鄧阿妹， 魏　鳳，吳　佳，馬海霞，袁志明

(1. 中國(guó)科學(xué)院武漢文獻(xiàn)情報(bào)中心，武漢　430071； 2. 中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所，武漢　430071)

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生物安全實(shí)驗(yàn)室病毒懸液滅活試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化研究

鄧阿妹1， 魏鳳1，吳佳2，馬海霞2，袁志明2

(1. 中國(guó)科學(xué)院武漢文獻(xiàn)情報(bào)中心，武漢430071； 2. 中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所，武漢430071)

【摘要】化學(xué)消毒劑常用于病毒的滅活和實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的消毒，其對(duì)病毒滅活的效果及評(píng)價(jià)直接影響實(shí)驗(yàn)室的生物安全。鑒于目前我國(guó)尚缺乏對(duì)化學(xué)消毒劑殺病毒效果的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，本文在對(duì)歐盟現(xiàn)行的化學(xué)消毒劑殺病毒定量懸浮試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的研究分析的基礎(chǔ)上，結(jié)合我國(guó)生物安全實(shí)驗(yàn)室的管理現(xiàn)狀，提出了歐盟現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)化的方案。建議以包括高致病性病毒的替代病毒在內(nèi)的6種病毒作為試驗(yàn)用的模式病毒，同時(shí)增加殘留化學(xué)消毒劑的去除方法和試驗(yàn)結(jié)果95%置信區(qū)間計(jì)算方法內(nèi)容。該建議提高了標(biāo)準(zhǔn)的科學(xué)性和可操作性，并為我國(guó)實(shí)驗(yàn)室消毒滅菌標(biāo)準(zhǔn)制定提供了參考。

【關(guān)鍵詞】病毒滅活；化學(xué)消毒劑；生物安全；標(biāo)準(zhǔn)；定量懸浮試驗(yàn)；殺病毒效果評(píng)估

生物安全實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)涉及對(duì)包括病毒在內(nèi)的多種高致病性病原微生物的操作和研究。采取消毒措施對(duì)被病毒污染的環(huán)境、儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)廢棄物及人體表面的消毒是避免實(shí)驗(yàn)室工作人員感染和病毒向?qū)嶒?yàn)室外環(huán)境泄露的重要手段。消毒方法不當(dāng)極易造成人員的感染和病毒的傳播，從而導(dǎo)致極其嚴(yán)重的生物安全事故。2004年北京發(fā)生了實(shí)驗(yàn)室SARS冠狀病毒感染事件。事后查明，是由于采用未經(jīng)論證和效果驗(yàn)證的非典病毒滅活方法，在不符合防護(hù)要求的普通實(shí)驗(yàn)室內(nèi)操作冠狀病毒感染材料造成的[1]。因此，做好消毒工作對(duì)于生物安全實(shí)驗(yàn)室的正常運(yùn)行和人員的生命安全具有非常重要的意義。

利用化學(xué)消毒劑對(duì)病毒污染物進(jìn)行消毒需要對(duì)病毒滅活的效果進(jìn)行正確、科學(xué)的評(píng)價(jià)。目前，國(guó)際上主要采用病毒懸液滅活試驗(yàn)法和病毒載體滅活試驗(yàn)法在實(shí)驗(yàn)室條件下對(duì)化學(xué)消毒劑的殺病毒活性進(jìn)行檢測(cè)和評(píng)估，其中病毒懸液滅活試驗(yàn)法因操作相對(duì)容易而成為最常使用的方法[2-4]。病毒懸液滅活試驗(yàn)法是在實(shí)驗(yàn)室中模擬實(shí)際使用條件對(duì)化學(xué)消毒劑殺病毒懸液的活性進(jìn)行測(cè)試和驗(yàn)證，其結(jié)果可作為實(shí)際生活中選擇化學(xué)消毒劑和評(píng)估殺病毒效果的主要參考依據(jù)。一些國(guó)家已將該方法作為標(biāo)準(zhǔn)推出以規(guī)范對(duì)該方法的使用，如歐盟標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476 “化學(xué)消毒劑和防腐劑 —人類(lèi)醫(yī)學(xué)中化學(xué)消毒劑和防腐劑的殺病毒定量懸浮試驗(yàn) — 試驗(yàn)方法和要求”就是一個(gè)在歐盟被廣泛使用、同時(shí)也被國(guó)際社會(huì)接受的標(biāo)準(zhǔn)。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步和研究的深入，人們對(duì)于病毒性質(zhì)和傳播機(jī)制的了解逐步加深，這為病毒懸液滅活試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)的改進(jìn)和優(yōu)化提供了有利條件。

基于中法生物安全標(biāo)準(zhǔn)化領(lǐng)域的研究與合作，本研究針對(duì)化學(xué)消毒劑殺病毒定量懸浮試驗(yàn)這一方法標(biāo)準(zhǔn)開(kāi)展相關(guān)分析和研究，希望通過(guò)調(diào)研和追蹤該方法的最新研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)存在的不足，并提出改進(jìn)建議，為我國(guó)制定殺毒滅菌相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1研究目標(biāo)和方法

本研究的研究目標(biāo)有3點(diǎn)：(1)對(duì)法國(guó)歐盟標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476 “化學(xué)消毒劑和防腐劑 — 人類(lèi)醫(yī)學(xué)中化學(xué)消毒劑和防腐劑的殺病毒定量懸浮試驗(yàn) — 試驗(yàn)方法和要求(第2階段第1步)”[5]的內(nèi)容進(jìn)行深入分析。該標(biāo)準(zhǔn)由歐盟委員會(huì)于2005年發(fā)布并被法國(guó)轉(zhuǎn)化為國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。在內(nèi)容上，該標(biāo)準(zhǔn)包括了“范圍”、“規(guī)范性引用標(biāo)準(zhǔn)”、“術(shù)語(yǔ)和定義”、“試驗(yàn)要求”、“材料和試劑”、“試驗(yàn)方法”、“用于指定病毒的試驗(yàn)程序”、“試驗(yàn)數(shù)據(jù)的計(jì)算”、“試驗(yàn)結(jié)果的表示”和“附錄”等10個(gè)部分。通過(guò)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容的深度分析，全面掌握標(biāo)準(zhǔn)涉及的關(guān)鍵信息；(2)通過(guò)檢索分析的方法，利用Web of Science 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)相關(guān)論文進(jìn)行檢索。Web of Science 數(shù)據(jù)庫(kù)收錄了從1970年至今的8000多種世界范圍內(nèi)最具有影響力的、經(jīng)同行專家評(píng)審的高質(zhì)量的期刊。本研究利用“disinfectant”、“virus inactivation”、 “virucidal activity”、“quantitative suspension test”等關(guān)鍵詞對(duì)該數(shù)據(jù)庫(kù)中2005至2015年10年間全球發(fā)表的消毒滅菌相關(guān)論文進(jìn)行檢索。通過(guò)文獻(xiàn)調(diào)研的方法對(duì)檢索到的科技文獻(xiàn)加以深度分析和研究，聯(lián)合專家咨詢的方法以期詳細(xì)掌握化學(xué)消毒劑殺病毒懸液試驗(yàn)方法的研究進(jìn)展。(3)掌握化學(xué)消毒劑殺病毒定量懸浮試驗(yàn)方法標(biāo)準(zhǔn)在相關(guān)國(guó)家的應(yīng)用狀況。

通過(guò)以上3個(gè)目標(biāo)的研究和分析，將掌握的該領(lǐng)域的研究進(jìn)展與法國(guó)歐盟標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476開(kāi)展比對(duì)分析，結(jié)合對(duì)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)際應(yīng)用情況的調(diào)研，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容給出改進(jìn)和完善的建議。

2標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476內(nèi)容解析

標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476規(guī)定了化學(xué)消毒劑殺病毒定量懸浮試驗(yàn)的方法和最低要求，篇幅較長(zhǎng)、內(nèi)容較多、信息量大。需對(duì)內(nèi)容的關(guān)鍵信息進(jìn)行總結(jié)和提煉，以便于同文獻(xiàn)中的相關(guān)信息進(jìn)行比對(duì)分析?，F(xiàn)將該標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)容的關(guān)鍵信息及特點(diǎn)進(jìn)行總結(jié)，如表1。

標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476從制定到現(xiàn)在已過(guò)去10多年，上述表中涉及的一些技術(shù)和方法是當(dāng)時(shí)科學(xué)研究所取得的成果，代表著當(dāng)時(shí)科學(xué)技術(shù)的水平，該標(biāo)準(zhǔn)的提出和制定也是根據(jù)當(dāng)時(shí)的科學(xué)研究的狀況和實(shí)際的需求。隨著時(shí)代的發(fā)展和科技的進(jìn)步，該標(biāo)準(zhǔn)涉及的方法和技術(shù)是否落后？該標(biāo)準(zhǔn)是否還適用于當(dāng)今的科學(xué)研究？是否能滿足當(dāng)今實(shí)際工作的需要？這些都是必須思考的問(wèn)題。

3標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476的分析和優(yōu)化

根據(jù)對(duì)文獻(xiàn)信息的深度挖掘和分析，化學(xué)消毒劑殺病毒懸液試驗(yàn)方法在試驗(yàn)?zāi)Ｊ讲《镜姆N類(lèi)、試驗(yàn)病毒的替代病毒、殘留化學(xué)消毒劑的去除方法、對(duì)照和對(duì)比試驗(yàn)的設(shè)置及試驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算和分析等方面均取得了新的研究進(jìn)展和成效。針對(duì)標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476，可以在這些方面對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化，下面展開(kāi)具體論述。

表1　法國(guó)歐盟標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476內(nèi)容關(guān)鍵信息總結(jié)

注：N0：未經(jīng)消毒劑處理的陽(yáng)性病毒對(duì)照的滴度值； Nx：消毒劑處理的病毒滴度值

表2　法國(guó)歐盟標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476試驗(yàn)?zāi)Ｊ讲《緝?yōu)化前后對(duì)比

3.1試驗(yàn)?zāi)Ｊ讲《镜姆N類(lèi)分析

在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下進(jìn)行化學(xué)消毒劑殺病毒定量懸浮試驗(yàn)時(shí)，設(shè)定試驗(yàn)的模式病毒非常必要。由于病毒種類(lèi)繁多、性質(zhì)各異，任何實(shí)驗(yàn)室都無(wú)法達(dá)到條件來(lái)測(cè)試所有消毒劑對(duì)全部已知病毒的殺滅活性，因此需采用模式病毒進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)?zāi)Ｊ讲《拘杈邆浒踩愿摺⒎€(wěn)定性高、可操作性強(qiáng)、易增殖等特點(diǎn)。目前，世界上對(duì)于模式病毒沒(méi)有統(tǒng)一的規(guī)定，各國(guó)都在積極尋找各種核酸類(lèi)型的病毒作為試驗(yàn)的模式病毒。

標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476規(guī)定的試驗(yàn)?zāi)Ｊ讲《居?種，分別是作為無(wú)包膜RNA病毒類(lèi)代表的類(lèi)型1脊髓灰質(zhì)炎病毒(毒株為L(zhǎng)Sc-2ab)、作為無(wú)包膜DNA病毒類(lèi)代表的類(lèi)型5腺病毒(毒株為adenoid 75和ATCC VR-5)和作為耐熱病毒類(lèi)代表的牛細(xì)小病毒(毒株為Haden和ATCC VR-767)。根據(jù)有無(wú)包膜結(jié)構(gòu)，病毒分為包膜病毒和無(wú)包膜病毒兩大類(lèi)。包膜結(jié)構(gòu)對(duì)化學(xué)消毒劑比較敏感，一般認(rèn)為，無(wú)包膜病毒對(duì)化學(xué)消毒劑的抵抗力強(qiáng)于包膜病毒，如果化學(xué)消毒劑對(duì)無(wú)包膜病毒具有殺滅活性，那么它對(duì)包膜病毒也應(yīng)具有殺滅活性。但是，由于病毒性質(zhì)的巨大差異，事實(shí)情況卻并非如此，例如，含乙醇或甲醛的消毒劑可將無(wú)包膜的脊髓灰質(zhì)炎病毒滅活，卻不能將包膜病毒SV40滅活。事實(shí)上，除了無(wú)包膜病毒之外，包膜病毒也可以作為試驗(yàn)的模式病毒。痘苗病毒(VACV)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)和猴多瘤病毒40(SV40)擁有模式病毒要求的諸多特點(diǎn)，具備作為模式病毒的潛力。為此，研究者們開(kāi)展了大量的研究工作，從實(shí)踐上證明了這3種包膜病毒作為模式病毒的可行性[6-11]。

標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476僅將無(wú)包膜病毒作為試驗(yàn)的模式病毒，忽視了包膜病毒作為模式病毒的必要性，從這一點(diǎn)來(lái)說(shuō)，該標(biāo)準(zhǔn)不夠科學(xué)和嚴(yán)謹(jǐn)。因此，應(yīng)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476的試驗(yàn)?zāi)Ｊ讲《镜姆N類(lèi)進(jìn)行擴(kuò)充，在已有模式病毒的基礎(chǔ)上將VACV、BVDV和SV40作為評(píng)估化學(xué)消毒劑對(duì)包膜病毒殺滅活性的模式病毒。標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476試驗(yàn)?zāi)Ｊ讲《緝?yōu)化前后對(duì)比見(jiàn)表2所示。

3.2試驗(yàn)病毒的替代病毒分析

在實(shí)際生活中，存在一些如乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、諾如病毒、SARS冠狀病毒(SARS-CoV)等流行度高、致病性強(qiáng)、危害性大的病毒，給人類(lèi)的健康造成了極大威脅。實(shí)驗(yàn)室條件下檢驗(yàn)化學(xué)消毒劑對(duì)這類(lèi)高危病毒的殺滅活性時(shí)，僅使用模式病毒是不夠的。直接利用這些病毒作為試驗(yàn)病毒理論上是最科學(xué)的，但是，由于這些病毒具有極強(qiáng)的感染性和致病性，而且還存在體外增殖困難的缺點(diǎn)，在實(shí)際操作上是不可行的。為了解決這些問(wèn)題，學(xué)者們開(kāi)展了替代病毒的研究，以期發(fā)現(xiàn)或改造一些與這些病毒結(jié)構(gòu)和屬性類(lèi)似、對(duì)人體不致病或致病性較弱且易于體外增殖的病毒來(lái)代替高致病性病毒開(kāi)展試驗(yàn)。研究者們發(fā)現(xiàn)，可用鴨乙型肝炎病毒(DHBV)代替HBV[12]、用BVDV代替HCV[13]、用鼠諾如病毒(MNV)或貓杯狀病毒(FCV)代替人諾如病毒[14,15]、用牛冠狀病毒(BCV)或禽傳染性支氣管炎病毒(IBV)代替SARS-CoV[16]開(kāi)展化學(xué)消毒劑對(duì)以上高危病毒殺滅活性的試驗(yàn)。另外，雖然要求試驗(yàn)?zāi)Ｊ讲《緦?duì)人體應(yīng)具有安全性，但實(shí)際上，一些模式病毒仍可以使人體致病，尋找更加安全的模式病毒替代它們也是研究者們關(guān)心的問(wèn)題[17]。改良安卡拉痘苗病毒(MVA)是痘苗病毒經(jīng)過(guò)人工改造后的變異體，喪失了對(duì)人體的感染能力。有研究表明，改良安卡拉痘苗病毒可以作為痘苗病毒理想的替代物[18]。目前，研究者們還沒(méi)有尋找到合適的病毒來(lái)替代脊灰病毒作為模式病毒，這將是未來(lái)研究工作需要解決的問(wèn)題。標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476沒(méi)有涉及試驗(yàn)病毒的替代病毒，有必要依據(jù)以上研究結(jié)果對(duì)其進(jìn)行補(bǔ)充和完善。以上病毒及替代病毒總結(jié)如表3。

表3　化學(xué)消毒劑殺病毒活性的試驗(yàn)病毒與替代病毒

3.3殘留化學(xué)消毒劑的去除分析

試驗(yàn)過(guò)程中殘留的化學(xué)消毒劑會(huì)使細(xì)胞培養(yǎng)物中毒，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果的可靠性降低，因此有必要將其去除。標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476中，對(duì)毒性較低的化學(xué)消毒劑采用稀釋法將其去除，對(duì)毒性較高且稀釋法無(wú)法取得理想效果的化學(xué)消毒劑，采用SephadexTMLH-20凝膠過(guò)濾技術(shù)將其去除。標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476涉及的這兩種方法在實(shí)際應(yīng)用上都存在缺陷。由于化學(xué)消毒劑種類(lèi)繁多、性質(zhì)復(fù)雜，對(duì)毒性較低的化學(xué)消毒劑僅采用稀釋法往往達(dá)不到預(yù)期的去除效果，且稀釋過(guò)程還會(huì)延長(zhǎng)化學(xué)消毒劑和病毒的接觸時(shí)間。另外，利用SephadexTMLH-20凝膠去除毒性較高的化學(xué)消毒劑也存在以下兩點(diǎn)弊端：(1)去除過(guò)程耗時(shí)長(zhǎng)，至少需要2 min甚至更長(zhǎng)時(shí)間，這明顯延長(zhǎng)了病毒與化學(xué)消毒劑的接觸時(shí)間；(2)適用化學(xué)消毒劑的范圍較小，僅適用于少數(shù)的化學(xué)消毒劑，對(duì)大部分的化學(xué)消毒劑都不適用。鑒于以上問(wèn)題，有學(xué)者建議采用中和稀釋法去除低毒性的化學(xué)消毒劑，即先用中和劑中和，再用稀釋法進(jìn)行連續(xù)稀釋，即可實(shí)現(xiàn)殘留化學(xué)消毒劑的有效去除[19]。此外，法國(guó)學(xué)者介紹了兩種新型凝膠SephadexTMG-10和SephadexTMG-25在去除高毒性化學(xué)消毒劑上的應(yīng)用，這兩種凝膠相比SephadexTMLH-20凝膠具有明顯優(yōu)勢(shì)，不僅適用于絕大多數(shù)的化學(xué)消毒劑，而且去除過(guò)程僅需1 min，另外，使用成本也較低[20]。

標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476在殘留化學(xué)消毒劑去除上僅涉及兩種物理方法，且這兩種方法在使用上均存在缺陷。因此，應(yīng)對(duì)標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476的該部分內(nèi)容進(jìn)行補(bǔ)充和完善，在兼顧物理方法和化學(xué)方法的同時(shí)，還應(yīng)考慮兩種新型凝膠SephadexTMG-10和SephadexTMG-25的應(yīng)用。

3.4對(duì)照和對(duì)比實(shí)驗(yàn)的設(shè)置分析

為了試驗(yàn)結(jié)果的可靠性和真實(shí)性，也為了便于對(duì)意外結(jié)果的分析，在試驗(yàn)過(guò)程中需設(shè)置多組對(duì)照和對(duì)比試驗(yàn)。就化學(xué)消毒劑殺病毒定量懸浮試驗(yàn)來(lái)說(shuō)，需設(shè)置的對(duì)照實(shí)驗(yàn)包括評(píng)估化學(xué)消毒劑殺病毒活性的病毒對(duì)照實(shí)驗(yàn)、評(píng)估干擾物對(duì)病毒感染性影響的實(shí)驗(yàn)、評(píng)估干擾物對(duì)細(xì)胞影響的實(shí)驗(yàn)、評(píng)估化學(xué)消毒劑對(duì)細(xì)胞毒性的實(shí)驗(yàn)、評(píng)估稀釋過(guò)程對(duì)病毒感染性影響的實(shí)驗(yàn)及甲醛對(duì)照實(shí)驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476雖在部分章節(jié)零星地提到了對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置，但缺少對(duì)這些對(duì)照進(jìn)行系統(tǒng)性的歸納，且描述也不夠詳盡和全面，使標(biāo)準(zhǔn)的使用者對(duì)需要設(shè)置哪些對(duì)照實(shí)驗(yàn)及如何設(shè)置沒(méi)有一個(gè)很清晰的理解。因此，應(yīng)考慮在標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476 內(nèi)容上設(shè)立一個(gè)單獨(dú)章節(jié)，對(duì)所需的對(duì)照實(shí)驗(yàn)進(jìn)行系統(tǒng)條理的歸納和總結(jié)，并對(duì)設(shè)置方法做詳細(xì)的說(shuō)明，使標(biāo)準(zhǔn)的使用者能夠快速準(zhǔn)確地理解并掌握對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置方法。

3.5試驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算分析

標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476要求，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行計(jì)算時(shí)，只需計(jì)算出未經(jīng)化學(xué)消毒劑處理的病毒陽(yáng)性對(duì)照的滴度對(duì)數(shù)值(logN0)和反應(yīng)混合物在各接觸時(shí)間點(diǎn)的病毒滴度的對(duì)數(shù)值(logNx)，根據(jù)兩者的差值(logN0- logNx)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析和判斷。如果該差值不低于4說(shuō)明試驗(yàn)化學(xué)消毒劑對(duì)試驗(yàn)病毒具有殺滅活性，該化學(xué)消毒劑實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)合格；反之則說(shuō)明試驗(yàn)化學(xué)消毒劑對(duì)試驗(yàn)病毒不具有殺滅活性，該化學(xué)消毒劑實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)不合格。但是，由于每次試驗(yàn)存在隨機(jī)誤差，僅計(jì)算病毒滴度的對(duì)數(shù)值是不夠的。研究者越來(lái)越傾向于對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果置信區(qū)間的計(jì)算[21]?；谥眯艆^(qū)間的結(jié)果分析能夠真正地反映化學(xué)消毒劑實(shí)際殺病毒活性的不確定度，使試驗(yàn)結(jié)果更加科學(xué)、嚴(yán)謹(jǐn)、可信。標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算要求較簡(jiǎn)單，不夠科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)。因此，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476該部分內(nèi)容進(jìn)行補(bǔ)充和完善時(shí)，應(yīng)要求每次試驗(yàn)不僅需計(jì)算出病毒的滴度值，還需對(duì)結(jié)果進(jìn)行95 %置信區(qū)間的計(jì)算。

4對(duì)我國(guó)相關(guān)生物安全工作的啟示與建議

根據(jù)以上研究，針對(duì)我國(guó)相關(guān)的生物安全工作，給出以下建議：(1)重視生物安全實(shí)驗(yàn)室消毒滅菌技術(shù)方法標(biāo)準(zhǔn)和消毒滅菌效果評(píng)價(jià)方法標(biāo)準(zhǔn)的制訂，完善生物安全實(shí)驗(yàn)室消毒滅菌方法及評(píng)價(jià)體系。不僅需要制定針對(duì)不同危險(xiǎn)等級(jí)病毒的多種消毒滅菌方法，還需考慮空氣、管道、儀器設(shè)備、防護(hù)服等被病毒污染的介質(zhì)的消毒滅菌的特殊要求。建立健全消毒滅菌效果評(píng)價(jià)方法體系，指導(dǎo)化學(xué)消毒劑科學(xué)、合理、安全的使用，規(guī)范消毒滅菌方法的正確實(shí)施。此外，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員消毒滅菌方法技術(shù)的培訓(xùn)和指導(dǎo)，增強(qiáng)工作人員的安全防范意識(shí)，提高個(gè)人的安全防護(hù)知識(shí)水平和突發(fā)事故處理技能。管理者應(yīng)不斷完善實(shí)驗(yàn)室生物安全防范措施，強(qiáng)化生物安全管理能力，提高生物安全管理水平。(2)加強(qiáng)頂層設(shè)計(jì)，統(tǒng)籌規(guī)劃和協(xié)調(diào)，重視建立生物安全技術(shù)的研發(fā)體系，提高我國(guó)生物安全技術(shù)的研發(fā)水平和生物安全產(chǎn)品的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)力。首先應(yīng)加強(qiáng)生物安全領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究，包括病毒基本性質(zhì)和傳播致病機(jī)制的研究、環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)的起因和性質(zhì)研究、風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和風(fēng)險(xiǎn)管理的技術(shù)研究、實(shí)驗(yàn)室安全操作的技術(shù)研究、病原微生物專用檢測(cè)技術(shù)及專用檢測(cè)設(shè)備的研究等。此外，還應(yīng)重視對(duì)高等級(jí)生物安全技術(shù)的研究，包括高致病性病原體隔離與防護(hù)技術(shù)的研究，比如結(jié)構(gòu)氣密性、風(fēng)量控制、差壓控制等技術(shù)的研究；化學(xué)淋浴消毒和連續(xù)消毒等新型消毒方法及消毒效果評(píng)價(jià)的技術(shù)研究；正壓防護(hù)服、呼吸防護(hù)裝置等高等級(jí)生物防護(hù)裝備系統(tǒng)的研究等。(3)加強(qiáng)生物安全的國(guó)際合作與交流，了解世界生物安全的發(fā)展動(dòng)態(tài)和趨勢(shì)，吸取國(guó)際生物安全事故的慘痛教訓(xùn)，吸收和引進(jìn)國(guó)際先進(jìn)的生物安全技術(shù)和方法。學(xué)習(xí)和借鑒國(guó)外在管理、監(jiān)測(cè)、評(píng)估等方面的成功經(jīng)驗(yàn)，提升我國(guó)的生物安全管理能力。加強(qiáng)對(duì)外宣傳，樹(shù)立我國(guó)生物安全管理的良好形象，保障我國(guó)生物技術(shù)從研究開(kāi)發(fā)到生產(chǎn)應(yīng)用對(duì)外合作的廣泛開(kāi)展。根據(jù)生物安全技術(shù)發(fā)展的特點(diǎn)和趨勢(shì)，結(jié)合我國(guó)國(guó)情，規(guī)劃我國(guó)生物安全的發(fā)展戰(zhàn)略、優(yōu)先行動(dòng)和重點(diǎn)項(xiàng)目，以完善我國(guó)的生物安全體系和提升我國(guó)生物安全的國(guó)際化水平。

5總結(jié)

本研究針對(duì)法國(guó)歐盟標(biāo)準(zhǔn)NF EN 14476內(nèi)容的改進(jìn)和完善開(kāi)展了分析和研究工作，根據(jù)研究結(jié)果，對(duì)標(biāo)準(zhǔn)的內(nèi)容給出以下幾點(diǎn)優(yōu)化建議：

(1)原標(biāo)準(zhǔn)中試驗(yàn)?zāi)Ｊ讲《镜姆N類(lèi)可由3種(脊灰病毒、腺病毒和牛細(xì)小病毒)增加至6種(脊灰病毒、腺病毒、痘苗病毒、牛病毒性腹瀉病毒、猴多瘤病毒和細(xì)小病毒)，以滿足病毒對(duì)化學(xué)消毒劑抵抗力多樣性的試驗(yàn)需求；

(2)在原標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，可增加實(shí)驗(yàn)危險(xiǎn)病毒的替代病毒選項(xiàng)，增加試驗(yàn)方法的靈活性、適應(yīng)性、實(shí)用性和安全性；

(3)原標(biāo)準(zhǔn)提到的殘留化學(xué)消毒劑去除方法已經(jīng)不太適用于當(dāng)前復(fù)雜多變的病毒環(huán)境和日益增多的各式化學(xué)消毒劑制品，建議在原標(biāo)準(zhǔn)單純物理稀釋法的基礎(chǔ)上增加化學(xué)中和方法，并考慮兩種方法的融合交叉使用。此外，建議使用兩種新型凝膠技術(shù)SephadexTMG-10和SephadexTMG-25對(duì)殘留的高毒性化學(xué)消毒劑進(jìn)行去除；

(4)在原標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上可增加全面且詳細(xì)的對(duì)照和對(duì)比實(shí)驗(yàn)信息，如評(píng)估化學(xué)消毒劑殺病毒活性的對(duì)照實(shí)驗(yàn)、評(píng)估干擾物對(duì)病毒感染性影響的對(duì)照實(shí)驗(yàn)、評(píng)估干擾物對(duì)細(xì)胞影響的對(duì)照實(shí)驗(yàn)、評(píng)估化學(xué)消毒劑對(duì)細(xì)胞毒性的對(duì)照實(shí)驗(yàn)、評(píng)估稀釋過(guò)程對(duì)病毒影響的對(duì)照實(shí)驗(yàn)及證明試驗(yàn)病毒適用性的甲醛對(duì)照實(shí)驗(yàn)，以增強(qiáng)試驗(yàn)體系的科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性；

(5)在試驗(yàn)結(jié)果的計(jì)算和分析方面，建議在原標(biāo)準(zhǔn)方法的基礎(chǔ)上增加對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的95 %置信區(qū)間的計(jì)算，以提高結(jié)果分析的準(zhǔn)確性和科學(xué)性。

上述的分析研究結(jié)果將為我國(guó)制定符合國(guó)家發(fā)展?fàn)顩r、先進(jìn)的消毒滅菌方法標(biāo)準(zhǔn)提供借鑒和參考，以促進(jìn)我國(guó)的生物安全標(biāo)準(zhǔn)化水平，幫助我國(guó)生物安全技術(shù)和管理水平的進(jìn)一步提高。因此，我國(guó)不僅要加強(qiáng)生物安全相關(guān)技術(shù)的研發(fā)和應(yīng)用布局，也應(yīng)及時(shí)對(duì)現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行內(nèi)容更新和完善，將最新的研究成果加以應(yīng)用和推廣，滿足我國(guó)當(dāng)前生物安全技術(shù)的需求。

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〔修回日期〕2015-12-24

Transformation and standardization of the inactivation test method for virus suspension in biosafety laboratory

DENG A-mei1, WEI Feng1, WU Jia2, MA Hai-xia2, YUAN Zhi-ming2

(1. Wuhan Library, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071, China;2. Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071)

【Abstract】Chemical disinfectants are generally used for virus inactivation and environment disinfection in biosafety laboratory, and the efficacy and evaluation of the disinfection are critical to ensure the laboratory biosafety. However, there is a current lack of applied standard to evaluate the virucidal efficacy of chemical disinfectants in our country. In this paper, a European Union standard “Method and Requirements of Virucidal Quantitative Suspension Test Method for Chemical Disinfectants Used in Human Medicine” was analyzed and a standard transformation scheme has been proposed. It is suggested that the model viruses should be increased from 3 to 6, including the surrogate viruses to substitute highly pathogenic viruses, and that the method to remove the residual chemical disinfectant and the calculation of 95% confidence interval should be incorporated into the standard. The suggestion will improve the scientific and operational standards related to disinfection and sterilization in biosafety laboratory in China.

【Key words】Virus inactivation; Chemical disinfectant; Biosafety; Standard; Quantitative suspension test; Virucidal effect evaluation

doi:10.3969.j.issn.1671-7856. 2016.02.006

【中圖分類(lèi)號(hào)】R-33

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1671-7856(2016) 02-0027-06

[作者簡(jiǎn)介]鄧阿妹(1981-)，女，博士，助理研究員，主要研究方向：標(biāo)準(zhǔn)情報(bào)的研究與分析。 E-mail: dengam@mail.whlib.ac.cn。[通訊作者]袁志明，E-mail: yzm@pentium.whiov.ac.cn。

[基金項(xiàng)目]“十二五”國(guó)家衛(wèi)生行業(yè)專項(xiàng)項(xiàng)目(2012ZX10004403)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(71103178)；中國(guó)科學(xué)院優(yōu)秀人才擇優(yōu)支持項(xiàng)目；武漢市科技項(xiàng)目“武漢市新發(fā)傳染病與生物安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室”(201261638501)。

“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)論壇”專題