肖義軍 俞如旺

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 福州 300117)

動(dòng)物細(xì)胞膜兩側(cè)必須保持一定的Na+/K+離子濃度差才能維持細(xì)胞的正常生理活動(dòng)， Na+/K+濃度差的維持主要依賴于細(xì)胞膜上的Na+/K+泵的工作。Na+/K+泵又名Na+/K+ATPase，是一種P型離子泵，它通過水解ATP釋放出的能量向膜兩側(cè)轉(zhuǎn)運(yùn)Na+、K+離子，每次循環(huán)水解1個(gè)ATP分子，可將2個(gè)K+轉(zhuǎn)入細(xì)胞，同時(shí)將3個(gè)Na+轉(zhuǎn)出細(xì)胞。通常動(dòng)物細(xì)胞要消耗1/3的細(xì)胞總ATP供Na+/K+ATPase工作，以維持細(xì)胞內(nèi)高K+低Na+的離子環(huán)境，神經(jīng)細(xì)胞需要消耗的ATP更是高達(dá)細(xì)胞ATP總量的2/3[1]。強(qiáng)心苷類化合物可以特異性地結(jié)合細(xì)胞膜Na+/K+ATPase，抑制Na+/K+ATPase的離子泵功能。常見的強(qiáng)心苷化合物包括植物來源的哇巴因、地高辛、洋地黃毒苷和動(dòng)物(蟾蜍)來源的布法林、海蟾蜍毒素等。

新的研究表明，Na+/K+ATPase除了作為離子泵維持動(dòng)物細(xì)胞膜兩側(cè)的Na+/K+濃度差外，也是動(dòng)物細(xì)胞膜上的一個(gè)非常重要的信號受體[2]。它通過與強(qiáng)心苷結(jié)合而活化，激活后的Na+/K+ATPase與肉瘤病毒蛋白(Src)激酶結(jié)合引起Src激酶的活化，募集表皮生長因子受體(EGFR)后共同進(jìn)入信號微結(jié)構(gòu)域膜穴中，組裝成不同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)合體，進(jìn)一步向細(xì)胞內(nèi)傳遞信號，引起細(xì)胞反應(yīng)。讓人感興趣的是，不同組織細(xì)胞膜上的Na+/K+ATPase與強(qiáng)心苷結(jié)合后引起的細(xì)胞應(yīng)答不同。例如，作用于心肌細(xì)胞,引起心肌細(xì)胞的收縮;作用于血管平滑肌細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞,則引起細(xì)胞增殖;而作用于腫瘤細(xì)胞,則引起細(xì)胞凋亡。

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)心苷類化合物對人源腫瘤細(xì)胞具有極強(qiáng)的殺傷作用，nmol/L濃度級別下就可以強(qiáng)烈抑制人源腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡。而目前大多數(shù)臨床常用的化療藥物其抑制腫瘤細(xì)胞生長的濃度級別在μmol/L濃度以上。目前的研究表明，強(qiáng)心苷選擇性殺傷人源腫瘤細(xì)胞的原因在于物種之間、正常組織細(xì)胞與腫瘤組織細(xì)胞之間、以及同一個(gè)體的不同組織細(xì)胞膜上的Na+/K+ATPase均可能存在差異。本文對Na+/K+ATPase的結(jié)構(gòu)以及其作為強(qiáng)心苷抗腫瘤靶點(diǎn)研究的進(jìn)展做一綜述。

1 Na+/K+ATPase的組成和結(jié)構(gòu)

Na+/K+ATPase是一種膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，動(dòng)物細(xì)胞膜上的Na+/K+ATPase主要由起催化作用的α亞基和起調(diào)節(jié)作用的β亞基組成，每個(gè)Na+/K+ATPase分子是由2個(gè)α亞基和2個(gè)β亞基組成的四聚體。在腎小管等組織中還存在γ亞基，分子量7～11kD，它的作用可能是調(diào)節(jié)α亞基與Na+、K+及ATP的親和力[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，α亞基有α1、α2、α3、α4四種亞型，依亞型不同分子量介于110～113 kD之間，其中α1亞基的分布最廣，它與β1亞基形成的聚合物見于大多數(shù)組織的細(xì)胞膜上。而α2、α3、α4的分布較有組織特異性，如α2主要分布在心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等的胞膜上，α3在神經(jīng)組織細(xì)胞膜上較豐富，α4目前僅發(fā)現(xiàn)存在于雄性生殖細(xì)胞胞膜上。α亞基有10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(M1～M10)，氨基端和羧基端都位于胞內(nèi)側(cè)，Na+、K+、ATP和強(qiáng)心苷的結(jié)合位點(diǎn)都位于α亞基上。β亞基是一種高度糖基化的蛋白，分子量約60kD，其蛋白部分分子量依亞型不同，介于36～38kD之間。它有3種亞型，以β1最常見，β2主要分布在神經(jīng)組織細(xì)胞，而β3則極少見，僅在蛙類細(xì)胞中有發(fā)現(xiàn)。β亞基僅跨膜1次，其氨基端在胞內(nèi)，其功能主要是參與維持α亞基的正確折疊，將α亞基從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)到質(zhì)膜上，并在質(zhì)膜上穩(wěn)定α亞基的構(gòu)型和調(diào)節(jié)α亞基的活性[4]。

不同物種Na+/K+ATPase的α亞基酸序列有90%以上的相似性，而同一物種不同α亞基之間氨基酸序列的相似性較低，α1、α2與α3之間約有87%的相似性，而α4與其他亞基的相似性僅為76%～78%。亞基的相似性大多來自于跨膜區(qū)域、胞內(nèi)部分和羧基端的氨基酸序列，而差異性多來自于細(xì)胞外強(qiáng)心苷結(jié)合位點(diǎn)部分、亞型特有區(qū)域和氨基端的氨基酸序列。Na+/K+ATPase的β亞基也同樣存在著不同物種之間有不同亞型間的差異[5]。因此，不同物種、不同組織、腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞對強(qiáng)心苷的反應(yīng)不同有其結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。至今研究過的鼠源腫瘤細(xì)胞膜上只有α1表達(dá)，而在人源腫瘤細(xì)胞膜上α1和α3均有表達(dá)[5]。研究顯示，細(xì)胞膜Na+/K+ATPase的亞基構(gòu)成并非固定不變，在正常細(xì)胞向腫瘤細(xì)胞惡變的過程中某些α亞基的表達(dá)會發(fā)生改變。例如，Sakai等[7]發(fā)現(xiàn)人結(jié)腸組織在惡變時(shí)伴隨有α1表達(dá)降低和α3表達(dá)升高；Suol等[8]研究了29例成神經(jīng)管細(xì)胞瘤的α1和α3的表達(dá)狀況，發(fā)現(xiàn)過半病例中有α1或α3的過表達(dá)，1/3病例中兩者均過表達(dá)；Xu等[9]發(fā)現(xiàn)惡變的肝組織和肝癌細(xì)胞株的α1表達(dá)高于正常肝組織。

人們很早就明確強(qiáng)心苷的結(jié)合位點(diǎn)在α亞基上，但長期以來一直未能完全弄清楚強(qiáng)心苷在α亞基上具體結(jié)合位點(diǎn)。最近隨著Na+/K+ATPase的X-ray晶體結(jié)構(gòu)的闡釋，對這個(gè)問題有了比較清楚的了解。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在Na+/K+ATPase的胞外部分有強(qiáng)心苷特異性結(jié)合的口袋，而在跨膜螺旋TM1和TM2上的Gln111和Asn122是強(qiáng)心苷與口袋結(jié)合的關(guān)鍵殘基，嚙齒類動(dòng)物中此2個(gè)位點(diǎn)分別為精氨酸和天冬氨酸，因而對強(qiáng)心苷不敏感[10]。此外，Na+/K+ATPase胞外環(huán)上其他殘基也影響或參與強(qiáng)心苷與口袋的結(jié)合。

2 Na+/K+ATPase作為強(qiáng)心苷抗腫瘤靶點(diǎn)的研究進(jìn)展

盡管目前抗腫瘤化學(xué)藥物的研究已取得了長足的進(jìn)步，但臨床常用的抗腫瘤化療藥物均不具備對腫瘤細(xì)胞的選擇性殺傷作用。尋找具有選擇性抗腫瘤作用的藥物一直是抗腫瘤藥物研究的重要目標(biāo)。強(qiáng)心苷類藥物可以選擇性抑制人類腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，因此是一類極具應(yīng)用前景的抗腫瘤藥物。

強(qiáng)心苷藥物對心肌有顯著興奮作用而早已用于臨床治療心力衰竭和心房顫動(dòng)，至今已有近300年的歷史，藥理學(xué)背景非常清楚。其強(qiáng)心作用機(jī)理是強(qiáng)心苷選擇性地抑制心肌細(xì)胞膜上的Na+/K+ATPase，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+增加，再通過Na+/Ca2+雙向交換機(jī)制，使細(xì)胞 Ca2+內(nèi)流增加，從而引起心肌細(xì)胞收縮，增強(qiáng)心肌的收縮力。

Stenkvist等[11]報(bào)道了洋地黃制劑對乳腺癌具有抑制作用，他們以175名患有乳腺癌的患者為研究對象隨訪了22年，結(jié)果發(fā)現(xiàn)使用洋地黃的患者死亡率明顯低于未使用洋地黃的患者(6%∶34%)。Haux等[12]對9000多例因心臟疾患使用洋地黃毒苷的患者進(jìn)行了藥物療效分析，證實(shí)血液中洋地黃毒苷的較高濃度與血液和泌尿系統(tǒng)腫瘤較低發(fā)生率呈顯著相關(guān)性?，F(xiàn)在強(qiáng)心苷化合物抗腫瘤的研究已得到了很多研究者的重視。目前，研究者在強(qiáng)心苷化合物抗腫瘤的體外活性、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床研究、抗腫瘤作用機(jī)制、增敏作用、抗腫瘤強(qiáng)心苷化合物的結(jié)構(gòu)改造等方面進(jìn)行了一系列研究，證實(shí)了強(qiáng)心苷化合物具有較強(qiáng)的體內(nèi)外抗腫瘤效果[6]。

但強(qiáng)心苷藥物治療窗口很窄，其血漿濃度過高易引起心率失常，甚至導(dǎo)致個(gè)體死亡，而且人體對強(qiáng)心苷的耐受差異較大。而目前的研究顯示，強(qiáng)心苷類藥物抑制腫瘤生長需要的藥物濃度高于其治療心臟疾病的濃度。因此目前臨床常用的強(qiáng)心苷類藥物如地高辛、洋地黃毒苷不能直接應(yīng)用于腫瘤的治療。強(qiáng)心苷類化合物應(yīng)用于抗腫瘤要解決的關(guān)鍵問題是解決抗腫瘤與心臟毒性之間的矛盾。一種以非洲大牛角瓜(Calotropisprocera)提取物為原料通過半合成改造的強(qiáng)心苷UNBS1450在比利時(shí)和荷蘭已進(jìn)入Ⅰ期臨床試驗(yàn)[13]，其裸鼠移植瘤實(shí)驗(yàn)表明它對人非小細(xì)胞肺癌具有顯著的療效，治療效果優(yōu)于替莫唑胺、紫杉醇、伊立替康及米托蒽醌，其心臟毒性僅是地高辛的1/10，而其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力是地高辛的20～100倍。表明強(qiáng)心苷抗腫瘤活性與其強(qiáng)心活性并不是偶聯(lián)的，通過結(jié)構(gòu)改造可以合成高效低毒的理想的抗腫瘤強(qiáng)心苷化合物。

這類化合物對腫瘤細(xì)胞引起的應(yīng)答是抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡，而對心肌細(xì)胞則是引起收縮，說明其細(xì)胞膜受體Na+/K+ATPase亞基亞型可能不同。從Na+/K+ATPase亞基亞型的多樣性可以很容易理解這一點(diǎn)，事實(shí)上很多研究發(fā)現(xiàn)不同組織來源的腫瘤細(xì)胞對強(qiáng)心苷的敏感性也不同，其原因尚不明確，可能是不同組織來源的細(xì)胞其Na+/K+ATPase亞基的亞型也不相同。可以認(rèn)為，強(qiáng)心苷類藥物抗腫瘤研究的發(fā)展方向在于兩方面，一是通過構(gòu)效關(guān)系的研究，人工合成、改造或篩選新的特異性抗腫瘤強(qiáng)心苷化合物，以達(dá)到高效低毒的抗腫瘤效果；另一方向是通過對各種組織來源腫瘤細(xì)胞Na+/K+ATPase亞基亞型組成的分析研究，尋找強(qiáng)心苷化合物抗腫瘤的適應(yīng)癥。這兩方面的研究都需要先明確強(qiáng)心苷化合物抗腫瘤的作用靶點(diǎn)。因此尋找強(qiáng)心苷類藥物抗腫瘤作用的特異性靶點(diǎn)，是強(qiáng)心苷抗腫瘤研究最重要的工作之一，可以為特異性抗腫瘤強(qiáng)心苷化合物的設(shè)計(jì)、篩選和強(qiáng)心苷抗腫瘤適應(yīng)癥的確定提供基礎(chǔ)。

強(qiáng)心苷抗腫瘤靶點(diǎn)的研究，目前主要集中在α1和α3亞基上。Majatovic等[14]和Lefranc等[15]認(rèn)為，α1亞基可能是強(qiáng)心苷化合物抗腫瘤作用的靶點(diǎn)。他們發(fā)現(xiàn)，強(qiáng)心苷化合物UNBS1450對過表達(dá)α1的人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞、惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制作用，采用siRNA干擾α1的表達(dá)可以增強(qiáng)UNBS1450的抑瘤效果。Xu等[8]的研究顯示，惡變的肝組織和肝癌細(xì)胞株的α1表達(dá)高于正常肝組織，哇巴因可抑制高表達(dá)α1的肝癌HepG2細(xì)胞增殖，采用siRNA干擾α1的表達(dá)可以增強(qiáng)其抑制效果。但有研究顯示，哇巴因?qū)Ζ?表達(dá)量低的人乳腺癌細(xì)胞株 (BT20)和前列腺癌細(xì)胞株 (DU145)腫瘤細(xì)胞有抑制增殖的效果，而對α1表達(dá)量高的豬腎近曲小管上皮細(xì)胞反而有促進(jìn)增殖的效果[16]。也有研究認(rèn)為α3亞基可能是強(qiáng)心甾化合物抗腫瘤作用靶點(diǎn)。Newman等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，夾竹桃苷對高表達(dá)α3的腫瘤細(xì)胞抑制作用更強(qiáng)，而對只表達(dá)α1的腫瘤細(xì)胞無抑制作用，對同時(shí)表達(dá)α1和α3的腫瘤細(xì)胞來說，α3∶α1比例高者對夾竹桃苷的抑增殖作用敏感，而α3∶α1比例低者細(xì)胞生長不容易被抑制。Li等[17]發(fā)現(xiàn)，α3基因沉默可使肝癌細(xì)胞對布法林的敏感性下降，認(rèn)為α3可能是布法林抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用靶點(diǎn)?？梢钥闯觯S著對強(qiáng)心苷抗腫瘤作用了解的深入，我們面對的問題似乎也變得越來越復(fù)雜，進(jìn)一步闡明Na+/K+ATPase亞基的結(jié)構(gòu)、功能以及表達(dá)調(diào)控，弄清楚強(qiáng)心苷化合物與不同亞型Na+/K+ATPase亞基結(jié)合后的相互作用的機(jī)制、激活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及引起的細(xì)胞反應(yīng)，以及不同組織來源腫瘤細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞，特別是與心肌細(xì)胞膜Na+/K+ATPase亞基亞型構(gòu)成的區(qū)別，是強(qiáng)心苷類化合物發(fā)展為臨床抗腫瘤藥物需要解決的重要問題。相信隨著相關(guān)研究的深入，強(qiáng)心苷作為具有選擇性抗腫瘤效果的藥物應(yīng)用于臨床是可以期待的。