石 洋， 潘博文， 王慧娟， 劉雄偉， 曹 煜， 劉雄利， 周 英*

（1.貴州大學藥學院，貴州省中藥民族藥創(chuàng)制工程中心，貴州貴陽550025；2.貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院皮膚科，貴州貴陽550025）

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芳姜黃酮對照品制備

石 洋1， 潘博文1， 王慧娟1， 劉雄偉1， 曹 煜2， 劉雄利1， 周 英1*

（1.貴州大學藥學院，貴州省中藥民族藥創(chuàng)制工程中心，貴州貴陽550025；2.貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院皮膚科，貴州貴陽550025）

摘要:目的 以姜黃揮發(fā)油為原料，建立高純度芳姜黃酮對照品的制備方法。方法 硅膠柱層析和制備型HPLC法對姜黃揮發(fā)油進行分離純化，EI-MS、1H-NMR和13C-NMR等手段確認對照品結(jié)構(gòu)，TLC和HPLC法檢測對照品純度，溫度、濕度和光照試驗考察對照品穩(wěn)定性，HPLC法研究芳姜黃酮含有量測定的色譜條件。結(jié)果 所得芳姜黃酮的純度大于99％，其外觀性狀無變化，含有量穩(wěn)定。另外經(jīng)考察，確定色譜條件為Hedera C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；檢測波長242 nm；流動相甲醇-水（80∶20）；進樣量10 μL；柱溫25℃；體積流量0.8 mL/min。結(jié)論 該方法制得的芳姜黃酮對照品符合中藥化學對照品相關(guān)要求，可用于姜黃藥材及其制劑的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞:姜黃揮發(fā)油；芳姜黃酮；對照品；制備工藝

dol:10.3969/j.issn.1001-1528.2016.02.054

姜黃為姜科姜黃屬植物姜黃Curcuma longa L.的干燥根莖［1］，始載于《唐本草》［2］，其根莖入藥，具有破血行氣，通經(jīng)止痛功效。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，姜黃具有抗炎、抗氧化、抗菌及抗腫瘤作用。姜黃屬植物主要包含姜黃揮發(fā)油和姜黃素兩大類成分［3-8］，其中姜黃揮發(fā)油中含有芳姜黃酮、姜烯等化合物［9-12］，不僅有抗腫瘤、抗癌、抗菌和止咳平喘的作用，而且還能增強免疫功能［13-15］。

在現(xiàn)有的制劑（如“姜黃消痤搽劑”）企業(yè)質(zhì)量標準中，含有量測定項主要是針對姜黃素和蘆丁兩種成分，但蘆丁為“姜黃消痤搽劑”的非專屬性成分，另外僅以姜黃素為含有量測定指標時，難以全面反映該復方制劑的質(zhì)量。由于芳姜黃酮在“姜黃消痤搽劑”中的含有量相對較高，并且為專屬性的活性成分，因此在測定項中新增芳姜黃酮的含有量測定，將能以多監(jiān)控指標的評價方式來實現(xiàn)“姜黃消痤搽劑”的質(zhì)量控制。

本實驗研究了從姜黃揮發(fā)油中分離和純化芳姜黃酮的方法，現(xiàn)已成功制備出芳姜黃酮對照品，可為其制備提供借鑒和參考。

1 材料與儀器

1.1 材料 姜黃揮發(fā)油（貴陽舒美達制藥廠有限公司）；柱色譜、薄層色譜硅膠（青島海洋化工有限公司）；乙腈、甲醇為色譜純（德國Merck公司）；其它試劑均為分析純。

1.2 儀器 Agi1ent1260分析型、制備型HPLC色譜儀，包括四元及二元泵、自動及手動進樣器、柱溫箱、DAD及可變紫外檢測器、ChemStation色譜工作站（美國Agi1ent Techno1ogies公司）；FA2004型電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；ZF-20D型三用紫外分析儀（上海予正儀器設(shè)備有限公司）；DZF-6020型真空干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司）；Bruker-400核磁共振儀，TMS為內(nèi)標（德國Bruker公司）；HP-5973質(zhì)譜儀（美國惠普公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 芳姜黃酮的分離純化

2.1.1 硅膠柱層析分離 取姜黃揮發(fā)油10 g，用石油醚溶解，置于瓷蒸發(fā)皿中，以12 g硅膠拌樣，揮干溶劑后濕法上柱，石油醚-乙酸乙酯（15∶1）開始洗脫，TLC展開劑為石油醚-乙酸乙酯（15∶1），254 nm下觀察。根據(jù)TLC顯示結(jié)果，收集Rf=0.7處的混合物，得到組分1 7.3 g，繼續(xù)以石油醚-乙酸乙酯（50∶1）洗脫，收集Rf=0.5處的混合物，得到組分2 5.2 g。然后，HPLC法對組分2進行定性分析，色譜柱為Hedera C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動相為甲醇-水（90∶10）；柱溫25℃；檢測波長254 nm；進樣量15 μL，結(jié)果見圖1。

注:圖中的3個峰從左至右，分別定為組分1、組分2和組分3圖1　姜黃揮發(fā)油的HP L C圖譜

2.1.2 制備型HPLC色譜分離 應用制備型HPLC色譜柱對Fr.2進行分離，色譜柱為Agi1ent ZORBAX SB-C18（21.2 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇-水（80∶20）；體積流量10 mL/min；檢測波長254 nm；進樣量0.4 mL。結(jié)果，共收集得到3個組分，濃縮蒸干，即得組分1、組分2和組分3，然后對其進行EI-MS、1H-NMR、13C-NMR測定。

2.1.3 結(jié)構(gòu)確認 通過EI-MS、1H-NMR、13C-NMR測定，確定組分1為芳姜黃酮。其中，EI-MS m/z: 216（M+，6），201（M+-Me，7），132（11），119（44），91（25），83 （100），77（14），55（70），與譜庫中芳姜黃酮數(shù)據(jù)的匹配率為98％。1H-NMR（CDC13，400 MHz）δ: 1.17（3H，d，J=7.2 Hz），1.78（3H，d，J=1.2 Hz），2.03（3H，d，J= 0.8 Hz），2.23（3H，s），2.50-2.56（1H，m），2.61-2.66 （1H，m），3.19-3.24（1H，m），5.95（1H，dd，J=1.2，0.8 Hz），7.03（4H，d，J=1.2 Hz）。13C-NMR（CDC13，100 MHz）δ: 20.7，21.0，22.0，27.7，35.3，52.7，124.1，126.7，129.1，135.6，143.7，155.1，199.9。

2.2 芳姜黃酮的純度檢測

2.2.1 薄層色譜法 取芳姜黃酮適量，加甲醇溶解，制成每1 mL含1 mg化合物的溶液，作為供試品。然后，分別吸取2、5、10、15、20 μL，點于硅膠GF254薄層板上，采用上行展開方式，依次以石油醚-乙酸乙酯（15∶1）、正己烷-丙酮（25∶1）、正己烷-氯仿（5∶1）為展開劑，254 nm下觀察，碘蒸氣顯色。結(jié)果，經(jīng)3個展開系統(tǒng)、2種顯色方式檢測時，TLC上均呈現(xiàn)單一斑點，而且未見雜質(zhì)。

2.2.2 HPLC色譜法 采用分析型Agi1ent1260型HPLC色譜儀，色譜柱為Hedera C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）；柱溫25℃；流動相甲醇-水（80∶20）；進樣量10 μL；體積流量1.0 mL/min；分別設(shè)定204、220、254、280、310 nm 5個信號通道檢視，用于考察芳姜黃酮的純度。

取芳姜黃酮適量，加甲醇溶解，制成每1 mL含1 mg化合物的溶液，作為供試品，然后取空白溶劑（甲醇）和供試品溶液各10 μL，按上述色譜條件測定。結(jié)果，扣除溶劑干擾峰后，芳姜黃酮的色譜峰面積歸一化含有量在各波長均大于99％，見表1。

表1　芳姜黃酮在各波長下歸一化含有量的測定結(jié)果

2.3 芳姜黃酮穩(wěn)定性考察 按照《中國藥典》2010年版二部附錄XIXC“原料藥與藥物制劑穩(wěn)定性試驗指導原則”，對芳姜黃酮進行室溫、高濕、強光照射影響因素試驗。然后，按“2.2.2”項下方法檢測芳姜黃酮的純度。

2.3.1 室溫試驗 由于芳姜黃酮為揮發(fā)性成分，故將溫度設(shè)定為室溫25℃，放置10 d，然后分別于第0、5、10天取樣分析。結(jié)果表明，芳姜黃酮在該條件下放置10 d后，外觀性狀無變化，含有量穩(wěn)定，見表2。

表2　芳姜黃酮溫度試驗的結(jié)果（峰面積歸一化結(jié)果，％）

2.3.2 高濕試驗 在溫度25℃、相對濕度90％下放置10 d，然后分別于第0、5和10天取樣分析。結(jié)果表明，芳姜黃酮在該條件下放置10 d后，外觀性狀無變化，含有量穩(wěn)定，吸濕增重小于5％，見表3。

表3　芳姜黃酮高濕試驗（峰面積歸一化結(jié)果，％）

2.3.3 強光照試驗 于照度（4 500±500）1x下放置10 d，然后分別于第0、5和10天取樣分析。結(jié)果表明，芳姜黃酮在該條件下放置10 d后，外觀性狀無變化，含有量穩(wěn)定，見表4。

表4　芳姜黃酮光照試驗（峰面積歸一化結(jié)果，％）

2.4 芳姜黃酮對照品含有量測定色譜條件考察

2.4.1 檢測波長考察 利用DAD二極管陣列檢測器的全波長掃描功能，對芳姜黃酮供試液進行190～400 nm下的全波長掃描，進行考察。結(jié)果表明，供試液在242 nm處有最大吸收，故選擇242 nm作為檢測波長。

2.4.2 流動相考察 取芳姜黃酮供試液適量，分別以乙腈-水（80∶20）、甲醇-水（80∶20）、甲醇-0.05％磷酸水溶液（80∶20）、甲醇-0.1％磷酸水溶液（80∶20）、甲醇-0.3％磷酸水溶液（80∶20）為流動相，在242 nm下檢測，進行考察，結(jié)果見表5。由表可知，以甲醇-水（80∶20）為流動相時，對稱因子最高。

表5　流動相研究結(jié)果

2.4.3 柱溫的考察 取芳姜黃酮供試液適量，分別設(shè)置柱溫為25、30、35℃，進行考察，結(jié)果見表6。由表可知，當柱溫為25℃時，基線穩(wěn)定，對稱因子最高。

表6　柱溫研究結(jié)果

2.4.4 流量的考察 取芳姜黃酮供試液適量，分別設(shè)置體積流量為0.8、1.0、1.2 mL/min，進行考察，結(jié)果見表7。由表可知，當體積流量為0.8 mL/min時，對稱因子和理論塔板數(shù)最高。

表7　流量研究結(jié)果

2.4.5 色譜柱的考察 取芳姜黃酮供試液適量，以檢測波長242 nm、柱溫25℃、流動相甲醇-水（80∶20）、體積流量0.8 mL/min、進樣量10 μL為色譜條件，分別采用Hedera C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）、Agi1ent C8（4.6 mm× 150 mm，5 μm）、Waters C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱進行測定，結(jié)果見表8。由表可知，當色譜柱為Hedera C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）時，對稱因子和理論塔板數(shù)最好。

表8　色譜柱研究結(jié)果

2.5 結(jié)果 本實驗通過反復硅膠柱層析和制備型HPLC法，分離得到芳姜黃酮，其對照品為淡黃色液體，易溶于二氯甲烷和丙酮。然后，對其進行了結(jié)構(gòu)鑒定、純度檢測、穩(wěn)定性和色譜條件考察。

經(jīng)EI-MS測定，它與譜庫中的芳姜黃酮數(shù)據(jù)匹配率為98％，而且1H-NMR和13C-NMR測定結(jié)果與標準數(shù)據(jù)一致。

在硅膠GF254薄層板上，經(jīng)3個展開系統(tǒng)、2種顯色方式檢測時，均呈現(xiàn)單一斑點，而且未見雜質(zhì)。然后HPLC檢測時發(fā)現(xiàn)，芳姜黃酮的色譜峰面積歸一化含有量在各波長下均大于99％。

考察了室溫、高濕和強光照，分別于第0、5和10 d取樣分析。結(jié)果表明，芳姜黃酮的外觀性狀無變化，含有量穩(wěn)定。

考察了色譜柱、檢測波長、流動相、柱溫和流量，結(jié)果確定色譜條件為Hedera C18色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；檢測波長242 nm；流動相甲醇-水（80∶20）；進樣量10 μL；柱溫25℃；體積流量0.8 mL/min。

3 結(jié)論

本實驗制備得到的芳姜黃酮對照品的純度大于99％，符合國家標準要求，而且路線簡單可靠，可用于姜黃藥材及其制劑的質(zhì)量控制。

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［醫(yī)院藥房］

*通信作者:周 英（1971—），女，教授，博士生導師，從事中藥新劑型研究。Te1: 13595102335，E-mai1: yingzhou71@126.com

作者簡介:石 洋（1989—），女，碩士，從事天然藥物成分及活性生理研究。E-mai1: xiaoyewater@163.com

基金項目:貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項項目（黔科合中藥字［2012］5040）

收稿日期:2014-12-15

中圖分類號:R284.1

文獻標志碼:B

文章編號:1001-1528（2016）02-0464-03