姚鵬程

(華東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 上海 200241) 安 梅 (上海市南洋模范中學(xué) 200032)

隨著人類對于生物多樣性認(rèn)識(shí)的不斷加深，生物多樣性的保護(hù)和持續(xù)利用成為世界性的重大需求，快速的物種鑒定也就越來越成為迫切的現(xiàn)實(shí)需要。但是，由于傳統(tǒng)分類學(xué)本身存在的固有局限以及傳統(tǒng)分類學(xué)工作者人數(shù)的不足，經(jīng)典的物種鑒定渠道嚴(yán)重制約著生物多樣性的有效保護(hù)和合理利用，DNA條形碼技術(shù)隨即應(yīng)運(yùn)而生[1]。該技術(shù)是利用標(biāo)準(zhǔn)的、具有足夠變異的、易擴(kuò)增且相對較短的DNA片段在物種內(nèi)的特異性和種間的多樣性而創(chuàng)建的一種新的生物身份的識(shí)別系統(tǒng)，用以實(shí)現(xiàn)對物種的快速自動(dòng)鑒定[1]。簡單地說，DNA條形碼技術(shù)的關(guān)鍵就是對一個(gè)或一些相關(guān)基因進(jìn)行大范圍的掃描，進(jìn)而鑒定某個(gè)未知的物種或者發(fā)現(xiàn)新種[2]。該技術(shù)一經(jīng)提出就受到各國分類學(xué)家重視，迄今經(jīng)過13年的研究，DNA條形碼已經(jīng)得到了極大的發(fā)展，即已經(jīng)從最初的篩選片段和獲得片段信息發(fā)展到在多個(gè)學(xué)科領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用。不過，隨著研究的不斷深入，利用現(xiàn)有DNA條形碼進(jìn)行特定物種鑒定的局限性也逐漸顯現(xiàn)。

1 DNA條形碼的研究現(xiàn)狀

1.1 動(dòng)物DNA條形碼的研究現(xiàn)狀 Hebert等[1]選取線粒體細(xì)胞色素C氧化酶亞基I(COI)的一段序列在動(dòng)物界門、目、種等不同分類水平上進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)無論在哪個(gè)分類水平上該基因都具有良好的識(shí)別能力，從而提議其中約650bp長的一段序列作為動(dòng)物的標(biāo)準(zhǔn)DNA條形碼。此提議出來后，便不斷有研究對其適用性進(jìn)行驗(yàn)證。研究表明，所提議的片段可在物種水平上對絕大多數(shù)動(dòng)物類群進(jìn)行鑒定, 還能較準(zhǔn)確地區(qū)分近緣類群。但是，由于動(dòng)物界物種豐富度極高，截止2014年僅已知種類估計(jì)就有200萬種，其中大量物種的DNA條形碼數(shù)據(jù)尚未報(bào)道，目前對于動(dòng)物DNA條形碼的研究依然集中于標(biāo)準(zhǔn)條形碼COI的物種片段數(shù)據(jù)的收集和分析。

1.2 植物DNA條形碼的研究現(xiàn)狀 相較于動(dòng)物，植物線粒體基因組本身的一系列特點(diǎn)，使得以其作為植物的DNA條形碼并不具備明顯的優(yōu)勢。植物線粒體基因組的相關(guān)特點(diǎn)主要包括：①基因組較大；②不同類群間因重復(fù)、插入或缺失現(xiàn)象等造成序列長度變異很大(300～2000kb)；③存在大量短而分散的重復(fù)序列(50～1000bp)；④重復(fù)序列引起的基因重組和基因突變會(huì)產(chǎn)生變異[3]；⑤基因組豐度較低，其提取和純化相對困難等。因此，人們把目光投向具有單親遺傳特性、分子量小且極少發(fā)生重組的葉綠體基因組，使之成為植物DNA條形碼研究的首選。研究者對各種候選片段進(jìn)行了篩選, 涉及的片段主要分布在葉綠體基因的編碼區(qū)(rbcL、matK、trnL、accD、rpoC1、rpoB和ndhJ 等) 和間隔區(qū)(trnH-psbA、trnK-rps16、rpl36-rps8、atpB-rbcL、ycf6-psbM、trnV-atpE、trnC-ycf6、psbM-trnD、trnL-F、psbK-psbI和atpF-atpH等)[4]。至2009年，國際生命條形碼聯(lián)盟植物工作組已確定將rbcL 和matK作為植物的核心條形碼，此后，由于葉綠體基因間隔區(qū)trnH-psbA以及核基因ITS也具有相對較好的物種分辨率，又將這2個(gè)片段作為植物的補(bǔ)充條形碼。但在一些研究中發(fā)現(xiàn)，這四個(gè)條形碼片段仍不能解決物種鑒別問題.例如,楊培等[5]用這4個(gè)候選片段對黃精屬(Polygonatum)藥用植物進(jìn)行DNA條形碼評價(jià)，得出的結(jié)論是4個(gè)推薦的條形碼片段單獨(dú)或者聯(lián)合均不適合黃精屬藥用植物的物種區(qū)分，因而提出重新篩選新片段的建議。國內(nèi)外學(xué)者還將目光投向超級(jí)條形碼(super barcoding，即以葉綠體全基因組作為DNA條形碼)以及微型條形碼(mini barcoding，即比標(biāo)準(zhǔn)條形碼更短的DNA片段用于區(qū)分物種的序列)，以期解決疑難類群的物種區(qū)分問題。

1.3 微生物DNA條形碼的研究現(xiàn)狀 由于微生物形態(tài)結(jié)構(gòu)簡單，形態(tài)特征受外界環(huán)境影響很大，導(dǎo)致微生物的形態(tài)鑒定存在很大的困難。真菌在人們生產(chǎn)生活中應(yīng)用范圍廣，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，因此國內(nèi)外學(xué)者對于微生物的DNA條形碼研究側(cè)重于真菌。目前研究者主要是將真菌的DNA條形碼研究聚焦在線粒體基因COI和核基因ITS上。DNA條形碼技術(shù)應(yīng)用于微生物分類研究，已發(fā)現(xiàn)了大量的隱種甚至隱屬。例如，Seifert等[6]對青霉屬(Penicillium) 的58個(gè)物種的370余份樣本的COI序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)青霉屬可能包含4個(gè)屬；Nguyen等[7]利用COI 序列發(fā)現(xiàn)錘舌菌屬(Leohumicola) 的3個(gè)新種?？茖W(xué)家估計(jì)全球約有150萬種真菌，而目前被發(fā)現(xiàn)命名的還只有大約10萬種，因此今后相當(dāng)長的一段時(shí)間內(nèi)，真菌DNA條形碼的研究將一直致力于新種新屬，甚至更高分類等級(jí)的發(fā)現(xiàn)和記錄。

1.4 DNA條形碼的應(yīng)用現(xiàn)狀 DNA條形碼技術(shù)的主要應(yīng)用目標(biāo)是快速準(zhǔn)確地識(shí)別和鑒定物種，這里不再贅述。除此以外，該技術(shù)在生態(tài)學(xué)、進(jìn)化生物學(xué)、系統(tǒng)發(fā)育學(xué)，區(qū)系學(xué)，生物多樣性保護(hù)等學(xué)科中的應(yīng)用也相當(dāng)廣泛。裴男才[8]探討了DNA條形碼在進(jìn)化生態(tài)學(xué)中的作用，認(rèn)為DNA條形碼可量化動(dòng)物取食特征和種子傳播交互網(wǎng)絡(luò)，用以評估每種食果動(dòng)物對不同小生境中種子雨的貢獻(xiàn)。González-Varo等[9]利用DNA條形碼檢測到不同食果動(dòng)物選擇性地取食不同果實(shí)或種子類型, 從而在植食性特征和種子凋落格局之間探討動(dòng)植物協(xié)同進(jìn)化特征。葛學(xué)軍[10]認(rèn)為通過DNA條形碼的數(shù)據(jù)積累, 能夠構(gòu)建高精度宏系統(tǒng)發(fā)育樹，開展精細(xì)尺度的植物系統(tǒng)發(fā)育區(qū)系學(xué)研究。向小果等[11]提出在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)中可以用被子植物種系發(fā)生學(xué)組Ⅲ(APG III)作為系統(tǒng)發(fā)育骨架, 然后利用DNA條形碼片段進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，從而開展生物地理格局、群落系統(tǒng)多樣性等方面的研究。周世良等[12]認(rèn)為DNA條形碼技術(shù)在保護(hù)生物學(xué)中可用于確定珍稀瀕危物種與其他生物的關(guān)系。另外，利用DNA條形碼技術(shù)可以確定哪些動(dòng)物是花粉和種子的有效散布者[9]。

2 DNA條形碼的局限性

2.1 物種本身遺傳、分化特性造成的局限性 當(dāng)種內(nèi)DNA序列變異速率遠(yuǎn)小于種間變異速率時(shí)，種內(nèi)個(gè)體間遺傳差異與種間遺傳差異就能顯著區(qū)分，從而形成遺傳差異鴻溝(DNA barcoding gap)，這是鑒定兩個(gè)不同物種的理論依據(jù)。如果種內(nèi)個(gè)體間遺傳差異與種間遺傳差異之間不存在這個(gè)鴻溝，表明相關(guān)物種間界限不明顯，通過DNA條形碼進(jìn)行鑒定就無能為力。對于植物而言，由于其多倍化、雜交和輻射進(jìn)化等多種因素的影響, 利用現(xiàn)有的DNA條形碼常常表現(xiàn)為遺傳差異鴻溝不明顯甚至不存在，因而不能對物種進(jìn)行精確的鑒定。動(dòng)物物種界限相對清晰，并具有特有的標(biāo)準(zhǔn)條形碼(COI)，但是不同種系間線粒體基因水平轉(zhuǎn)移以及近緣物種共享線粒體多態(tài)性現(xiàn)象加大了物種的鑒定難度，一定時(shí)期的環(huán)境變化導(dǎo)致DNA 序列突變加快也會(huì)影響鑒定結(jié)果[13]。對于真菌而言，種屬差異很大、總數(shù)龐大、基因序列的變異度大、很多通用的DNA條形碼序列被多個(gè)內(nèi)含子干擾給鑒定工作帶來了更多不確定的因素。此外，條形碼需要首先對憑證標(biāo)本進(jìn)行鑒定，由于真菌形態(tài)上難于鑒定，目前每個(gè)屬種都是用部分具有代表性的菌株進(jìn)行相關(guān)鑒定，致使DNA條形碼在此方面的鑒定中也會(huì)出現(xiàn)無能為力的狀態(tài)。

2.2 形態(tài)學(xué)種與分子鑒定結(jié)果不一致 由于形態(tài)性狀的平行進(jìn)化或者趨同進(jìn)化以及隱種的存在等原因，依據(jù)形態(tài)學(xué)特征確定的物種與依據(jù)DNA條形碼鑒定的結(jié)果之間有時(shí)會(huì)相互矛盾。一部分形態(tài)特征相似的直翅目昆蟲其系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果與形態(tài)學(xué)研究結(jié)果不一致；溫帶卵胎生的海水魚條平鲉(Sebastestrivittatus)的形態(tài)分類與系統(tǒng)發(fā)育位置不一致；形態(tài)學(xué)方法鑒定貝類與利用核基因片段ITS進(jìn)行分類鑒定的結(jié)果也存在差異。植物界這種不一致也不少，例如榕屬(Ficus)[14]、婆婆納屬(Veronica)[15]等。這些現(xiàn)象提示人們，當(dāng)前乃至今后相當(dāng)長時(shí)期內(nèi)，期望DNA條形碼鑒定取代經(jīng)典分類學(xué)工作是不現(xiàn)實(shí)的。

2.3 新一代DNA條形碼有待開發(fā) DNA條形碼經(jīng)過十幾年的發(fā)展已廣泛應(yīng)用于物種鑒定，而在生產(chǎn)實(shí)踐中人們更期望將其用于對品種進(jìn)行鑒定；對于珍稀物種保護(hù)，人們往往需要了解種群甚至某個(gè)個(gè)體的準(zhǔn)確來源。對于這類問題，目前的DNA條形碼基本上無能為力。此外，DNA條形碼在實(shí)際應(yīng)用中還會(huì)碰到“非標(biāo)準(zhǔn)材料”或樣品碎片，如中藥材、木制家具、茶葉、卷煙、動(dòng)物消化殘?jiān)?，腐敗的?dòng)物組織等，這些材料內(nèi)的DNA高度降解，常常并不能夠得到完整條形碼片段序列，因此存在不能利用現(xiàn)有條形碼進(jìn)行鑒定的情況，需要運(yùn)用新的技術(shù)手段加以解決。