PTX-FLPNPs的制備

采用薄膜水化法進(jìn)行PTX-FLPNPs的制備。具體方法為：將PCL-PEG-PCL、PTX原料藥、DSPE-mPEG2000、Folate-PEG（2000）-DSPE（質(zhì)量比為70∶33∶7∶0.7）加入茄型瓶中，加適量二氯甲烷充分溶解，混合均勻，35℃下使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑制成均勻薄膜，吹氮?dú)? min并抽真空過夜除去殘余有機(jī)溶劑。向茄型瓶中加入65℃去離子水并置于65℃環(huán)境中水化1h，然后冰浴中使用超聲波細(xì)胞破碎儀對(duì)樣品超聲10 min，即得PTX-FLPNPs的分散液。使用高速冷凍離心機(jī)23 000 r/min離心30 min，收集沉淀并用去離子水重懸-離心洗滌3次，除去未包載藥物。冷凍干燥后得PTX-FLPNPs凍干粉。采用以上方法，在載體中不加入Folate-PEG（2000）-DSPE制備無靶向修飾的紫杉醇磷脂-聚合物雜化納米粒（PTX-LPNPs）。

1.2.2 PTX-FLPNPs的表征

（一）平均粒徑及分布、Zeta電位的測(cè)定

室溫下取適量PTX-FLPNPs分散液，加去離子水將聚合物的質(zhì)量濃度稀釋至1 mg/ml，使用粒度分析儀對(duì)樣品平均粒徑及其分布、Zeta電位進(jìn)行測(cè)定，每項(xiàng)測(cè)定3次。

（二）形態(tài)觀察

取少量PTX-FLPNPs分散液滴至鋪有膜的銅網(wǎng)上，自然晾干，使用透射電子顯微鏡觀察其形態(tài)。（三）載藥量和包封率測(cè)定

采用HPLC法測(cè)定PTX-FLPNPs的載藥量和包封率。精密稱取PTX-FLPNPs凍干粉5 mg，使用5 ml

乙腈溶解，并加入去離子水定容至10 ml，混合均勻后經(jīng)0.22 μm濾膜過濾為樣品溶液備用。HPLC實(shí)驗(yàn)條件：反向C18色譜柱（150.0 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈∶水（體積比為50∶50）；流速為1.0ml/min；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm；進(jìn)樣量為20 μl；柱溫為室溫。用HPLC測(cè)定溶液中PTX的峰面積，結(jié)合PTX標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算載藥量與包封率。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

乳腺癌細(xì)胞EMT-6培養(yǎng)于無葉酸的RPMI1640培養(yǎng)基（含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清，質(zhì)量濃度為10 g/L的青霉素，10 g/L鏈霉素）中，在37℃、飽和濕度、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，維持細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，備用。

1.2.4 PTX-FLPNPs的體外細(xì)胞吞噬研究

（一）熒光標(biāo)記的LPNPs的制備

（二）熒光顯微鏡觀察納米粒的攝取

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EMT-6細(xì)胞接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使之貼壁生長(zhǎng)。然后吸棄培養(yǎng)基，分別加入用無血清的無葉酸RPMI1640培養(yǎng)基稀釋的質(zhì)量濃度為0.25 mg/ml的NR-FLPNPs和NR-LPNPs。細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，吸棄納米粒，將細(xì)胞固定，用微絲綠色熒光探針對(duì)細(xì)胞微絲進(jìn)行熒光染色，細(xì)胞核使用DAPI染色。最后，通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞對(duì)NR-FLPNPs和NR-LPNPs的吞噬效果。

（三）細(xì)胞攝取的定量研究

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EMT-6細(xì)胞，以每孔約5000個(gè)細(xì)胞的密度接種于黑色96孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h使其貼壁生長(zhǎng)；然后吸棄培養(yǎng)基，實(shí)驗(yàn)組每孔加入上述0.25 mg/ml的NR-FLPNPs或NR-LPNPs分散液，陰性對(duì)照組則加入相同濃度的LPNPs分散液，陽性對(duì)照組暫時(shí)不加任何納米粒；將96孔板置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別孵育0.5、2、24 h，隨后在陽性對(duì)照組中加入0.25 mg/ml的NR-LPNPs分散液，并使用RIPA裂解液將各組細(xì)胞裂解，用酶標(biāo)儀于激發(fā)波長(zhǎng)552 nm、發(fā)射波長(zhǎng)636 nm下測(cè)定其熒光值。計(jì)算細(xì)胞對(duì)納米粒的吞噬率（%）

1.2.5 PTX-FLPNPs的體外細(xì)胞毒性研究

取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EMT-6細(xì)胞，以每孔約5 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后更換培養(yǎng)液。實(shí)驗(yàn)組為PTX注射劑組（25 μg/ml）、PTX-FLPNPs組（PTX質(zhì)量濃度為25μg/ml）、PTX-LPNPs組（PTX質(zhì)量濃度為25μg/ml）、葉酸靶向的不載藥磷脂-聚合物雜化納米粒（FLPNPs）組；對(duì)照組為陰性對(duì)照組（有細(xì)胞，不加藥）和空白對(duì)照組（無細(xì)胞，不加藥）。將細(xì)胞培養(yǎng)板移入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48、72 h后，小心吸棄孔板內(nèi)的上清液。然后每孔加入100 μl培養(yǎng)基和20 μl MTS試劑，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h后，使用酶標(biāo)儀震蕩10 min，490 nm處測(cè)定吸光度（OD）值。按下式計(jì)算細(xì)胞抑制率（%），并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)抑制曲線。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，樣品間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

試驗(yàn)表明，傳統(tǒng)RBM算法在迭代次數(shù)達(dá)到70～80次時(shí)，RMSE達(dá)到了最低，也就是預(yù)測(cè)誤差率達(dá)到了最小，改進(jìn)的SRBM算法僅僅在迭代次數(shù)達(dá)到20次時(shí)，RMSE就已經(jīng)達(dá)到達(dá)到最低。試驗(yàn)結(jié)果表明改進(jìn)的SRBM算法比傳統(tǒng)的RBM算法評(píng)分預(yù)測(cè)效果更佳，能很好地提高評(píng)分預(yù)測(cè)準(zhǔn)確率，以及大大地降低推薦的工作量，為用戶提供更好的推薦。

2 結(jié)果與討論

2.1 PTX-FLPNPs的制備及表征

以PCL-PEG-PCL、Folate-PEG（2000）-DSPE、DSPE-mPEG2000共混物作為藥物載體材料，通過薄膜水化法自組裝制備了PTX-FLPNPs，并在疏水力作用下使疏水性藥物PTX均勻分散于疏水性PCL鏈段形成的內(nèi)核結(jié)構(gòu)中，從而將PTX載入FLPNPs。

PTX-FLPNPs的透射電鏡圖如圖1A所示，PTXFLPNPs呈球形，顆粒均勻，具有“蘑菇狀”的表面結(jié)構(gòu)。由于疏水性作用力，自組裝過程中PCL-PEG-PCL的PCL鏈段、Folate-PEG（2000）-DSPE和DSPE-mPEG2000的DSPE端以及PTX相互吸附、纏繞、包裹，形成雜化納米粒的內(nèi)核結(jié)構(gòu)，而各材料的PEG鏈段則留在雜化納米粒表面，形成親水性的外殼結(jié)構(gòu)。PTX-FLPNPs的這種“核-殼”結(jié)構(gòu)中，疏水性內(nèi)核起到增溶PTX的作用，親水性的外殼則可提高雜化納米粒的空間穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其在體內(nèi)的循環(huán)時(shí)間且避免被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)（RES）吞噬，載藥納米粒通過增強(qiáng)滲透滯留效應(yīng)（EPR）被動(dòng)靶向到腫瘤部位累積；與此同時(shí)，雜化納米粒表面修飾的葉酸結(jié)構(gòu)可與葉酸受體特異性結(jié)合，將載藥納米粒主動(dòng)靶向富集葉酸受體過度表達(dá)的腫瘤局部，并可介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的內(nèi)吞作用攝取載藥納米粒。

用粒度分析儀對(duì)PTX-FLPNPs的平均粒徑及其分布、Zeta電位進(jìn)行測(cè)定。如圖1B、1C所示，其平均粒徑為（279.9±8.7）nm，多分散系數(shù)為0.173±0.021，Zeta電位為（-17.5±1.1）mV。PTX-FLPNPs具有較小的多分散系數(shù)和較高的Zeta電位，表明采用本研究的制備方法可制備出粒徑較均一的載藥LPNPs，且雜化納米粒由于電荷排斥力不易聚集，可穩(wěn)定地分散于溶液中。

采用HPLC法測(cè)定PTX-FLPNPs的載藥量及包封率，結(jié)果表明，在PTX投藥量為30%時(shí)，PTX-FLPNPs具有較高的載藥量和包封率，其載藥量為（27.36± 0.91）%，包封率為（91.16±1.12）%。由此可見，F(xiàn)LPNPs可有效地增溶PTX。

2.2 PTX-FLPNPs的體外細(xì)胞吞噬研究

以脂溶性紅色染料NR代替PTX制備熒光標(biāo)記的NR-FLPNPs和無靶向性的NR-LPNPs，并使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察并比較葉酸受體高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞EMT-6對(duì)NR-FLPNPs及NRLPNPs的吞噬作用及雜化納米粒在細(xì)胞中的定位。觀察前，對(duì)EMT-6細(xì)胞進(jìn)行固定，使用微絲綠色熒光探針（主要熒光物質(zhì)為異硫氰酸熒光素（FITC））標(biāo)記細(xì)胞微絲，藍(lán)色熒光染料DAPI標(biāo)記細(xì)胞核。

激光掃描共聚焦顯微鏡照片如圖2所示，行1為EMT-6對(duì)NR-FLPNPs的吞噬情況；行2為EMT-6細(xì)胞對(duì)NR-LPNPs的吞噬情況。對(duì)比可見，行1中EMT-6細(xì)胞內(nèi)紅色熒光強(qiáng)度遠(yuǎn)高于行2，即葉酸受體高表達(dá)的EMT-6細(xì)胞對(duì)NR-FLPNPs的吞噬作用明顯強(qiáng)于NR-LPNPs。

進(jìn)一步的細(xì)胞攝取定量研究結(jié)果表明：EMT-6細(xì)胞與雜化納米粒共孵育0.5 h和2 h后，細(xì)胞對(duì)NR-FLPNPs的吞噬率約是對(duì)NR-LPNPs吞噬率的2倍（P＜0.05），說明靶向分子明顯增強(qiáng)了雜化納米粒進(jìn)入靶細(xì)胞的能力；而共孵育24 h后，NR-FLPNPs和NR-LPNPs的細(xì)胞吞噬率相接近（P＞0.05），這可能是由于長(zhǎng)時(shí)間的培養(yǎng)，通過受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞已達(dá)到飽和，NR-FLPNPs與NR-LPNPs主要依靠其他非特異性的方式進(jìn)入細(xì)胞，故EMT-6細(xì)胞對(duì)這兩種納米粒的吞噬間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（表1）

由細(xì)胞吞噬的定性及定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，F(xiàn)LPNPs可通過EMT-6細(xì)胞表面葉酸受體介導(dǎo)而大量被攝取進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)部，具有良好的主動(dòng)靶向性，可增加藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度，提高療效，進(jìn)而降低藥物對(duì)其他組織的毒副作用。

表1 EMT-6細(xì)胞對(duì)兩種雜化納米粒的吞噬率（%）

圖3 紫杉醇質(zhì)量濃度均為25 μg/ml的各組在不同作用時(shí)間對(duì)乳腺癌細(xì)胞EMT-6的生長(zhǎng)抑制曲線

2.3 PTX-FLPNPs的體外細(xì)胞毒性研究

采用MTS法研究PTX-FLPNPs、PTX-LPNPs和FLPNPs對(duì)EMT-6細(xì)胞的毒性，并與臨床使用的PTX注射劑進(jìn)行比較。MTS試劑是一種用比色法來檢測(cè)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)中活細(xì)胞數(shù)量的檢測(cè)試劑，其可被活細(xì)胞生物還原成一種可溶于培養(yǎng)基的有色甲臜產(chǎn)物，且顏色深淺與培養(yǎng)基中的活細(xì)胞數(shù)量成正比，較傳統(tǒng)的噻唑藍(lán)（MTT）法更方便、快捷、靈活、安全。本研究中，各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞培養(yǎng)液（除FLPNPs組）所含PTX的質(zhì)量濃度均選為人體血漿中PTX可存在的最大質(zhì)量濃度[6]——25 μg/ml。各實(shí)驗(yàn)組對(duì)EMT-6細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制曲線如圖3所示。FLPNPs組的細(xì)胞抑制率接近于0，表明磷脂-聚合物雜化納米粒只作為載體，本身對(duì)細(xì)胞并無毒性，載藥后其釋放出來的藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞具有殺傷作用。培養(yǎng)24 h及48 h后，PTX注射劑組細(xì)胞抑制率顯著高于雜化納米粒組（P＜0.05）。培養(yǎng)72 h后，PTX注射劑組、PTX-FLPNPs組和PTX-LPNPs組的細(xì)胞幾乎完全被抑制生長(zhǎng)，3組細(xì)胞抑制率間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。PTX-FLPNPs組及PTX-LPNPs組細(xì)胞抑制率隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，在培養(yǎng)24 h及48 h后，PTX-FLPNPs組的細(xì)胞抑制率高于PTX-LPNPs（P＜0.05）；而在培養(yǎng)72 h后，兩組的細(xì)胞抑制率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。在培養(yǎng)24 h和48 h后，PTX-FLPNPs組及PTX-LPNPs組的細(xì)胞抑制率均低于PTX注射劑組，此現(xiàn)象可能因PTX注射劑直接作用于細(xì)胞，而雜化納米粒中PTX需要從載體中釋放出來，使得在同一作用時(shí)間，培養(yǎng)液中的藥物濃度小于PTX注射劑。

3 結(jié)論

本研究成功地以PCL-PEG-PCL、DSPE-mPEG2000、Folate-PEG（2000）-DSPE為藥物載體，通過薄膜水化法自組裝制備了PTX-FLPNPs。研究結(jié)果表明，葉酸受體高表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞EMT-6對(duì)FLPNPs的吞噬作用明顯強(qiáng)于LPNPs；且PTX-FLPNPs對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯的抑制效果，細(xì)胞毒性低于相同質(zhì)量濃度的PTX注射劑。因此，PTX-FLPNPs是一種可通過主動(dòng)靶向介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞作用而對(duì)其大量攝取，以增加藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的濃度，從而有效抑制腫瘤生長(zhǎng)，并降低藥物對(duì)其他組織毒副作用的載藥納米制劑。

利益沖突無

（圖1、2見插頁3-4）

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Preparation and in vitro evaluation of folate-targeted lipid-polymer hybrid nanoparticles loaded with paclitaxel

Chen Zhuo,Wang Hai,Xiao Bao,Hu Chunyan,Wu Shengjie,Fan Fan,Qin Yu,Zhu Dunwan,Zhang Linhua
Institute of Biomedical Engineering,Chinese Academy of Medical Sciences&Peking Union Medical College,Tianjin Key Laboratory of Biomedical Material,Tianjin 300192,China

Zhang Linhua,Email:elley2001@sina.com

ObjectiveTo prepare folate-targeted lipid-polymer hybrid nanoparticles loaded with paclitaxel (PTX-FLPNPs),evaluate its in vitro cellular uptake and cytotoxicity.MethodsPTX-FLPNPs composed of PCLPEG-PCL,DSPE-mPEG2000 and Folate-PEG(2000)-DSPE were prepared by thin-film hydration method,and characterized in terms of morphology,particle size and size distribution,drug loading and encapsulation efficiency. The uptake efficiency of FLPNPs in breast carcinoma cells EMT-6 was evaluated by confocal laser scanning microscopy.The cytotoxicity of PTX-FLPNPs against EMT-6 cells was determined by MTS assay.ResultsPTXFLPNPs showed spherical core-shell morphology with narrow size distribution.The PTX-FLPNPs with 30%drugloading content were found as spherical shape with average particle diameter of(279.9±8.7)nm,polydispersity index of(0.173±0.021),Zeta potential of(-17.5±1.1)mV,drug loading of(27.36±0.91)%and encapsulation efficiency of (91.16±1.12)%.The internalization efficiency of FLPNPs was obviously higher that of LPNPs in EMT-6 cells which overexpress folate receptor(P＜0.05).The cytotoxic effect of PTX-loaded FLPNPs was lower than that of PTX injection,but higher than that of PTX-loaded LPNPs(without folate conjugation).ConclusionsThe PTX-FLPNPs exhibits high drug-loading content and drug encapsulating efficiency,uniform size with narrow size distribution,high internalization efficiency in EMT6 cells by active targeting-mediated endocytosis.The PTX-FLPNPs would be a promising nanosized drug formulation for tumor-targeted therapy.

Paclitaxel;Lipid-polymerhybridnanoparticles;Folatetargeted;Cellularuptake;Cytotoxicity

張琳華，Email：elley2001@sina.com

10．3760/cma．j．issn．1673-4181．2016．03．001

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81571793，51373199）；天津市自然科學(xué)基金（15JCZDJC38300）

2016-03-20）