韓承慧, 馬海濤 薛 蕊, 姜海濱 常 城, 王 騰

(1. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點實驗室, 山東 煙臺 264006; 2. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院, 上海 201306; 3. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071)

許氏平鲉微衛(wèi)星標記與體長、體質(zhì)量、體高的相關(guān)性分析

韓承慧1,2, 馬海濤1, 薛 蕊3, 姜海濱1, 常 城1,2, 王 騰1,2

(1. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復(fù)重點實驗室, 山東 煙臺 264006; 2. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院, 上海 201306; 3. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071)

為了解許氏平鲉(Sebastes schlegelii)微衛(wèi)星標記與生長性狀的相關(guān)性, 選取26個微衛(wèi)星標記在海捕許氏平鲉群體中進行微衛(wèi)星篩選, 每個微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)(Na)在3~21, 有效等位基因數(shù)(Ne)為1.1815~15.5676; 觀測雜合度(Ho)范圍為0.0417~0.9999; 期望雜合度(He)范圍為0.1581~0.9456;多態(tài)信息含量(PIC)范圍為0.1509~0.9320。利用單標記分析法分析了多態(tài)性較高(PIC>0.5)的22個標記與體長、體質(zhì)量、體高的相關(guān)性, 結(jié)果顯示3個標記與生長性狀顯著相關(guān), 其中HJ2-32與體長、體質(zhì)量和體高顯著相關(guān)(P<0.05), 并推斷等位基因D與C對于體質(zhì)量、體長、體高分別具有重要的正向與負向影響; HJ7-2與體質(zhì)量顯著相關(guān); HJ7-22與體長顯著相關(guān), 并推測等位基因F對體長具有正向影響,等位基因B對體長有負面影響。這些標記可為許氏平鲉分子標記輔助育種提供基礎(chǔ)。

許氏平鲉(Sebastes schlegelii); 微衛(wèi)星標記; 生長性狀; 相關(guān)性分析

許氏平鲉(Sebastes schlegelii), 俗稱黑鲪, 屬鲉形目(Scorpaeniformes)、鲉亞目(Scorpaenoidei)、鲉科(Scorpaenidae)、平鲉亞科(Sebastinae)、平鲉屬(Sebastodes)[1], 廣泛分布于中國東海、黃海和渤海,屬于卵胎生種類[2], 雌魚的性成熟時間一般為3 a,雄魚則一般為4 a。目前養(yǎng)殖苗種以海捕野生苗為主要來源, 養(yǎng)殖成活率較低, 長期的過度捕撈也使許氏平鲉資源和遺傳多樣性遭到破壞, 因此進行其良種選育已成為保護中國許氏平鲉資源、促進許氏平鲉養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必要手段[3]。

魚類的體長、體質(zhì)量和體高均屬于數(shù)量性狀, 由于基因連鎖、一效多因等的存在, 導(dǎo)致數(shù)量性狀受多基因控制, 遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜。隨著分子遺傳標記的飛速發(fā)展, 人們將控制數(shù)量性狀的多個基因分開研究,理論上任何一個表型性狀的基因都存在與之連鎖的DNA標記[4]。此種方法為優(yōu)良品種的快速培育提供了可靠和有效的工具, 利用分子標記輔助選擇(MAS), 可找到與數(shù)量性狀位點相連鎖的分子遺傳標記, 實現(xiàn)縮短時代間隔早期選種及提高選種準確性, 并加快新品種的培育。微衛(wèi)星分子標記, 作為第二代分子標記手段, 具有多態(tài)性高、方便快捷、穩(wěn)定性高等特點[5], 已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物分子標記與數(shù)量性狀的相關(guān)性分析和QTL定位之中[6]。國內(nèi)外對于許氏平鲉微衛(wèi)星標記的研究尚處于起步階段, 日本學者Yoshida等[7]首先利用兩重PCR擴增的方法獲得6個微衛(wèi)星標記; 韓國學者An等[8]利用磁珠富集法獲得了14個微衛(wèi)星標記; Yasuike等[9]利用454測序法篩選了17個微衛(wèi)星標記。國內(nèi)方面, Bai等[10]運用磁珠富集的方法獲得了18個微衛(wèi)星標記;初冠囡等[11]發(fā)表了17個許氏平鲉微衛(wèi)星標記; 賈超峰等[12]報道了15個具有多態(tài)性的微衛(wèi)星標記,薛蕊等[13]開發(fā)EST-SSR標記18個。由于微衛(wèi)星標記的開發(fā)數(shù)量較少, 目前許氏平鲉微衛(wèi)星標記主要應(yīng)用于群體遺傳多樣性分析及家系鑒定[6,11]。本研究以26個微衛(wèi)星標記為基礎(chǔ), 分析許氏平鲉微衛(wèi)星標記與其經(jīng)濟性狀(其體長、體質(zhì)量、體高)的相關(guān)性, 為許氏平鲉數(shù)量性狀定位和進一步分子標記育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所需材料為2009年山東膠南海捕許氏平鲉, 規(guī)格為4 cm~5 cm, 暫養(yǎng)于山東泰華海洋科技有限公司(國家級許氏平鲉原種場), 2011年隨機挑選48尾, 分別標號1~48, 測量其體質(zhì)量、體長、體高3組數(shù)據(jù)。剪取部分尾鰭于70%酒精中, 帶回實驗室–20℃保存, 并盡快提取基因組DNA。

1.2 數(shù)量性狀測量

由于許氏平鲉個體較大, 生性兇猛, 因此先使用MS-222對所測量魚類麻醉[14], 質(zhì)量濃度為30 mg/L的MS-222麻醉15 min。體長、體高分度值為0.1 cm, 體質(zhì)量分度值為0.1 g。

1.3 基因組DNA的提取

取尾鰭樣品約30 mg, 采用傳統(tǒng)酚/氯仿/異戊醇抽提法提取基因組DNA[15]。用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性, NanoDrop2000檢測DNA的濃度和純度。–20℃保存, 使用前稀釋至50 ng/μL。

1.4 微衛(wèi)星引物的設(shè)計及篩選

本實驗所用微衛(wèi)星標記來自賈超峰等發(fā)表的高度多態(tài)的微衛(wèi)星標記14個(HJ1-6至HJ4-94)[12], 通過高通量測序法開發(fā)其微衛(wèi)星標記11個(HJ6-19至HJ8-65), 并從Yoshida[7]報道中選取1個(SSC12)。引物由上海生工生物有限公司合成, TE稀釋。微衛(wèi)星引物特征參見表1。

1.5 微衛(wèi)星PCR擴增及檢測

采用總體積為25 μL的反應(yīng)體系, 包括2 μL DNA模板(50 ng /μL), 2.5 μL 10×buffer, 引物各1 μL (50 μmol/L), 0.5 μL dNTPs(10 mmol/L), 0.2 μLTaq DNA聚合酶(5U/μL), 滅菌水補足。PCR反應(yīng)程序為: 94℃預(yù)變性5 min; 94℃變性40 s, 退火反應(yīng)40 s(退火溫度見表1), 72℃延伸1 min, 30個循環(huán); 最后72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物通過10%(W/V)非變性聚丙烯酰氨凝膠電泳及0.1%硝酸銀染色, 掃描檢測其多態(tài)性。

表1 26對許氏平鲉微衛(wèi)星引物的特征Tab. 1 Characteristics of 26 pairs of microsatellite primers for Sebastes schlegelii

續(xù)表

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

將電泳條帶中的每個DNA片段作為一個等位基因, 統(tǒng)計每個微衛(wèi)星標記的基因型, 根據(jù)遷移率的不同從大到小依次定義為A、B、C……Z。Genepop卡方檢驗估計群體的Hard-Weinberg平衡, Bonferroni校正; Popgene軟件統(tǒng)計各微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)((Na))、有效等位基因數(shù)((Ne))、觀測雜合度(Ho), 期望雜合度(He), PIC Calc 0.6計算每個位點的多態(tài)信息含量(PIC); SPSS19.0檢驗許氏平鲉的體長、體質(zhì)量、體高3個性狀數(shù)據(jù)的正態(tài)性并分析3個性狀之間的相關(guān)性; 一般線性模型(GLM)進行標記與性狀的相關(guān)性分析, 模型為y=u+gi+e, 其中y為性狀觀測值, u為群體均值, g為第i個個體的基因型效應(yīng), e為隨機誤差, 因為測量時間為9月份, 性腺未發(fā)育,不考慮性別效應(yīng); 對不同標記基因型之間的性狀差異性檢測并進行LSD多重比較。

2 結(jié)果

2.1 微衛(wèi)星位點的篩選

所有微衛(wèi)星引物在群體中均表現(xiàn)出了較高的多態(tài)性(表2)。26個微衛(wèi)星標記在48個許氏平鲉個體中共得到260個等位基因, 每個微衛(wèi)星位點的等位基因數(shù)(Na)在3~21, 平均等位基因數(shù)為10.0000, 有效等位基因數(shù)(Ne)為1.1815~15.5676, 平均值為6.1631; 觀測雜合度(Ho)范圍為0.0417~0.9999, 平均值為0.6290; 期望雜合度(He)范圍為0.1581~0.9456,平均值為0.7253; 多態(tài)信息含量(PIC)范圍為0.1509~ 0.9320, 平均值為0.6919。其中HJ4-47, HJ4-64, HJ7-38和HJ8-25為中低度多態(tài)(PIC<0.5), 其余22個位點均表現(xiàn)為高度多態(tài)性, Weber[16]認為只有在微衛(wèi)星標記表現(xiàn)出較高的PIC值, 才可以進行的相應(yīng)的多態(tài)性分析, 因此, 本研究選用高度多態(tài)的22個微衛(wèi)星位點分析與性狀的相關(guān)性。各個微衛(wèi)星位點的Hardy-Weinberg平衡檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)有11個微衛(wèi)星位點顯著偏離平衡, 占總數(shù)的42.3%。研究表明在海洋經(jīng)濟魚類、貝類、棘皮類的群體中被檢測位點偏離Hardy-Weinberg平衡的現(xiàn)象普遍存在[17]。

2.2 生長性狀之間的相關(guān)性

K-S檢驗許氏平鲉體長、體高、體質(zhì)量3個性狀數(shù)據(jù), 3個性狀的雙側(cè)漸進顯著性取值均大于0.10, 說明此3個性狀均服從正態(tài)分布。Pearson檢驗兩性狀之間的相關(guān)性, 結(jié)果見表3。研究表明3個表型值在群體中表現(xiàn)出較高的相關(guān)性, 體長與體高的相關(guān)系數(shù)>體長與體質(zhì)量的相關(guān)系數(shù)>體高與體質(zhì)量的相關(guān)系數(shù)。以體質(zhì)量做因變量, 體長和體高作自變量的通徑分析結(jié)果: 體高對體質(zhì)量的通徑系數(shù)為0.620, 體長對體質(zhì)量的通徑系數(shù)為0.358, 說明體高對體質(zhì)量的直接作用大于體長對體質(zhì)量的直接作用。

表2 48尾許氏平鲉個體中26個微衛(wèi)星標記的遺傳參數(shù)Tab. 2 Genetic diversity parameters of 26 microsatellite primers for Sebastes schlegelii individuals

2.3 微衛(wèi)星標記與生長性狀之間的相關(guān)性分析

利用SPSS中的一般線性模型對22個中高度多態(tài)性(P>0.5)微衛(wèi)星標記和48個許氏平鲉個體的體長、體質(zhì)量、體高進行相關(guān)性分析。由于一些位點中基因型的出現(xiàn)頻率較少, 缺少分析價值, 因此統(tǒng)計時相同基因型個體至少出現(xiàn)4次才做分析[4]。HJ1-6, HJ2-28, HJ3-23, HJ4-92, HJ7-68, HJ7-93, SSC12的等位基因數(shù)較多, 均未出現(xiàn)個體數(shù)不少于4個的基因型, 不進行相關(guān)性分析。其余15個微衛(wèi)星標記的不同基因型個體的生長性狀平均值如表4所示。其中HJ2-32與體長、體質(zhì)量和體高具有顯著相關(guān)(P<0.05), HJ7-2與體質(zhì)量顯著相關(guān), HJ7-22與體長顯著相關(guān)。

表3 兩性狀之間的相關(guān)性系數(shù)Tab. 3 Correlation coefficients between two traits

表4 15個微衛(wèi)星位點不同基因型個體體長、體質(zhì)量和體高平均值和多重比較Tab. 4 Mean values and multiple comparisons of body length, weight, and height in 15 microsatellite loci

續(xù)表

在微衛(wèi)星位點HJ2-32中共檢測到7個基因型,基因型DD的觀測值少于4個不作分析, 其中基因型CD個體的體質(zhì)量、體長、體高均高于其他基因型的個體, 且顯著高于基因型CC個體, 因此可以推斷等位基因D對于體質(zhì)量、體長、體高具有重要的正向影響; 基因型CC個體的體質(zhì)量、體長、體高均低于其他基因型個體, 且顯著低于基因型BD、CD的個體(P<0.05), 因此推斷等位基因C對體質(zhì)量、體長和體高有負面影響。

在微衛(wèi)星位點HJ7-2中, 基因型KK的個體體質(zhì)量觀測值顯著大于其他個體, 基因型NN的觀測值均小于其他基因型的觀測值, 除基因型KK的個體無顯著差異。

在微衛(wèi)星位點HJ7-22中, 基因型BB個體體長的觀測值顯著小于其他基因型的觀測值, 含有等位基因F的基因型BF、CF的個體體長觀測值大于其他基因型的個體, 推測等位基因F對體長具有正向影響, 等位基因B對體長有負面影響。

3 討論

許氏平鲉肉質(zhì)鮮美, 營養(yǎng)豐富, 經(jīng)濟價值高, 是中國北方海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的主要對象之一, 但其生長速度較為緩慢, 達到市場規(guī)格(500 g)需要2~3 a, 因此開展許氏平鲉生長性狀相關(guān)的微衛(wèi)星標記篩選研究, 對選育優(yōu)質(zhì)快速生長新品系, 減少成魚養(yǎng)殖成本, 提高資源利用率有重要意義。

單標記相關(guān)性分析利用一個遺傳標記與一個假定的QTL進行連鎖分析, 根據(jù)分離群體中標記基因型間的數(shù)量性狀平均值的差異來分析確定該標記所在區(qū)域是否存在QTL[18], 通常使用的分析方法是方差分析、回歸分析或似然比檢驗, 如不同基因型數(shù)量性狀均值存在顯著差異, 則說明控制該數(shù)量性狀的QTL與標記有連鎖。微衛(wèi)星標記是水產(chǎn)動物遺傳研究應(yīng)用中最廣泛的標記, 目前國內(nèi)外對于許氏平鲉微衛(wèi)星標記的開發(fā)還處于起步階段, 未發(fā)表高密度的遺傳連鎖圖譜。單標記分析法是在缺乏高密度遺傳連鎖圖譜物種中進行數(shù)量性狀分析的簡單有效方法, 是目前水產(chǎn)動物遺傳標記應(yīng)用于分子標記輔助育種的有效途徑, 已得到廣泛應(yīng)用, 如大菱鲆(Scophthalmus maximus)生長性狀相關(guān)的微衛(wèi)星標記篩選[19], 尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)微衛(wèi)星標記與主要生長性狀的相關(guān)性分析[20], 鯽(Carassius auratus)微衛(wèi)星標記與幾個生長性狀的相關(guān)性分析[21]。但是此種方法存在不能確定QTL的可靠位置, 不能計算QTL效應(yīng)和重組率等弊端。

本研究中所用樣本為野生海捕的48個許氏平鲉個體, 有6個微衛(wèi)星標記中出現(xiàn)相同基因型個體均少于4個的現(xiàn)象, 這可能與微衛(wèi)星標記的多態(tài)性較高,等位基因數(shù)多, 但群體個體數(shù)不足有關(guān)。閔霞等[22]在微衛(wèi)星分子標記與松浦鏡鯉(Cyprinus carpio Songpu carp)3個表型性狀的相關(guān)分析中選取了194個松浦鏡鯉個體; 崔曉亮等[23]在鯽(Carassius auratus)體長和體高相關(guān)的EST-SSR標記的篩選研究中選用了不同家系的181個個體; 張義鳳等[24]在鯉魚(Cyprinus carpio)微衛(wèi)星標記與體質(zhì)量、體長和體高性狀的相關(guān)性分析中選用了92個個體。因此獲得更加精確性的性狀相關(guān)的微衛(wèi)星標記需要增加的分析樣本數(shù)量。

水產(chǎn)動物的選育過程中, 確定并合理利用物種性狀間的相關(guān)性至關(guān)重要, 可以有效地提高選育效果。只有在相關(guān)系數(shù)R大于或等于0.85時, 才能作為通徑分析的自變量[25]。本研究中, 體長、體高與體質(zhì)量的相關(guān)系數(shù)分別為0.907、0.937, 因此可作為對體質(zhì)量通徑分析的自變量, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)體高對體質(zhì)量的直接作用大于體長對體質(zhì)量的直接作用, 可作為選育工作的指導(dǎo)。

本研究篩選得出與體長、體質(zhì)量、體高均相關(guān)的微衛(wèi)星標記HJ2-32, 群體的平均體長、平均體質(zhì)量、平均體高分別為35.5 cm、639.2 g、9.3 cm, 基因型CD對3種表型性狀均表現(xiàn)出正向相關(guān), 其個體的平均值分別為: 38.1 cm、741.2 g和9.8 cm, 比群體平均值分別高出7.3%、16.0%、5.4%; 標記HJ7-2基因型KK的個體體質(zhì)量平均值為756.8 g, 高出群體平均值18.4%, 基因型NN的個體平均值為477.2 g,低于平均值25.4%; 標記HJ7-22中基因型為BB個體的體長平均值比群體平均值低11.2%, 含有等位基因F的個體平均值比群體平均值高5.9%。因此HJ2-32, HJ7-2, HJ7-22 3個標記可以應(yīng)用于增進優(yōu)勢性狀, 避免劣勢性狀的分子育種中, 使傳統(tǒng)育種與分子育種相結(jié)合, 加快育種的進程。隨著分子標記的快速發(fā)展, 許氏平鲉微衛(wèi)星標記數(shù)量的增加, 更多與經(jīng)濟性狀相關(guān)的分子標記的獲得, 以及高密度遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建, 可以加快遺傳育種的進程, 從而培育出抗逆速生的許氏平鲉新品系。

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Received:Oct. 30, 2015

Correlation analysis of microsatellite markers with body length, weight, and height in Sebastes schlegelii

HAN Cheng-hui1,2, MA Hai-tao1, XUE Rui3, JIANG Hai-bin1, CHANG Cheng1,2, WANG Teng1,2
(1. Shandong Provincial Key Laboratory of Restoration for Marine Ecology, Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai 264006, China; 2. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

Sebastes schlegelii; microsatellite; growth traits; correlation analysis

Twenty-six polymorphic microsatellite markers were selected to estimate a wild population of Sebastes schlegelii for studying the correlation between microsatellite markers and growth traits, which revealed that the number of alleles was 260 and the allele numbers ranged from 3 to 21 per locus. The observed and expected heterozygosity varied from 0.0417 to 0.9999 and from 0.1581 to 0.9456, respectively. The values of polymorphic information content ranged from 0.1509 to 0.9320. Twenty-two microsatellite loci with high polymorphism were used to analyze the correlation with body length, weight, and height by single marker-based analysis. The results showed that these markers significantly correlated with growth traits; loci HJ2-32 significantly correlated with three growth traits, and alleles D and C had positive and negative effects on growth traits, respectively. HJ7-2 showed a significant correlation with body weight; alleles F and B of HJ7-22 had positive and negative effects on length traits, respectively. These aforementioned markers would be of benefit for a further study on molecular marker-assisted breeding of S. schlegelii.

S965

A

1000-3096(2016)12-0047-09

10.11759//hykx20151030002

(本文編輯: 譚雪靜)

2015-10-30;

2015-12-23

山東省良種工程項目(2014-2017)

[Foundation: Shandong Province Breeding Project No.2014-2017]

韓承慧(1990-), 男, 山東萊蕪人, 碩士研究生, 主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖工作, 電話: 15564507213, E-mail: CH_Han1990@163.com;姜海濱, 通信作者, 研究員, E-mail: haibinjiang326@163.com