余劭婷，秦金橋，關國平，王璐

東華大學紡織學院，紡織面料技術教育部重點實驗室(上海，201620)

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絲素纖維表面改性提高細胞粘附性能

余劭婷，秦金橋，關國平，王璐

東華大學紡織學院，紡織面料技術教育部重點實驗室(上海，201620)

絲素纖維因其良好的力學性能和生物相容性， 在生物材料方面應用廣泛， 如醫(yī)用縫合線、 血管支架等。絲素纖維材料作為血管移植物進入人體后， 細胞粘附往往不能達到預期， 從而引起血栓， 造成失效。該文綜述了影響生物材料表面細胞粘附性的因素、 提高絲素纖維材料表面細胞粘附性的改性方法以及細胞在生物材料表面粘附性能的評價方法。期望為進一步拓展絲素纖維在生物材料領域的應用提供參考。

絲素纖維； 細胞粘附； 表面改性

0　引言

絲素纖維是指天然蠶絲經(jīng)脫膠得到的蛋白質(zhì)纖維， 因其良好的力學性能和生物相容性[1]， 用于外科手術縫合線已經(jīng)有很長的歷史[2]。隨著再生絲素蛋白在生物材料及組織工程支架方面的應用日益廣泛[3-5]， 絲素纖維生物材料也越來越引起學者們的興趣[6-8]。然而， 有研究表明， 絲素纖維材料作為血管移植物進入人體后， 其細胞粘附性能尚不能達到預期[9-10]。因此， 本文分析了影響生物材料表面細胞粘附的因素， 綜述了提高絲素纖維材料表面細胞粘附性的方法及評價生物材料表面細胞粘附性能的方法。期望為進一步拓展絲素纖維在生物材料領域的應用提供參考。

1　影響細胞粘附的因素

在移植用生物材料的研究中， 材料表面理化性質(zhì)是影響細胞粘附能力的重要因素， 通過改變生物材料表面理化性能可以促進細胞粘附[4]。

1.1材料表面形貌結(jié)構(gòu)

材料表面形貌結(jié)構(gòu)(如多孔結(jié)構(gòu)[6]、 納米結(jié)構(gòu)、 溝槽結(jié)構(gòu)[11])的改變會對所粘附細胞的形態(tài)、 材料的比表面積等產(chǎn)生影響， 從而影響細胞的粘附延展、 遷移等行為。

此外， 許多研究發(fā)現(xiàn)[9，12]， 粗糙的材料表面的粘附性能要優(yōu)于光滑的材料表面。表面粗糙度差異也會影響細胞粘附。粗糙度高的表面比表面積大， 可以增大細胞與材料的接觸面積。

1.2材料的親疏水性

通常情況下， 親水性材料表面更適合細胞的粘附與生長[8]。Wei J等[13]對六甲基二硅醚材料進行氧氣等離子體處理， 在樣品表面種植纖維原細胞， 結(jié)果表明， 親水性大的表面， 細胞初期階段粘附的越多。

然而， 當材料親水性過好時， 往往不利于細胞的粘附[14]。因此， 探究材料表面最適宜的親疏水平衡狀態(tài)， 成為眾多學者研究的目標。

1.3材料的表面電荷性能

在正常生理酸堿度下， 脊椎動物細胞表面分布著負電荷。通過在材料表面固定帶正電基團物質(zhì)， 如氨基酸[10]， 可以提高材料的表面正電荷濃度， 影響粘附細胞的數(shù)量和細胞的粘附力[15]。針對不同種類的細胞， 材料表面電能對其粘附性能的影響有所不同， 即存在細胞特異性[16]。

1.4材料表面大分子基團

生物材料表面的化學功能團對細胞的粘附有著很重要的影響。一般認為， 芳香族等剛性基團不利于細胞粘附， 而-COOH、 -OH、 -NH3、 -NH-及-CONH等有利于細胞的粘附[17]。有學者發(fā)現(xiàn)了內(nèi)皮細胞在不同功能基團表面的粘附性順序：CH3>NH2>OH>COOH[18]。

多肽具有簡單的結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定的性能， 可以固定在材料表面以促進細胞的粘附與增殖。其中， RGD三肽[19]是目前最常用的促細胞粘附肽。此外糖蛋白層連蛋白YIGSR等[20]， CAG三肽[21]， 纖連蛋白類多肽REDV[22]， 多肽也普遍應用在表面修飾中， 促進細胞粘附。

2　 絲素纖維表面改性方法

2.1化學接枝及交聯(lián)

研究學者通過化學反應將特定的功能基團或大分子接枝到絲素纖維表面， 可以提高細胞的粘附性[23]。例如：Liu 等[24]將磺酸基團接枝到海綿狀絲素蛋白復合織物表面， 促進內(nèi)皮細胞的粘附和增殖。Guan等[25]將肝素和再生絲素蛋白分別接枝到絲素纖維平紋織物表面， 內(nèi)皮細胞在織物表面粘附性均得到了提高。

通過交聯(lián)劑、 光、 熱作用對絲素材料進行交聯(lián)， 會對細胞粘附行為產(chǎn)生影響[26]。Wang J等[27]將絲素蛋白溶液經(jīng)聚(乙二醇)縮水甘油醚(PEG-DE)交聯(lián)后， 制備管狀支架， HUVEC和L929細胞的粘附、 生長情況得到改善。

2.2層層自組裝法

層層自組裝技術是在帶有電荷的基材表面交替吸附聚陽離子物質(zhì)和聚陰離子物質(zhì)， 可形成多層膜結(jié)構(gòu)[28-29]， 該技術方便易得， 應用廣泛。

Shen 等[30]將帶正電荷的海藻酸鈉和帶負電荷的再生絲素蛋白依次組裝到絲素纖維機織物表面。豬髂動脈內(nèi)皮細胞在自組裝后的材料表面的粘附和增殖有所提高。He J X等[31]利用層層自組裝的方法制備了一種絲素蛋白/納米纖維素晶須/殼聚糖支架， 種植人MG-63骨肉瘤細胞后發(fā)現(xiàn)， 細胞可以在支架表面粘附， 且生長良好。

2.3等離子體法

等離子可使材料表面產(chǎn)生大量自由基或引入極性基團， 從而使其表面性能得以優(yōu)化[32]。經(jīng)等離子體處理后， 絲素纖維的親水性會得到提高， 從而影響細胞粘附情況。Amornsudthiwat P等[33]用氮氣等離子體處理絲素蛋白膜。表面接觸角從70°下降到20°， 在樣品表面種植L929小鼠成纖維細胞， 發(fā)現(xiàn)細胞在絲素蛋白膜表面快速粘附， 且細胞覆蓋率高。

等離子體技術可以對絲素纖維進行接枝[34]， Dhyani等[35]利用等離子體在絲素蛋白膜表面接枝pAAc和pHEMA， 提高了材料表面的羧基和羥基含量， Hela細胞粘附、 分化、 鋪展情況得到明顯改善。

2.4 表面涂層法

表面涂層法操作簡單， 適宜于大面積的表面改性， 是一種傳統(tǒng)的表面化學修飾途徑。目前常用膠原、 脫細胞基質(zhì)[36]、 羥磷灰石[37]等物質(zhì)， 涂覆在絲素材料表面， 促進細胞生長粘附。

有學者[38]將絲素蛋白溶液涂覆在絲素基血管材料表面， 發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞能夠很好地粘附。

2.5生物工程法

生物工程法涵蓋基因工程、 細胞工程、 生物反應器工程等多個領域， 通過生物手段來定向改造材料功能。利用基因傳遞載體， 可以轉(zhuǎn)染蠶的胚胎、 絲腺細胞， 得到特異性表達的蠶絲纖維[39]。Wang等[40]和Kambe Y等[41]培育轉(zhuǎn)基因家蠶， 產(chǎn)出含細胞生長因子的蠶絲。他們的研究結(jié)果均表明， 細胞在這類轉(zhuǎn)基因蠶絲材料表面粘附狀況良好， 鋪展均勻。

眾多研究利用細胞生長因子[42]層連蛋白中的TS(8)序列和纖連蛋白的(TGRGDSPAS)(8)序列[43]。ZNF580基因[44]等物質(zhì)直接結(jié)合到， 絲素纖維或絲素材料進行生物改性， 顯著改善細胞粘附， 且得到的纖維材料具有功能持久穩(wěn)定、 無毒性的特點。

3　細胞粘附性能評價方法

目前， 研究細胞與生物材料表面間粘附性的測試方法主要分為兩類：一類是通過對粘附界面的形態(tài)觀測和計數(shù)， 來分析細胞的粘附情況； 另一類是通過施加剪切力來評估細胞的粘附力大小， 從而判斷細胞粘附情況。

3.1細胞粘附形態(tài)及數(shù)量評估

通過觀察材料表面粘附細胞的數(shù)量及形態(tài)， 可以得到最直觀的結(jié)果， 細胞粘附時的形態(tài)和融合情況也反映了細胞在材料上的粘附性能。為了探究細胞在樣品上的生長粘附情況， 常采用染色的方法對細胞進行標記， 通過顯微鏡進行觀察。如熒光染色法[45]、 MTT法[46]等。

對于結(jié)構(gòu)復雜， 不易于顯微鏡觀測的樣品， 通常會對材料進行切片處理?？稍谝欢〞r間內(nèi)保留細胞的原貌， 便于觀察和保存。在組織切片染色法中， 最基本的方法是蘇木素-伊紅(HE)染色法[47]。

此外， 通過胰蛋白酶洗脫法， 可使細胞間的蛋白質(zhì)水解， 粘附在材料表面的細胞會脫落到胰蛋白酶洗脫液中， 經(jīng)過顯微鏡觀察計數(shù)， 可計算出對應的粘附率[48]。

3.2細胞粘附力學性能評估

3.2.1細胞整體粘附力測試

細胞整體粘附力測試通過模擬細胞所處生物力學環(huán)境， 對粘附在材料表面的細胞施加剪切力來測試其粘附力大小。測試細胞在受到剪切力作用后， 余留下的細胞數(shù)量或面積等數(shù)值， 此類方法主要包括：流室法和離心法。

流室(Flow chamber, FC)系統(tǒng)[49]可以在體外模擬血管內(nèi)血液的流動， 記錄剪切力對細胞的作用。根據(jù)流室的形狀不同， 可分為平行板流室、 圓柱形管狀流室和錐形流室[50]等。Yen Kochung 等[51]將人臍靜脈內(nèi)皮細胞種植在角蛋白/絲素蛋白膜表面， 利用動態(tài)流動室進行加載， 評估細胞粘附率。

離心法[52]利用細胞離心力與旋轉(zhuǎn)角速度的關系， 根據(jù)旋轉(zhuǎn)后圓盤上未脫落的細胞斑的平均半徑， 得到細胞的最大粘附力。Kaplan D S等[53]通過離心法測定了軟骨細胞及L929細胞在培養(yǎng)板底部的粘附力大小。

3.2.2個體細胞粘附力測試

個體細胞粘附力測試使剪切力直接作用于個體細胞， 測試其在基底材料的粘附力大小。常用方法有：微管吸吮法、 原子力顯微鏡(AFM)法和光鉗法等。

微管吸吮法[54]利用微吸管產(chǎn)生的負壓使管壁與細胞接合在一起， 通過顯微操作器的水平拉力使細胞與微吸管處于臨界脫離狀態(tài)， 由靜力平衡方程獲得細胞與材料的切向粘附力。Wang G[55]利用微管吸吮技術， 測定了內(nèi)皮祖細胞與不同基底材料表面的粘附強度。

原子力顯微鏡法[56]因其測量精度高， 被廣泛運用在細胞粘附力測定中。基于原子力顯微鏡法， 尹穆楠[57]設計了由光學顯微鏡和AFM 定位傳感控制系統(tǒng)組成的納米機器人。利用相對的探針將細胞從基底上提起， 可得對應粘附力曲線， 精度達到PN級。

光鉗法使用兩束激光， 夾持微小物體并進行移動。Andersson[58]利用一種配置有象限探測器和強力激光發(fā)射器的光鉗裝置， 測量了人牙齦成纖維細胞和人成骨細胞在玻璃板、 金屬鈦和羥基磷灰石表面上的粘附力大小。

整體粘附力測試法無法探究個體細胞的粘附狀態(tài)(如細胞與基材的接觸面積、 細胞的形狀等)對粘附力產(chǎn)生的影響； 而個體粘附力測試法缺乏仿生模擬， 使得測試結(jié)果與真實情況間存在一定誤差。因此， 為了獲得更加真實可靠的結(jié)果， 在實際應用中， 常將這兩類測試方法對比使用。

4　結(jié)論與展望

結(jié)合生物材料表面性質(zhì)對細胞粘附性能的影響機理， 對絲素纖維材料表面進行改性， 可改善細胞在絲素纖維材料表面的粘附性能。然而多數(shù)改性方法仍存在缺陷， 如化學接枝交聯(lián)引入化學物質(zhì)， 等離子體法的時效性限制， 表面涂層易脫落， 生物工程流程復雜且表達蛋白質(zhì)的濃度和含量低。單一的表面修飾方法往往難以達到實用要求， 改善傳統(tǒng)修飾方法， 結(jié)合多種改性方法， 有利于制備細胞粘附性優(yōu)良的絲素纖維材料。細胞粘附性的評價方法很多， 在實際應用中， 需要兼顧細胞形態(tài)、 粘附數(shù)量、 粘附力等多方面因素， 定性定量的探究細胞在材料表面的粘附情況。

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Surface Modification of Silk Fibroin Fiber for Improving Cell Adhesion

YU Shaoting, QIN Jinqiao, GUAN Guoping, WANG Lu

Key Laboratory of Textile Science & Technology，Ministry of Education,College of Textiles, Donghua University(Shanghai,201620)

Because of the excellent mechanical property and biological compatibility, silk fibroin fiber materials are widely used as biological materials, such as surgical sutures, stents, etc. After implantation of the silk fibroin vascular prosthesis in vivo, the low cells adhesion may cause the formation of thrombus and then lead to failure. In this paper, the factors that affect the cell adhesion on the surface of biomaterials, the methods of improving the surface cell adhesion of silk fibroin fibers and the evaluation methods of cell adhesion on the surface of biomaterials are reviewed, aiming to provide

for the further development of the application of fibroin fiber in the biological materials field.

silk fibroin fiber, cell adhesion, surface modification

10.3969/j.issn.1674-1242.2016.03.007

余劭婷，碩士研究生，研究方向：生物醫(yī)用紡織品E-mail: yushaoting01@126.com

關國平，副教授，E-mail:ggp@dhu.edu.cn

R318

A

1674-1242(2016)03-0144-06

2016-06-03)