馮子懿

（鄭州市第一中學(xué) 河南鄭州 45000）

TNF-α誘導(dǎo)人類成纖維細(xì)胞DNA損傷及衰老的機(jī)制研究

馮子懿

（鄭州市第一中學(xué) 河南鄭州 45000）

目的：本文主要通過(guò)實(shí)驗(yàn)探討TNF-α誘導(dǎo)人類成纖維細(xì)胞DNA損傷及衰老的相關(guān)機(jī)制。方法：本次研究在某院小兒外科手術(shù)過(guò)程中選取部分正常皮膚組織，處理之后，對(duì)其成纖維細(xì)胞采取TNF-α進(jìn)行誘導(dǎo)，觀察比較經(jīng)過(guò)TNF-α短時(shí)間和長(zhǎng)時(shí)間處理后，成纖維細(xì)胞的SA-β-gal以及DNA發(fā)生的變化。結(jié)果：經(jīng)過(guò)TNF-α3天內(nèi)的短時(shí)間處理，成纖維細(xì)胞的SA-β-gal以及DNA變化不明顯，處理時(shí)間延長(zhǎng)到6天以后，成纖維細(xì)胞的SA-β-gal以及DNA變化明顯，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論：本次研究結(jié)果表明，成纖維細(xì)胞經(jīng)過(guò)TNF-α6天以上的時(shí)間處理后，SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，γ-H2AX陽(yáng)性細(xì)胞比例數(shù)明顯增多，γ-H2AX蛋白的水平在明顯升高。說(shuō)明TNF-α作為一種特殊的炎癥因子，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖和腫瘤壞死、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等作用。

TNF-α 成纖維細(xì)胞 DNA損傷 衰老

引起細(xì)胞衰老有很多因素，如：癌基因誘導(dǎo)、DNA損傷、端?？s短、炎癥因子等，從客觀方面看，細(xì)胞衰老可以分為早衰和復(fù)制衰老兩種類型，在TNF-α推動(dòng)作用下產(chǎn)生的衰老則屬于早衰類型。本文主要通過(guò)實(shí)驗(yàn)探討TNF-α誘導(dǎo)人類成纖維細(xì)胞DNA損傷及衰老的相關(guān)機(jī)制，結(jié)果比較滿意，現(xiàn)報(bào)告如下。

1.試驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞系

本次研究從醫(yī)院部分患者的正常皮膚組織中選取成纖維細(xì)胞，進(jìn)行原代培養(yǎng)，并從細(xì)胞庫(kù)中獲取正常人的成骨肉瘤細(xì)胞系。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

P3 8促分裂原活化蛋白激酶抑制劑，用二甲基亞砜配制成10mM的濃儲(chǔ)，分裝后，在零下20攝氏度環(huán)境下避光保存；TNF-α，用無(wú)菌生理鹽水配制成0.1毫克的濃儲(chǔ)，分裝后，在零下80攝氏度環(huán)境下保存［1］。

細(xì)胞培養(yǎng)所需試劑：二甲基亞砜、乙二胺四乙酸、胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基等［2］。

Western blotting所需試劑和耗材：Western一抗稀釋液、Western一抗二抗去除液、Western細(xì)胞裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、Western熒光檢測(cè)ECL發(fā)光液、Prestrained protein ladder、蛋白酶抑制劑、Tween-20、醫(yī)用X光膠片、定影液粉末、顯影液、PVDF膜、甘氨酸、Tris、甲醇、SDS、鹽酸胍等［3］。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

選取部分兒科手術(shù)患者，爭(zhēng)取其家屬同意之后，在小兒患者手術(shù)過(guò)程中獲取皮膚組織，使用含有一定劑量青霉素的生理鹽水進(jìn)行5次左右的清洗，只留取有用的真皮層，取出皮膚的表皮組織和皮下的脂肪組織。將真皮層剪碎，加入一定劑量的膠原酶I，將二氧化碳培養(yǎng)箱溫度調(diào)整到37攝氏度，進(jìn)行大約6小時(shí)的消化。然后加入一定劑量的1xDMEM培養(yǎng)基中和，保證培養(yǎng)基均勻之后，進(jìn)行過(guò)濾和離心，排出上清。使用1xDMEM培養(yǎng)基沉淀，并放入培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)，等到細(xì)胞貼壁之后換液，細(xì)胞長(zhǎng)滿之后進(jìn)行傳代。細(xì)胞傳代之后，按序進(jìn)行細(xì)胞凍存、細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞計(jì)數(shù)等，在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行藥物處理［4］。

2.結(jié)果

2.1 成纖維細(xì)胞經(jīng)過(guò)TNF-α長(zhǎng)時(shí)間處理后誘發(fā)其衰老

臨床研究表明，TNF-α?xí)龠M(jìn)內(nèi)皮和上皮細(xì)胞的衰老，但是不確定TNF-α是否會(huì)對(duì)成纖維細(xì)胞的衰老起到促進(jìn)和推動(dòng)作用。本次研究使用10納克的TNF-α對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行處理，檢測(cè)SA-βgal染色并計(jì)數(shù)。臨床檢測(cè)SA-β-gal的操作比較容易，并且檢測(cè)結(jié)果的可信度較高，所以是目前我國(guó)檢測(cè)衰老和老化細(xì)胞最常用的生物學(xué)指標(biāo)之一。本次研究結(jié)果表明，成纖維細(xì)胞經(jīng)過(guò)TNF-α24小時(shí)、3天短時(shí)間的處理之后，SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目沒(méi)有明顯增多的跡象，但是當(dāng)處理時(shí)間延長(zhǎng)到6天以后，SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增多，升高到5.98%±0.69%，處理9天之后，SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增加到14.93%±2.64%，所以SA-β-gal處理3天以內(nèi)、6天、9天的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目增加情況具有明顯的差異，P＜0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，TNF-α要想引起成纖維細(xì)胞發(fā)生衰老，必須要經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的處理。

2.2 成纖維細(xì)胞經(jīng)過(guò)TNF-α長(zhǎng)時(shí)間的處理會(huì)導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的DNA損傷

目前，已經(jīng)確定DNA損傷也會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞衰老，原因是DNA損傷之后，會(huì)激活p16INK4a/pRb通路和p53/p21Cipl通路。本次研究為了證明TNF-α不僅會(huì)促進(jìn)成纖維細(xì)胞的衰老，還會(huì)導(dǎo)致其DNA造成損傷。成纖維細(xì)胞經(jīng)過(guò)TNF-α處理之后，其γ-H2AX的具體表達(dá)情況就可以證明該成纖維細(xì)胞的DNA是否發(fā)生損傷。成纖維細(xì)胞DNA一旦發(fā)生雙鏈斷裂，其H2AX第139位絲氨酸就會(huì)發(fā)生磷酸化反應(yīng)，從而形成一種γ-H2AX物質(zhì)。這種物質(zhì)會(huì)迅速傳導(dǎo)出DNA被損傷的信號(hào)，從而使下游信號(hào)通路被激活，引發(fā)生物級(jí)聯(lián)發(fā)硬。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用10納克的TNF-α處理成纖維細(xì)胞24小時(shí)之后，幾乎檢測(cè)不到γ-H2AX的表達(dá)，說(shuō)明經(jīng)過(guò)10納克TNF-α短時(shí)間的處理，并不會(huì)對(duì)成纖維細(xì)胞的DNA造成明顯的損傷。當(dāng)TNF-α處理時(shí)間延長(zhǎng)到6小時(shí)以后，就可以很明顯的找到γ-H2AX陽(yáng)性信號(hào)，并且計(jì)數(shù)結(jié)果表明γ-H2AX陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量越來(lái)越多，已經(jīng)增加到9.78%±1.17%。使用Western blotting檢測(cè)γ-H2AX蛋白水平的表達(dá)時(shí)，可以清楚的發(fā)現(xiàn)，使用TNF-α短時(shí)間的處理成纖維細(xì)胞，其γ-H2AX水平?jīng)]有明顯的變化，但是延長(zhǎng)處理時(shí)間之后，就可以發(fā)現(xiàn)γ-H2AX蛋白水平在持續(xù)升高，與此同時(shí)，還可以發(fā)現(xiàn)這種γ-H2AX蛋白水平的升高具有一定的依賴性。這個(gè)發(fā)現(xiàn)表面，TNF-α長(zhǎng)時(shí)間的處理成纖維細(xì)胞之后，成纖維細(xì)胞的DNA也會(huì)發(fā)生損傷，成纖維細(xì)胞的DNA損傷時(shí)間和SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯增加時(shí)間基本相同，所以也可以認(rèn)為成纖維細(xì)胞在TNF-α作用下發(fā)生的衰老也與其DNA損傷有一定的關(guān)系。

2.3 p38/MAPK抑制劑有助于延緩TNF-α誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老

成纖維細(xì)胞經(jīng)過(guò)TNF-α處理之后，其p38/MAPK就會(huì)被激活。本次研究使用SB203580對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行處理，證明激活p38/ MAPK也會(huì)對(duì)TNF-α促進(jìn)成纖維細(xì)胞衰老產(chǎn)生一定的作用。p38/ MAPK抑制劑就是SB203580，這種抑制劑不是直接對(duì)p38/MAPK本身的磷酸化反應(yīng)進(jìn)行抑制，而是通過(guò)對(duì)p38/MAPK下游靶蛋白的磷酸化反應(yīng)進(jìn)行選擇性抑制，從而阻斷p38/MAPK通路信號(hào)的傳導(dǎo)。本次研究使用濃度為10uM的SB203580對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行一個(gè)半小時(shí)的預(yù)處理，然后觀察在不同的TNF-α處理時(shí)間，SA-β-gal陽(yáng)性染色的實(shí)際情況。研究結(jié)果表明，成纖維細(xì)胞經(jīng)過(guò)SB203580預(yù)處理之后，相對(duì)而言，TNF-α誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老情況有所減弱，尤其是在處理時(shí)間延長(zhǎng)到6天以后，SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目已經(jīng)降低到1.95%±0.86%，而沒(méi)有SB203580抑制劑作用下，SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目為5.98%±0.60%。將處理時(shí)間延長(zhǎng)到9天以后，SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目已經(jīng)降低到6.89%±1.1%，而沒(méi)有SB203580抑制劑作用下，SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目為13.93%±1.6%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3.討論

細(xì)胞一旦發(fā)生開(kāi)始衰老，就不會(huì)再恢復(fù)到衰老前的狀態(tài)，細(xì)胞衰老之后，隨意代謝功能基本正常，但是隨著衰老時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞的增值能力也會(huì)越來(lái)越弱，最后死亡［5］。引起細(xì)胞衰老有很多因素，如：癌基因誘導(dǎo)、DNA損傷、端?？s短、炎癥因子等，其中，炎癥因子是調(diào)節(jié)細(xì)胞生理活性方面起著非常重要的作用，隨著炎癥微環(huán)境研究范圍的擴(kuò)大，炎癥因子也稱為目前備受關(guān)注的研究熱點(diǎn)，而本次研究的TNF-α就是一種重要的炎癥細(xì)胞因子。本次研究結(jié)果表明，TNF-α誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老的同時(shí)，也會(huì)誘導(dǎo)其DNA損傷，但是需要較長(zhǎng)的時(shí)間，并且兩者在時(shí)間上基本吻合，說(shuō)明TNF-α誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞衰老可能和成纖維細(xì)胞的DNA損傷有一定的關(guān)系［6］。由于本次研究時(shí)間較短，所以沒(méi)有對(duì)成纖維細(xì)胞中ROS水平的變化進(jìn)行細(xì)致的研究，所以不清楚TNF-α導(dǎo)致成纖維細(xì)胞DNA損傷的原因是否是由ROS所引起，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

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Q255

A

1674-2060（2016）01-0011-02