蔡玲玲　張豐川　 李元文　張小靜　 孫毅坤　李海聰

100078　北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院皮膚科(蔡玲玲、張豐川、李元文)；北京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院[孫毅坤、李海聰(碩士研究生)]；寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中醫(yī)科(張小靜)

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·論著·

苦參堿對(duì)合軸馬拉色菌麥角固醇生物合成的抑制作用

蔡玲玲張豐川 李元文張小靜 孫毅坤李海聰

100078北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院皮膚科(蔡玲玲、張豐川、李元文)；北京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院[孫毅坤、李海聰(碩士研究生)]；寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院中醫(yī)科(張小靜)

【摘要】目的觀察苦參堿對(duì)合軸馬拉色菌麥角固醇生物合成的影響，探討苦參堿抑菌機(jī)理。方法本研究分為苦參堿組、酮康唑組及空白組，分別通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)8天后三組培養(yǎng)基中合軸馬拉色菌的麥角固醇含量，最后采用SPSS 17.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。 結(jié)果苦參堿組、酮康唑組與空白組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明兩組均有抑制麥角固醇合成的作用，苦參堿組與酮康唑組兩者之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.65>0.05)，說(shuō)明兩組抑制麥角固醇合成的作用相當(dāng)。體外抑菌試驗(yàn)中兩組藥物對(duì)于合軸馬拉色菌臨床株和標(biāo)準(zhǔn)株的抑制強(qiáng)弱有明顯差異(P<0.05)，兩組藥物對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)菌株的抑菌效果均明顯強(qiáng)于臨床菌株。結(jié)論苦參堿可以抑制合軸馬拉色菌麥角固醇合成，作用與酮康唑相當(dāng)，考慮其抑菌機(jī)制可能與破壞麥角固醇合成有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】苦參堿；合軸馬拉色菌；麥角固醇；酮康唑；高效液相色譜法

苦參堿是由中草藥植物苦參SophoraflavescensAit的根、植株、果實(shí)或苦豆子SophoraalopecuroidesL.、廣豆根SophorasubprostrataChun et T．Chen提取制成的,是中藥苦參、山豆根的主要活性成分。近幾年，很多學(xué)者都把對(duì)苦參堿的相關(guān)研究作為自己的研究方向，發(fā)現(xiàn)苦參堿具有多種藥理作用，如抗腫瘤、抗病原微生物[1]、抗心律失常、抗炎作用及調(diào)節(jié)免疫[2]、抑制增殖、抗過(guò)敏、抑制肝纖維化和抑制病毒復(fù)制等作用，因此苦參堿的研究受到各方面極大的關(guān)注。本文主要研究苦參堿對(duì)于合軸馬拉色菌麥角固醇合成的影響及探討苦參堿抑制馬拉色真菌的作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

苦參堿粉由湖北午時(shí)藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)(國(guó)藥準(zhǔn)字:H20059335)。酮康唑粉由西安楊森制藥有限公司生產(chǎn)，含量99.9%，溶于2.5%二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶液，控制DMSO終濃度低于1%。橄欖油固體培養(yǎng)基(成分為：橄欖油、土豆、葡萄糖、瓊脂、蛋白胨、氯霉素、蒸餾水)、酵母膏胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose，YEPD)(成分為：酵母浸膏、蛋白胨、葡萄糖、氯霉素、蒸餾水)、磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、氫氧化鉀溶液、Fisher甲醇溶液、石油醚(沸程30～60℃)、無(wú)水Na2SO4。

1.2菌種來(lái)源

實(shí)驗(yàn)菌種:實(shí)驗(yàn)用合軸馬拉色菌菌株(臨床菌株:01780 CBS7222; 標(biāo)準(zhǔn)菌株:01899 Malassezia sympodida-lis)，來(lái)自北大醫(yī)院微生物室真菌實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)與鑒定。

1.3設(shè)備

FM生化培養(yǎng)箱、高壓滅菌鍋、超凈臺(tái)、超聲波細(xì)胞粉碎儀(JYD-150，上海芝信)；顯微鏡(OLYMPUS-BX60F5)；冷凍離心機(jī)(珠海黑馬)；恒溫振蕩儀、恒溫水浴箱(HH-W420，金壇)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮)；電子天平、培養(yǎng)平皿、移液器(Eppendorf)；移液器槍頭(Axygen)；燒杯、燒瓶、量筒、藍(lán)蓋試劑瓶(Schott)；玻璃棒、藥匙、試管、離心管、錐形燒瓶、梨形漏斗、容量瓶、45 mm濾膜。

1.4色譜條件

色譜柱： Waters symmetry shield TMRP C18， 4.6 mm×250 mm,5 μm；流動(dòng)相：100%甲醇(Fisher公司)；體積流量：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：283 nm；進(jìn)樣量20 μL。Waters 2487雙波長(zhǎng)UV檢測(cè)器；Waters 1525泵；Waters 1500系列柱溫箱；Breeze色譜數(shù)據(jù)處理工作站；CINTRA型紫外分光光度計(jì)。

1.5體外抑菌實(shí)驗(yàn)

通過(guò)美國(guó)國(guó)家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)制訂的M27-A方案中酵母菌微量稀釋法，對(duì)合軸馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)株和臨床株進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，在同一條件下找到苦參堿、酮康唑2組藥物的最佳抑菌濃度(minimum bactericidal concentration，MBC)和最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)?；静襟E：(1)制備菌懸液：將合軸馬拉色菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床株各1株，接種于橄欖油固體培養(yǎng)基上，35℃恒溫溫箱培養(yǎng)2天；連續(xù)傳代培養(yǎng)2次；用無(wú)菌生理鹽水洗脫純化的菌落，制成菌懸液，做好標(biāo)記。用麥?zhǔn)瞎芎图?xì)胞計(jì)數(shù)板調(diào)整濃度為1.0×107CFU/mL。(2)藥液加樣：按照每孔分別含藥液100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%的比例，將苦參堿、酮康唑貯備液直接用馬拉色菌液體培養(yǎng)基各配置10個(gè)濃度。同時(shí)設(shè)一組陰性對(duì)照：每孔加入馬拉色菌液體培養(yǎng)基200 μL；一組陽(yáng)性對(duì)照：每孔加入制備好的菌液100 μL及合軸馬拉色菌液體培養(yǎng)基100 μL。在搖床上將菌液及藥液混勻5分鐘,放入35℃恒溫箱孵育。(3)結(jié)果判讀：48小時(shí)后觀察結(jié)果，由于馬拉色菌為嗜脂性的，菌落浮在液體表面，微黃色，薄薄一層漂浮在透明的液基表面，肉眼觀察非常清晰，采用直接法讀取數(shù)據(jù)。結(jié)果判斷的前提是陽(yáng)性對(duì)照生長(zhǎng)良好，陰性對(duì)照無(wú)菌生長(zhǎng)清晰，其他孔隨藥物濃度梯度升高而菌的生長(zhǎng)受到抑制。若存在拖尾現(xiàn)象，則將每孔內(nèi)生長(zhǎng)情況與陽(yáng)性對(duì)照做比較，以生長(zhǎng)被抑制80%判定為MIC值，用麥?zhǔn)瞎茏鰠⒄眨鶕?jù)菌液的清濁程度尋找MBC。最佳抑菌濃度判定標(biāo)準(zhǔn)：達(dá)到一定濃度后，即使再增加藥物濃度，細(xì)菌抑制程度也不會(huì)變化，觀察麥?zhǔn)媳葷峁軐?duì)比所得的濁度保持一致。

1.6檢測(cè)麥角固醇的高效液相色譜實(shí)驗(yàn)

1.6.1配置含藥培養(yǎng)基根據(jù)體外藥敏結(jié)果選取苦參堿、酮康唑?qū)?組馬拉色菌的最佳抑菌濃度，于無(wú)菌、直徑為60 mm的平皿內(nèi)分別加入的苦參堿粉、酮康唑粉，將40℃左右尚未凝固的橄欖油固體培養(yǎng)基10 mL迅速倒入上述平皿內(nèi)，混勻，待其凝固。加入藥物的質(zhì)量=最佳抑菌濃度×10 mL。

1.6.2制備供試品將新制備的菌液分別接種在含藥和不含藥的橄欖油固體培養(yǎng)基上，設(shè)不含藥的為空白對(duì)照組，共10個(gè)空白組+10個(gè)苦參堿組+10個(gè)酮康唑組，最后將30組均置于35℃恒溫培養(yǎng)5天，刮取平皿上的菌苔，分別接種于YEPD液中，用恒溫振蕩儀在35℃下，振蕩培養(yǎng)3天，使真菌處于活化狀態(tài)。然后對(duì)于含馬拉色菌的培養(yǎng)液抽濾、用蒸餾水洗滌3次，將濾下的真菌濕菌的試管中再加入PBS液(PH 7.4的磷酸鹽緩沖液)10 mL混懸。將試管放置在盛有冰鹽的燒杯里，放入超聲波細(xì)胞粉碎儀臺(tái)上，用超聲波細(xì)胞粉碎儀內(nèi)的手型夾固定試管，聲波探頭放入試管液面下2 cm和溫度計(jì)探頭放入冰塊中。設(shè)置粉碎儀數(shù)據(jù)如下：70 W功率，破碎5秒，間隔3秒，反復(fù)90次。破碎后的菌液裝入離心管內(nèi)，放入冷凍離心機(jī)10000 rmp，-4℃，離心10分鐘，取上清液作為酶液。酶液中加入新配置的皂化劑(10%KOH+甲醇溶液)20 mL混勻，倒入50 mL錐形燒瓶中，放置在恒溫水浴箱中80℃水浴皂化2小時(shí)。得到的皂化物，加石油醚(沸程30～60℃)30 mL，用梨形漏斗萃取3次，加飽和的NaCl溶液20 mL洗滌2次。萃取液合并提取液用無(wú)水Na2SO4干燥脫水，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在70℃減壓濃縮至干，得到非皂化物(non-saponifiable lipids，NSLs)，加甲醇溶解定容10 mL裝入100 mL容量瓶中，-20℃保存。

1.6.3樣品測(cè)定Sigma公司的麥角固醇標(biāo)準(zhǔn)品母液(CAS號(hào): 57-87-4)濃度為10 mg/mL溶于氯仿，也同樣用甲醇溶解稀釋100倍，定容后放置100 mL容量瓶中，濃度為100 ug/mL，-20℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品和樣品分別進(jìn)樣20 μL，每個(gè)樣品進(jìn)樣2次。麥角固醇含量是通過(guò)面積歸一法計(jì)算，公式：測(cè)得樣品的峰面積/標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積=樣品濃度/標(biāo)準(zhǔn)品濃度。因此可以測(cè)定樣品中的麥角固醇的含量。本實(shí)驗(yàn)反復(fù)操作10次，8天為一個(gè)實(shí)驗(yàn)周期，本實(shí)驗(yàn)時(shí)間為2個(gè)月。每個(gè)樣品進(jìn)樣2次×實(shí)驗(yàn)10次，每組樣品分別測(cè)200個(gè)數(shù)據(jù)，最終麥角固醇含量取均值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

檢測(cè)麥角固醇的高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)實(shí)驗(yàn)由統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0 計(jì)算出。藥物作用后的三組數(shù)據(jù)分別經(jīng)過(guò)正態(tài)檢驗(yàn)，結(jié)果：P<0.05，不符合正態(tài)，因此采用非參檢驗(yàn)中K個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2結(jié)果

2.1體外抑菌實(shí)驗(yàn)

臨床菌株在MIC、MBC值上，無(wú)論是苦參堿組還是酮康唑均大于標(biāo)準(zhǔn)菌株，P=0.03<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。臨床菌株之間兩組藥物MIC和MBC差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.47>0.05。標(biāo)準(zhǔn)菌株之間兩組藥物MIC和MBC差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P=0.68>0.05。

2.2檢測(cè)麥角固醇的HPLC實(shí)驗(yàn)

三組數(shù)據(jù)比較P=0.00<0.01差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，苦參堿組與酮康唑比較P=0.54>0.05兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，苦參堿組與酮康唑分別與空白組比較，P<0.01，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表1　藥物作用后合軸馬拉色菌臨床菌株和

表2　HPLC測(cè)得8天后三組培養(yǎng)基中合軸馬拉色菌

3討論與展望

中藥單體成分簡(jiǎn)單、容易配制不同劑型、簡(jiǎn)便易推廣，隨著抗菌藥耐藥、不良反應(yīng)多等問(wèn)題的出現(xiàn)，中藥單體抗真菌的研究越來(lái)越多。其中苦參堿抑菌研究較多，朱敏等[1]采用連續(xù)7天涂菌法誘導(dǎo)豚鼠皮膚感染馬拉色菌，篩選出有效的抗馬拉色菌的中草藥單體苦參堿、檸檬醛、丁香酚等3種。楊雪云等[3]研究發(fā)現(xiàn)苦參堿和氧化苦參堿對(duì)供試林木病原真菌孢子萌發(fā)均有抑制作用，其中苦參堿對(duì)楊褐斑病菌和龍竹材霉變菌抑制作用較強(qiáng)。桂蜀華等[4]采用培養(yǎng)基藥物濃度稀釋法測(cè)定苦參堿對(duì)13株皮膚癬菌的最小抑菌濃度(MIC)及最小殺菌濃度(MBC)，發(fā)現(xiàn)苦參堿有較強(qiáng)的抗真菌活性，能抑制和殺滅羊毛狀小孢子菌、白色念珠菌等多種真菌，其中對(duì)武漢羊毛狀小孢子菌、武漢白色念珠菌38253的抑制能力最好。

筆者及科研團(tuán)隊(duì)近年一直在研究中藥苦參及單體苦參堿對(duì)馬拉色菌及其感染所致的皮膚病的療效和機(jī)制[5-8]。本次研究通過(guò)麥角固醇測(cè)定，說(shuō)明苦參堿具有較好的抑制合軸馬拉色菌麥角固醇合成的作用，抑制強(qiáng)度與酮康唑相當(dāng)。以酮康唑?yàn)榇砜拐婢幍囊志鷻C(jī)理是通過(guò)抑制麥角固醇合成達(dá)到破壞真菌細(xì)胞膜來(lái)抑制真菌繁殖。 該實(shí)驗(yàn)一定程度上說(shuō)明苦參堿抑制馬拉色菌繁殖的機(jī)理可能與影響麥角固醇合成有關(guān)。

此外，通過(guò)觀察合軸馬拉色菌臨床菌株和標(biāo)準(zhǔn)菌株的MIC值、MBC值、麥角固醇含量，發(fā)現(xiàn)苦參堿對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)菌株抑菌效果均強(qiáng)于臨床菌株，說(shuō)明苦參堿抑菌作用強(qiáng)弱和菌種有關(guān)。SD臨床上容易反復(fù)、難以徹底治愈與臨床菌株抑制作用相對(duì)欠佳有一定關(guān)系。雖然SD的發(fā)病是多種因素綜合作用的結(jié)果，目前研究發(fā)現(xiàn)SD和皮脂分泌、遺傳因素、神經(jīng)因素、激素水平、馬拉色真菌感染、免疫缺陷以及HIV感染等有相關(guān)性。然而馬拉色菌局部大量繁殖一定會(huì)加重局部皮損的炎癥、甚至破壞毛囊，因此將馬拉色菌抑制在一定的程度內(nèi)是治療必要的手段。苦參堿在體外實(shí)驗(yàn)中證明了它對(duì)馬拉色菌較好的抑菌作用，然而臨床使用和推廣必須要確保藥物使用的安全性，因此今后可以開(kāi)展相關(guān)的研究，如MIC值到MBC值范圍內(nèi)的小劑量外用研究等。

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(本文編輯： 禹佳)

(上接本期第286頁(yè))

化氫，降低脂質(zhì)過(guò)氧化物[9]。GSH以多種形式存在于機(jī)體內(nèi)，其中GST pi形式在膠質(zhì)細(xì)胞與黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元中高度表達(dá)[10-11]。研究表明，GST pi敲除小鼠對(duì)四氧嘧啶的神經(jīng)毒性更易感，而GST pi的過(guò)表達(dá)可降低魚(yú)藤酮誘導(dǎo)的皮層神經(jīng)元的神經(jīng)毒性，從而減少氧化應(yīng)激[12]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)糖痹康可顯著上調(diào)GCLc和GST pi的蛋白和基因表達(dá)，說(shuō)明糖痹康通過(guò)調(diào)節(jié)II相代謝酶保護(hù)和修復(fù)DPN坐骨神經(jīng)損傷。

Nrf2-Keap1-ARE信號(hào)通路是體內(nèi)重要的抗氧化信號(hào)通路，在II相酶的表達(dá)中起著關(guān)鍵作用[14]。生理狀況下，Nrf2存在于胞漿中并被Keap1抑制，當(dāng)受到外來(lái)物質(zhì)的刺激后，Nrf2與Keap1迅速解離進(jìn)入核內(nèi)，并與抗氧化反應(yīng)元件相互作用，促進(jìn)II相酶基因轉(zhuǎn)錄[15]。本研究團(tuán)隊(duì)將進(jìn)一步研究糖痹康對(duì)Nrf2-Keap1-ARE 信號(hào)通路的影響，以進(jìn)一步解釋糖痹康對(duì)DPN坐骨神經(jīng)的保護(hù)機(jī)制。

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(本文編輯： 蒲曉田)

Inhibition of matrine on ergosterol biosynthesis of Malassezia sympodialis

CAILing-ling，ZHANGFeng-chuan，LIYuan-wen，etal.DermatologicalDepartment，DongfangHospitalofBeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100078，China.

【Abstract】ObjectiveTo test the Malassezia sympodialis ergosterol concentrations by HPLC to discuss mechanism on matrine inhibition of malassezia.MethodsThe ergosterol concentrations of Malassezia sympodialis was checked after matrine or ketoconazole affected by High Performance Liquid Chromatography (HPLC). ResultsTwo groups can both inhibite ergosterol(P=0.65>0.05),and have no significance. Two groups had abvious differences of malassezia inhibitions on clinical strains when compared with standard strains, two treatment groups both had stronger inhibition in standard groups than clinical groups(P=0.02<0.05). ConclusionMatrine has inhibitions of ergosterol of Malassezia sympodialis as well as ketoconazole. Its inhibition mechanism of Malassezia sympodialis might have relationship of inhibition of ergosterol biosynthesis.

【Key words】Matrine;Malassezia sympodialis;Ergosterol;Ketoconazole;High performance liquid chromatography(HPLC)

(收稿日期：2013-02-15) 2015-12-28)

Corresponding author：ZHANG Feng-chuan， E-mail: bjzfc@sina.com

【中圖分類(lèi)號(hào)】R285

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.03.011

作者簡(jiǎn)介：蔡玲玲(1982- )，女，博士，主治醫(yī)師。研究方向：皮膚性病學(xué)。 E-mail: lingling89159166@126.com通訊作者： 張豐川(1968- )，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，中國(guó)性學(xué)會(huì)中醫(yī)性學(xué)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)秘書(shū)長(zhǎng)。研究方向：真菌感染性皮膚病學(xué)。E-mail: bjzfc@sina.com

基金項(xiàng)目：北京市教委科研共建項(xiàng)目