麥慶云，黃可珺

(中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心，廣州　510080)

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高齡婦女卵母細(xì)胞發(fā)育和取卵技巧現(xiàn)況

麥慶云，黃可珺

(中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心，廣州510080)

我國(guó)高齡婦女群體對(duì)輔助生殖技術(shù)的需求極大。隨著年齡增長(zhǎng)，女性生殖功能衰退，對(duì)高齡婦女應(yīng)用輔助生殖技術(shù)時(shí)亟需相應(yīng)的調(diào)整。目前對(duì)高齡女性生殖功能的研究在生殖醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)界仍為焦點(diǎn)話(huà)題之一，眾多科研工作者的成果不斷為我們揭示高齡女性生殖系統(tǒng)的變化機(jī)制及臨床應(yīng)對(duì)措施。本文通過(guò)對(duì)現(xiàn)有成果的摘要介紹，簡(jiǎn)述高齡婦女卵母細(xì)胞發(fā)育時(shí)的特點(diǎn)，且通過(guò)調(diào)整扳機(jī)(trigger)及取卵時(shí)機(jī)，臨床醫(yī)生有望在高齡婦女的輔助生殖周期中幫助患者獲得更佳結(jié)局。

高齡婦女；卵母細(xì)胞發(fā)育；扳機(jī)；取卵

(JReprodMed2016，25(10)：884-887)

隨著我國(guó)計(jì)劃生育政策的改革，越來(lái)越多的家庭寄望于通過(guò)輔助生殖技術(shù)獲得子女，其中不乏四十歲以上甚至五十歲左右的高齡夫婦。而在已有的研究中，隨著年齡增長(zhǎng)，女性卵巢儲(chǔ)備功能下降，體外受精-胚胎移植(IVF-ET，in vitro fertilization-embryo transfer)技術(shù)中獲卵數(shù)、卵母細(xì)胞質(zhì)量均下降，因此種植率和妊娠率均逐步下降[1]，而自發(fā)流產(chǎn)率則趨向升高[2]，43歲以上婦女的IVF妊娠率更是急劇下滑[3]。為了更好理解高齡婦女卵泡發(fā)育、成熟特點(diǎn)從而設(shè)計(jì)個(gè)性化的扳機(jī)(trigger)、取卵方案，幫助高齡婦女IVF周期中獲得更多、更優(yōu)質(zhì)的卵母細(xì)胞、進(jìn)而獲得更佳的周期結(jié)局，在此對(duì)上述問(wèn)題作一綜述。

一、高齡婦女卵泡發(fā)育特點(diǎn)

每一位女性的一生中可能有400枚左右的卵泡被募集而通過(guò)減數(shù)分裂形成卵母細(xì)胞，而這個(gè)過(guò)程受到下丘腦-垂體-卵巢軸的調(diào)控。抗苗勒管激素(AMH)是目前評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能的重要指標(biāo)，其由竇前卵泡的顆粒細(xì)胞分泌，而抑制素(inhibin) B則由月經(jīng)周期中的竇卵泡分泌[4]。隨著年齡增長(zhǎng)，AMH及inhibin B水平降低，軸中負(fù)向反饋減弱導(dǎo)致較高的FSH水平[5]，由此45歲以上婦女一個(gè)周期中出現(xiàn)一枚以上主導(dǎo)卵泡的幾率增加，但每一枚卵泡是否能發(fā)揮應(yīng)有的作用則不得而知[6]。

育齡期婦女每個(gè)排卵周期中常有2～3個(gè)竇卵泡發(fā)育波進(jìn)入募集隊(duì)列，通常為最后一個(gè)發(fā)育波成為有排卵的主導(dǎo)發(fā)育波，而其他波群無(wú)排卵發(fā)生[7]。Hale等[8]2013年的研究將黃體期出現(xiàn)不典型的雌二醇分泌波動(dòng)稱(chēng)為黃體期卵泡主導(dǎo)化發(fā)育，研究中半數(shù)出現(xiàn)黃體期卵泡主導(dǎo)化發(fā)育的婦女在月經(jīng)第2至5日即出現(xiàn)排卵(以LH峰及孕酮的顯著升高為準(zhǔn))。Vanden Brink等[9]的研究中45歲以上婦女95%出現(xiàn)了卵泡期主導(dǎo)卵泡(有排卵)，43%出現(xiàn)了黃體期主導(dǎo)卵泡(無(wú)排卵)，還有1%出現(xiàn)了有排卵的黃體期主導(dǎo)卵泡(接下來(lái)的一周期沒(méi)有出現(xiàn)卵泡期主導(dǎo)隊(duì)列)，同時(shí)延擱期(即月經(jīng)第20日或排卵后第20日仍無(wú)6 mm以上卵泡形成)僅在10%的45歲以上婦女中出現(xiàn)。黃體期主導(dǎo)卵泡的出現(xiàn)率雖然在各年齡組中沒(méi)有出現(xiàn)顯著差異，但生長(zhǎng)模式不同：45歲以下女性黃體期主導(dǎo)隊(duì)列中的主導(dǎo)卵泡生長(zhǎng)到合適的徑線(xiàn)(10～16 mm)后在黃體中期退化成為早期黃體，而45歲以上女性的黃體期主導(dǎo)卵泡出現(xiàn)更早、生長(zhǎng)徑線(xiàn)更大，可能由于卵泡中期的主導(dǎo)卵泡受到排卵前LH峰的影響而在黃體期繼續(xù)長(zhǎng)大。

二、高齡婦女卵泡顆粒細(xì)胞的特性

顆粒細(xì)胞對(duì)卵泡的發(fā)育成熟具有重要意義，其中卵丘顆粒細(xì)胞的功能尤為不可或缺。早在1984年Herlands等[10]就發(fā)現(xiàn)卵的成熟與其周?chē)掣降念w粒細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)。同時(shí)，Mehlmann等[11]在2005年的研究中，通過(guò)對(duì)體外卵母細(xì)胞成熟模型的觀察發(fā)現(xiàn)竇卵泡中的卵在移除卵丘細(xì)胞后可自發(fā)重啟并完成減數(shù)分裂形成卵母細(xì)胞，提示卵丘顆粒細(xì)胞控制卵母細(xì)胞的核成熟。卵母細(xì)胞被募集前在減數(shù)分裂I期的停留也有賴(lài)于顆粒細(xì)胞合成的產(chǎn)物通過(guò)自分泌及旁分泌對(duì)其的作用。為闡明顆粒細(xì)胞對(duì)卵母細(xì)胞成熟影響的機(jī)制，Dierich等[12]在1998年的研究中發(fā)現(xiàn)敲除小鼠顆粒細(xì)胞中的卵泡刺激素受體(FSHR)基因后可導(dǎo)致因竇卵泡缺乏所致的不孕癥。類(lèi)似的研究中，由卵巢早老所致的不孕癥也出現(xiàn)在芳香化酶(Cyp19a1)[13]、雌激素受體β(ESR2)[14]、雄激素受體(AR)[15]、胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF1)[16]等基因敲除的小鼠。

Skiadas等[17]在2012年的研究提示提早黃素化出現(xiàn)在孕激素水平提前開(kāi)始升高后，對(duì)卵母細(xì)胞的受精率及種植率均有負(fù)面影響，并使基礎(chǔ)FSH水平升高，藥物使用量增加。作者猜測(cè)此與卵巢中LH受體的表達(dá)隨年齡增加而增強(qiáng)有關(guān)。而在Wu等[3]的一項(xiàng)研究中，與年輕的卵母細(xì)胞捐贈(zèng)者及中年的不孕癥婦女相比，43歲以上的不孕癥婦女顆粒細(xì)胞中FSHR的表達(dá)顯著降低，而黃體生成素受體(LHCGR)的表達(dá)則顯著增高，ESR2、孕激素受體(PGR)及AR的表達(dá)則沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。類(lèi)固醇激素合成活性方面，高齡組婦女顆粒細(xì)胞中芳香化酶及17羥基類(lèi)固醇脫氫酶的表達(dá)降低，而類(lèi)固醇激素合成快速調(diào)節(jié)蛋白則沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。研究的結(jié)果提示高齡婦女的顆粒細(xì)胞常呈現(xiàn)提早黃素化的臨床表現(xiàn)，證實(shí)了前者的猜想。

三、扳機(jī)時(shí)機(jī)選擇與方式

臨床上常通過(guò)超聲下卵泡徑線(xiàn)及血清激素水平判斷扳機(jī)時(shí)間，而各中心采用的標(biāo)準(zhǔn)可能存在差異。Singh等[18]描述其中心采用的標(biāo)準(zhǔn)為：在排除OHSS風(fēng)險(xiǎn)和卵巢低反應(yīng)患者的情況下，三枚以上卵泡平均徑線(xiàn)達(dá)到18 mm，進(jìn)行扳機(jī)，并在36～38 h后進(jìn)行取卵。而目前我中心采用的標(biāo)準(zhǔn)為當(dāng)有一枚卵泡平均直徑達(dá)到18 mm或兩枚達(dá)到17 mm時(shí)進(jìn)行扳機(jī)。目前，臨床上扳機(jī)時(shí)間并未根據(jù)患者年齡進(jìn)行制定，通常在第一周期采用標(biāo)準(zhǔn)方案，在可能的隨后周期中根據(jù)前次方案的取卵效益由臨床醫(yī)師進(jìn)行評(píng)估制定。

2008年Rosen等[19]的一份前瞻性研究中顯示，平均徑線(xiàn)>18 mm的卵泡來(lái)源的卵母細(xì)胞成熟率、受精率及優(yōu)質(zhì)胚胎率較小卵泡更佳，并且該指標(biāo)與卵泡平均直徑成正相關(guān)。但在對(duì)研究中平均徑線(xiàn)大于23 mm的卵泡的觀察中發(fā)現(xiàn)其平均碎片數(shù)顯著高于其他組別。出現(xiàn)此情況的原因可能為扳機(jī)時(shí)間過(guò)早，顆粒細(xì)胞LH受體數(shù)量及敏感性不足，卵丘復(fù)合體緊貼卵泡壁難以脫落，可使卵母細(xì)胞回收率低，同時(shí)不成熟卵比例增高。扳機(jī)時(shí)間過(guò)遲，可能使卵泡在內(nèi)源性LH峰作用下黃素化，亦使卵母細(xì)胞回收率低，同時(shí)過(guò)熟卵比例增高。Wu等[3]的研究中將43歲以上女性分為常規(guī)取卵組及提早取卵組，常規(guī)取卵組仍按照常規(guī)扳機(jī)的時(shí)間進(jìn)行扳機(jī)，而提早取卵組則在最大主導(dǎo)卵泡平均徑線(xiàn)達(dá)到16 mm時(shí)即進(jìn)行扳機(jī)，結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)提早取卵組中閉鎖卵泡率顯著下降，雖然未熟卵比例上升，但每周期優(yōu)質(zhì)胚胎率上升，同時(shí)每周期臨床妊娠率、每移植胚胎臨床妊娠率、胚胎種植率等均顯示提早取卵組相較于常規(guī)取卵組存在優(yōu)勢(shì)。雖然該研究結(jié)論仍需要大樣本多中心雙盲實(shí)驗(yàn)的輔證，但上述研究和高齡婦女卵泡發(fā)育特點(diǎn)均提示：在高齡婦女中將扳機(jī)時(shí)機(jī)適當(dāng)前移可能能幫助獲得質(zhì)量更優(yōu)的卵母細(xì)胞，改善IVF-ET周期結(jié)局。

目前常用的扳機(jī)方式有HCG扳機(jī)，激動(dòng)劑扳機(jī)和雙扳機(jī)等，其中臨床最常用的為HCG扳機(jī)。激動(dòng)劑扳機(jī)是臨床降低OHSS風(fēng)險(xiǎn)的最有效方法之一，但由于激動(dòng)劑對(duì)黃體功能的抑制常導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性下降，從而出現(xiàn)更低的種植率、更高的流產(chǎn)率，因此使用激動(dòng)劑扳機(jī)需要加強(qiáng)黃體支持，以獲得滿(mǎn)意的激素水平及胚胎種植率[20]。而雙扳機(jī)通過(guò)結(jié)合應(yīng)用HCG及GnRH-a進(jìn)行扳機(jī)，在降低OHSS風(fēng)險(xiǎn)的同時(shí)獲得了更令人滿(mǎn)意的種植率、妊娠率及活產(chǎn)率[21]。

Nelson[22]建議通過(guò)竇卵泡計(jì)數(shù)(AFC，antral follicle count)及血清AMH水平對(duì)促排卵及扳機(jī)方案進(jìn)行選擇：卵巢反應(yīng)可忽略不計(jì)者(即常規(guī)扳機(jī)方案難以實(shí)現(xiàn)者)即：AFC<2個(gè)和/或AMH<1 ng/ml，推薦使用激動(dòng)劑激發(fā)方案或?qū)で舐训木栀?zèng)；AFC2～10個(gè)和/或AMH1～7 ng/ml，推薦使用激動(dòng)劑激發(fā)方案；AFC10～24個(gè)和/或AMH7～20 ng/ml，推薦使用長(zhǎng)效激動(dòng)劑降調(diào)節(jié)方案及HCG扳機(jī)；AFC24～40個(gè)和/或AMH<20～40 ng/ml，推薦使用拮抗劑方案及HCG扳機(jī)；AFC>40個(gè)和/或AMH>40 ng/ml，推薦使用拮抗劑方案及激動(dòng)劑扳機(jī)。

四、高齡婦女取卵技巧

在扳機(jī)后模擬的LH峰作用下，排卵過(guò)程被啟動(dòng)，卵母細(xì)胞完成減數(shù)分裂進(jìn)入MⅡ期，卵丘復(fù)合物脫離卵泡壁而排出，剩余的顆粒細(xì)胞則開(kāi)始黃素化[23]。目前臨床上使用雙腔取卵針在取卵過(guò)程中對(duì)卵泡腔進(jìn)行沖洗以求增加卵母細(xì)胞回收的技術(shù)被廣泛使用。但在李欣等[24]2015年的臨床研究中發(fā)現(xiàn)，研究中回收卵母細(xì)胞數(shù)目理想的集中在沖洗0～2次，且不僅無(wú)限增加沖洗次數(shù)對(duì)增加卵母細(xì)胞回收數(shù)目沒(méi)有意義，是否使用雙腔取卵針在取卵術(shù)中進(jìn)行卵泡沖洗對(duì)卵母細(xì)胞回收數(shù)目的影響亦不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。吳乙璇等[25]2010年的回顧性研究顯示，在研究中行輔助生殖技術(shù)導(dǎo)致取卵失敗的原因集中在卵巢發(fā)育不良、HCG作用時(shí)間不足、卵母細(xì)胞發(fā)育障礙上，因此，臨床上應(yīng)將重心更多放在促排過(guò)程中，取卵術(shù)中的技巧仍然應(yīng)注重在穿刺過(guò)程中做到以盡量少的操作，穿刺到盡量多的卵泡，以求減少對(duì)卵巢皮質(zhì)的損傷。

在北美、歐洲的生殖中心，高齡婦女的輔助生殖技術(shù)應(yīng)用受到嚴(yán)格的限制，比利時(shí)甚至由法律規(guī)定45歲以上婦女不得進(jìn)行取卵手術(shù)，48歲以上婦女不得進(jìn)行胚胎移植手術(shù)。但在我國(guó)尚未有法律法規(guī)在年齡上限制輔助生殖技術(shù)的應(yīng)用，同時(shí)由于我國(guó)的特殊國(guó)情，一段時(shí)間內(nèi)我國(guó)高齡婦女對(duì)輔助生殖技術(shù)的需求仍將居高不下。因此，在我國(guó)開(kāi)展生殖中心的工作時(shí)更需要對(duì)高齡婦女的生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)加強(qiáng)理解，以便讓這項(xiàng)技術(shù)更好地為廣大求子心切的家庭服務(wù)。

[1]van Noord-Zaadstra BM，Looman CW，Alsbach H，et al. Delaying childbearing：effect of age on fecundity and outcome of pregnancy[J]. BMJ，1991，302：1361-1365.

[2]Grande M，Borrell A，Garcia-Posada R，et al. The effect of maternal age on chromosomal anomaly rate and spectrum in recurrent[J]. Hum Reprod，2012，27：3109-3117.

[3]Wu YG，Barad DH，Kushnir VA，et al. Aging-related premature luteinization of granulosa cells is avoided by early[J]. J Endocrinol，2015，22：167-180.

[4]Andersen CY，Schmidt KT，Kristensen SG，et al. Concentrations of AMH and inhibin-B in relation to follicular diameter in normal[J]. 2010，25：1282-1287.

[5]Robertson DM，Hale GE，F(xiàn)raser IS，et al. A proposed classification system for menstrual cycles in the menopause transition[J]. Menopause，2008，15：1139-1144.

[6]Santoro N，Isaac B，Neal-Perry G，et al. Impaired folliculogenesis and ovulation in older reproductive aged women[J]. J Clin Endocr Metab，88：5502-5509.

[7]Brink HV，Chizen D，Hale G，et al. Age-related changes in major ovarian follicular wave dynamics during the human menstrual cycle[J]. Menopause，2013，20：1243-1254.

[8]Hale GE，Robertson DM，Burger HG. The perimenopausal woman：endocrinology and management[J]. J Steroid Biochem Mol Biol，2014，142：121-131.

[9]Vanden Brink H，Robertson DM，Lim H，et al. Associations between antral ovarian follicle dynamics and hormone production throughout the menstrual cycle as women age[J]. J Clin Endocrinol Metab，2015，100：4553-4562.

[10]Herlands RL，Schultz RM. Regulation of mouse oocyte growth：probable nutritional role for intercellular[J]. J Exp Zool，1984，229：317-325.

[11]Mehlmann LM.Stops and starts in mammalian oocytes：recent advances in understanding the regulation of meiotic arrest and oocyte maturation[J]. Reproduction，2005，130：791-799.

[12]Dierich A，Sairam MR，Monaco L，et al. Impairing follicle-stimulating hormone (FSH) signaling in vivo：targeted disruption of the FSH receptor leads tp aberrant gametogenesis and hormonal imbalance[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，1998，95：13612-13617.

[13]Fisher CR，Graves KH，Parlow AF，et al. Characterization of mice deficient in aromatase (ArKO) because of targeted[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，1998，95：6965-6970.

[14]Couse JF，Yates MM，Deroo BJ，et al. Estrogen receptor-beta is critical to granulosa cell differentiation and the ovulatory response to gonadotropins[J]. Endocrinology，2005，146：3247-3262.

[15]Sen A，Hammes SR. Granulosa cell-specific androgen receptors are critical regulators of ovarian[J]. Mol Endocrinol，2010，24：1393-1403.

[16]Baker J，Hardy MP，Zhou J，et al. Effects of an Igf1 gene null mutation on mouse reproduction[J]. Mol Endocrinol，1996，10：903-918.

[17]Skiadas CC，Duan S，Correll M，et al. Ovarian reserve status in young women is associated with altered gene expression[J]. Mol Hum Reprod，2012，18：362-371.

[18]Singh N，Bahadur A，Mittal S，et al. Predictive value of endometrial thickness，pattern and sub-endometrial blood flows on the day of hCG by 2D doppler in in-vitro fertilization cycles：A prospective clinical study from a tertiary care unit[J]. J Hum Reprod Sci，2011，4：29-33.

[19]Rosen MP，Shen S，Dobson AT，et al. A quantitative assessment of follicle size on oocyte developmental competence[J]. Fertil Steril，2008，90：684-690.

[20]Humaidan P，Polyzos NP，Alsbjerg B，et al. GnRHa trigger and individualized luteal phase hCG support according to ovarian[J]. Hum Reprod，2013，28：2511-2521.

[21]Griffin D，Benadiva C，Kummer N，et al.Dual trigger of oocyte maturation with gonadotropin-releasing hormone agonist and low-dose human chorionic gonadotropin to optimize live birth rates in high responders[J]. Fertil Steril，2012，97：1316-1320.

[22]Nelson SM. Biomarkers of ovarian response：current and future applications[J].Fertil Steril，2013，99：963-969.

[23]馬文紅，韋繼紅. 自然周期黃體生成激素峰誘發(fā)卵子成熟的分子機(jī)制[J]. 國(guó)際生殖健康/計(jì)劃生育雜志，2015，34：333-338.

[24]李欣，陳娟，徐鴻毅，等. 經(jīng)陰道穿刺取卵 (OPU) 術(shù)中卵泡沖洗次數(shù)與卵母細(xì)胞回收情況的分析[J]. 生殖與避孕，2015，35：575-578.

[25]吳乙璇，朱桂金. 輔助生殖技術(shù)中取卵失敗的研究[J]. 生殖與避孕，2010，30：92-97.

[編輯：谷炤]

Oocyte development and retrieval in advanced-age women

MAI Qing-yun，HUANG Ke-jun

ReproductiveMedicalCenter,ThefirstaffiliatedhospitalofSun-yet-senUniversity，Guangzhou510080

Artificial reproductive technology is widely demanded among the advanced-age women in China. It’s well known that female reproductive system suffers deficiency along with age，thus the ART needs to be adjusted for women in their late reproductive age. Studies on aging of female reproductive system are still under spot light，and the research results are exploring the aging mechanism and treatment strategy. The purpose of this review is to summarize these studies，brief characteristics of oocytes development in aged women，and achieve better result in ART cycles by adjusting the time of trigger and oocyte retrieval.

Advanced-age women；Oocyte development；Trigger；Oocyte retrieval

10.3969/j.issn.1004-3845.2016.10.004

2016-07-20；

2016-08-11

麥慶云，女，廣東人，博士，教授，生殖醫(yī)學(xué)專(zhuān)業(yè).