丁海濤，　楊　紅，　徐佩琳，　張　潔，　鄒　樂

(1.合肥學(xué)院 生物與環(huán)境工程系，合肥　230601；2.合肥學(xué)院 計算機科學(xué)與技術(shù)系，合肥　230601)

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木瓜蛋白酶對黑啤渾濁的影響研究

丁海濤1，楊紅1，徐佩琳1，張潔1，鄒樂2

(1.合肥學(xué)院 生物與環(huán)境工程系，合肥230601；2.合肥學(xué)院 計算機科學(xué)與技術(shù)系，合肥230601)

摘要：為降低黑啤渾濁度，同時盡可能保留營養(yǎng)成分，向黑啤中添加木瓜蛋白酶分解蛋白質(zhì)。選取酶處理溫度、處理時間、酶濃度作為影響因子，分析其對黑啤渾濁的影響。在單因素實驗結(jié)果上進行正交工藝優(yōu)化。結(jié)果表明：向黑啤中添加酶濃度0.12mg/100mL的木瓜蛋白酶，反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)12h其渾濁度可降10.80%，啤酒感評可接受，能達(dá)到進一步澄清的效果。

關(guān)鍵詞：木瓜蛋白酶；黑??；渾濁

啤酒在生產(chǎn)、運輸、銷售的過程中由于內(nèi)部成分和外部環(huán)境條件的作用，比如說渾濁活性蛋白與渾濁活性多酚的相互作用、外部條件的氧化、光照等作用都極易出現(xiàn)啤酒沉淀渾濁現(xiàn)象從而導(dǎo)致啤酒品質(zhì)的下降。[1]目前研究結(jié)果顯示造成啤酒渾濁主要有兩大方面因素的影響，一方面是生物渾濁，另一方面是非生物渾濁。[2]

引起啤酒非生物渾濁的主要因素之一就是蛋白質(zhì)和多酚之間的相互作用，二者的相互作用同時也是影響啤酒的泡沫覆蓋率、泡持性、口感、味道等啤酒品質(zhì)的重要因素。[3]啤酒中蛋白質(zhì)混濁現(xiàn)象大體可分為氧化渾濁、殺菌混濁、冷熱混濁三種。[4]渾濁一旦形成即會對啤酒的品質(zhì)造成危害。木瓜蛋白酶是一種由單肽鏈組成的蛋白水解酶，能夠水解多種蛋白質(zhì)和多肽。相對分子質(zhì)量約為22 000，約含有211個氨基酸殘基，且這些氨基酸殘基中有少許占據(jù)于酶的活性中心位置，能夠直接與底物分子結(jié)合，催化底物化學(xué)反應(yīng)。[5]木瓜蛋白質(zhì)酶最適合pH 值為5～6(一般2～9皆可), 最適合溫度55～65℃(一般25～85℃皆可)，特別適合啤酒生產(chǎn)工藝特定條件。該酶耐熱性強，在90℃時也不會完全失活。由于其具有良好的穩(wěn)定性、較強的水解能力和降解多種蛋白質(zhì)的能力，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于嫩化肉類產(chǎn)品、啤酒澄清、豆腐加工等[6-7]，增加泡沫覆蓋率，提高啤酒的泡持性，改善口感的同時也能提高啤酒的營養(yǎng)價值[8]。南寧華南公司的研究結(jié)果表明在啤酒生產(chǎn)過程中的麥芽蛋白分解階段、后酵或清酒階段加入木瓜蛋白酶均能很好地降低啤酒的渾濁度[9]。本研究以合肥學(xué)院自釀黑啤為原料，向其中添加木瓜蛋白酶來達(dá)到降低其濁度的目的，以提高其在市場上的競爭力。

一、材料與方法

(一)實驗材料

黑?。汉戏蕦W(xué)院生物與環(huán)境工程系啤酒中試線釀造。

(二)儀器及試劑

1.儀器設(shè)備

TP-300D型電子天平，湘儀天平儀器設(shè)備有限公司；722型可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司；DKS-28型不銹鋼新型電熱恒溫水浴鍋，寧波江南儀器廠；GZX-9070MBE精密鼓風(fēng)恒溫干燥箱，合肥達(dá)斯卡特科學(xué)器材有限公司；BCD-160TB冰箱，青島海爾股份有限公司；KQ2200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SS-2Z型智能懸浮物儀，上海海爭電子科技有限公司；等。

2.實驗試劑

木瓜蛋白酶，食品級，北京澳博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；考馬斯亮藍(lán)G250，分析純， 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇，分析純，山海蘇懿化學(xué)試劑有限公司；磷酸，分析純，西隴化工股份有限公司；牛血清白蛋白，化學(xué)純，上海源聚生物科技有限公司；等。

(三)實驗方法

1.啤酒中蛋白質(zhì)含量的測定

考馬斯亮藍(lán)染色法[10]

(1)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定。取7支試管，依次加入0.1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液 0、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1mL，分別加入蒸餾水定容至1.0mL。再向7支試管中分別加入5.0mL考馬斯亮藍(lán)G250試劑，邊加入邊混合搖勻。

加完試劑4分鐘左右，于可見分光光度計下測定各樣品在595nm處的吸光度，以未加蛋白質(zhì)溶液的試管作為空白對照，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)質(zhì)量(mg)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)樣品的測定。用2mL的移液管移取2mL黑啤與燒杯中，同時用10mL移液管移取8mL蒸餾水與燒杯中稀釋(稀釋5倍)，取1mL蒸餾水作為空白對照，參照1.3.1中的(1)進行操作，在分管光度計中測出其在595nm處的吸光度。

(3)結(jié)果的計算。依據(jù)所測黑啤酒的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上尋出對應(yīng)的蛋白質(zhì)質(zhì)量，按下列公式計算出蛋白質(zhì)含量(mg/100g)。

(1)

其中：c為曲線中所對應(yīng)的蛋白質(zhì)質(zhì)量，mg；m為啤酒的質(zhì)量，g。

2.木瓜蛋白酶溶液的配置

用電子天平準(zhǔn)確稱取定量的木瓜蛋白酶粉末，使用超聲波輔助溶解，分別配置成濃度為0.04mg/mL、0.08mg/mL、0.12mg/mL、0.16mg/mL的酶溶液。

3.啤酒渾濁度的測定

將加熱后的啤酒取出，迅速放入冰箱冷卻5min后取出。精確量取2mL反應(yīng)過后的黑啤，加入48mL的水溶液稀釋，混合后倒入智能懸浮物儀的玻璃皿中，將玻璃皿放入儀器槽中，蓋上黑蓋，讀取數(shù)據(jù)。

4.單因素實驗設(shè)計

(1)木瓜蛋白酶濃度：分別用移液管在上述配置好的不同酶液中量取1mL于100mL的啤酒中，此時酶濃度依次為0.04mg/100mL、0.08mg/100mL、0.12mg/100mL、0.16mg/100mL，空白對照取1mL水溶液，按上述相同步驟進行，同時啤酒與水浴鍋中的恒溫條件設(shè)置為50℃，反應(yīng)12小時后根據(jù)啤酒渾濁度的測定中的步驟進行操作獲得啤酒的渾濁度。

(2)反應(yīng)溫度：分別用1mL的移液管量取4份0.12mg/mL的木瓜蛋白酶水溶液于100mL的黑啤中，將水浴鍋溫度依次設(shè)置為40、50、60和70℃，反應(yīng)12h。根據(jù)啤酒渾濁度測定中的步驟進行操作獲得啤酒的渾濁度。

(3)處理時間：分別用1mL的移液管量取4份0.12mg/mL的木瓜蛋白酶水溶液與100mL的黑啤中，在水浴鍋溫度設(shè)為50℃的條件下，在該溫度條件下分別反應(yīng)4h、8h、12h、16h。根據(jù)啤酒渾濁度的測定中的步驟進行操作獲得啤酒的渾濁度。

5.正交實驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果進行L9(34)優(yōu)化。因素水平表見表1。

表1　因素水平表

6.啤酒感觀評定[11]

表2　濃色啤酒、黑色啤酒感官要求

二、結(jié)果與分析

(一)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液在595nm下測得的吸光度值繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示?；貧w方程為：y=4.9803x+0.0136；R2=0.9919。

圖1　蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

(二)單因素對啤酒渾濁的影響

1.酶濃度對啤酒渾濁的影響

不同濃度的酶溶液對啤酒渾濁的影響見圖2。

圖2　酶濃度對啤酒濁度的影響

由圖2可知隨著木瓜蛋白酶濃度的升高，啤酒的濁度緩慢降低，當(dāng)酶濃度達(dá)到0.12mg/mL時其濁度下降最多，濁度下降11.52%；隨著木瓜蛋白酶濃度的進一步增大，濁度下降幅度反而減小。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因是由于啤酒中蛋白質(zhì)含量有限，而酶過量會與啤酒中的一些成分發(fā)生沉淀反應(yīng)[12]，導(dǎo)致降濁效果下降。故選取0.08mg/100mL、0.12mg/100mL、0.16mg/100mL作為正交實驗中酶濃度因素的三個水平。

2.反應(yīng)溫度對啤酒渾濁的影響

不同酶處理溫度對啤酒渾濁的影響見圖3。

圖3　反應(yīng)溫度對啤酒濁度的影響

由圖3可看出，隨酶處理溫度身高，濁度降低效果逐漸增大，當(dāng)溫度為50℃時，啤酒的濁度降低達(dá)到最大，為10.7%；隨著處理溫度進一步增加，濁度下降效果逐漸減小。這是因為隨溫度升高，啤酒的含氧量不斷增高，啤酒的氧化渾濁現(xiàn)象越發(fā)嚴(yán)重。故選取40℃、50℃、60℃作為正交試驗中反應(yīng)溫度因素的三個水平。

3.反應(yīng)時間對啤酒渾濁的影響

不同反應(yīng)時間對啤酒渾濁的影響見圖4。

圖4　反應(yīng)時間對啤酒濁度的影響

由圖4可看出隨著反應(yīng)時間的增加，啤酒的濁度下降的程度越大，當(dāng)達(dá)到12h后，濁度趨于平穩(wěn)，且隨著時間的加長，濁度下降趨于平緩。考慮到反應(yīng)時間過長，啤酒受外界環(huán)境的影響也逐漸加大，品質(zhì)劣變明顯，故選取8h、12h、16h作為正交實驗中時間因素的三個水平。

(三)正交優(yōu)化

1.正交優(yōu)化結(jié)果

表3　正交實驗結(jié)果表

由表3可知：3個因素對降低啤酒渾濁度影響的主次順序為B>A>C，即反應(yīng)溫度>酶濃度>反應(yīng)時間；其最優(yōu)水平組合為A2B2C2，即酶濃度為0.12mg/100mL、反應(yīng)溫度為50℃、反應(yīng)時間為12h。

2.最優(yōu)組合驗證實驗

對A2B2C2的最優(yōu)組合進行驗證，其啤酒的渾濁度降低為10.80%，該結(jié)果比正交試驗組合中酶濃度為0.12mg/100mL、反應(yīng)溫度為50℃、反應(yīng)時間為16h(即第5組)所降低的濁度10.75%略好。

3.最優(yōu)組合下濁度與蛋白質(zhì)含量的變化

在最優(yōu)組合條件下，即酶濃度0.12mg/100mL、反應(yīng)溫度50℃、反應(yīng)時間12h組合下獲得的啤酒，按1.3.1中蛋白質(zhì)含量測定的方法，測得木瓜蛋白酶處理后的蛋白質(zhì)濃度為38.69mg/100g；與空白相比可溶性蛋白質(zhì)濃度下降30.23%，部分蛋白質(zhì)被分解成多肽等小分子，減少了蛋白質(zhì)與多酚結(jié)合的位點或空間結(jié)構(gòu)，引起其濁度下降10.80%，啤酒得到進一步澄清。

(四)啤酒感觀品質(zhì)的變化

成品啤酒中添加木瓜蛋白酶來降低啤酒的渾濁

表4　啤酒品質(zhì)的變化

度，在反應(yīng)發(fā)生過程中，由于溫度的升高，啤酒可能會出現(xiàn)老化、氧化現(xiàn)象，并伴隨氧化味。[13]同時啤酒的酒香也會隨著溫度升高和放置時間的延長，酒香味、起泡性有所降低。處理組與對照組相比，感觀品質(zhì)略有降低，但尚可接受。

三、結(jié)論

向成品黑啤酒中添加木瓜蛋白酶水解蛋白質(zhì)達(dá)到降低黑啤渾濁度的目的，在單因素的基礎(chǔ)上進行正交優(yōu)化，獲得酶濃度為0.12mg/100mL、反應(yīng)溫度為50℃、反應(yīng)時間為12h的最優(yōu)組合。在此條件下，啤酒的渾濁度降低10.80%；而啤酒蛋白質(zhì)的濃度下降30.23%，感觀品質(zhì)與對照相比可以接受。

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[責(zé)任編輯李潛生]

Study on the Effect of Papaya Proteinase on the Haze of Dark Beer

DING Hai-tao1,YANG Hong1,XU Pei-lin1,ZHANG Jie1，ZOU Le2

(1.Department of Biological and Environmental Engineering, Hefei University, Hefei 230601,China;2.Department of Computer Science and Technology, Hefei University, Hefei 230601,China)

Abstract:In order to reduce the haze of dark beer and preserve the nutritive components at the same time, the papaya proteinase was added to dark beer for decomposing protein. The factors, such as enzyme treatment temperature, treatment time and enzyme concentration, which were been selected to analyze its influence on the haze of dark beer. Orthogonal process optimization was carried out in the single factor experiment results. It was showed that the haze of dark beer could been reduced 10.80% under the concentration of 0.12mg/100mL papaya proteinase, 50℃ of enzyme treatment temperature and 12h of treatment time conditions. The quality of beer could be acceptable on the basis of sensory evaluation. The effect of dark beer clarification could be achieved further.

Key words:papaya proteinase; dark beer; haze

中圖分類號：Q946.5；TS262.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1008-6021(2016)01-0125-04

通訊作者：楊紅(1981-)，男，安徽舒城人，碩士，副教授。研究方向：食品生化與生物統(tǒng)計。

作者簡介：丁海濤(1988-)，男，安徽舒城人，碩士研究生。

基金項目：安徽省高校省級優(yōu)秀青年人才基金重點項目(項目編號：2013SQRL079ZD)；安徽省高校優(yōu)秀青年人才支持計劃重點項目(項目編號：gxyqZD2016269)；安徽省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(項目編號：AH201411059043)；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(項目編號：201511059079)。

收稿日期：2015-12-01