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TRAIL對人胃癌耐藥細胞株SGC-7901/VCR多藥耐藥基因GST-π表達的影響
王慧群*張開光#王俊先王巧民
安徽省立醫(yī)院消化內(nèi)科(230001)
背景:腫瘤細胞的多藥耐藥現(xiàn)象是導(dǎo)致進展期胃癌化療失敗的重要因素之一。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(TRAIL)能增強化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用,并逆轉(zhuǎn)耐藥細胞株為敏感細胞株,但其確切機制尚不清楚。目的:研究TRAIL對人胃癌耐藥細胞株SGC-7901/VCR多藥耐藥基因谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶-π(GST-π)表達的影響,探討其逆轉(zhuǎn)胃癌細胞多藥耐藥的可能機制。方法:以不同濃度TRAIL(50、100、200、400 μg/L)干預(yù)SGC-7901/VCR細胞48 h,采用RT-PCR和ELISA法檢測各組SGC-7901/VCR細胞中的GST-π mRNA表達和細胞培養(yǎng)上清液中的GST-π含量。結(jié)果:TRAIL干預(yù)能抑制SGC7901/VCR細胞的GST-π mRNA表達及其蛋白分泌,抑制作用在一定劑量范圍內(nèi)(≤200 μg/L)具有量效關(guān)系。50、100、200、400 μg/L TRAIL組GST-π mRNA相對表達量分別為0.89±0.04、0.77±0.08、0.65±0.06和0.61±0.03,細胞培養(yǎng)上清液中的GST-π含量分別為(57.56±1.19) ng/mL、(56.30±0.80) ng/mL、(31.41±1.65) ng/mL和(30.80±1.34) ng/mL,均低于對照組的1.01±0.13和(58.62±1.38) ng/mL,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論:TRAIL可能通過下調(diào)GST-π表達參與了胃癌細胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)。
關(guān)鍵詞胃腫瘤;TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體;谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶;多藥耐藥
Effect of TRAIL on Expression of Multidrug Resistance Gene GST-π in Drug-resistant Human Gastric Cancer Cell Line SGC7901/VCRWANGHuiqun,ZHANGKaiguang,WANGJunxian,WANGQiaomin.DepartmentofGastroenterology,AnhuiProvincialHospital,Hefei(230001)
Correspondence to: ZHANG Kaiguang, Email: zhangkaiguang@medmail.com.cn
Background: Multidrug resistance of tumor cells is one of the important factors that cause failure of chemotherapy in advanced gastric cancer. Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) may enhance the killing effect of chemotherapeutics on tumor cells, and reverse drug-resistant cell lines to sensitive cell lines, but its mechanism is not yet clear. Aims: To study the effect of TRAIL on expression of multidrug resistance gene glutathione S-transferase-π (GST-π) in drug-resistant human gastric cancer cell line SGC-7901/VCR and the potential mechanism of TRAIL in reversing multidrug resistance of gastric cancer cells. Methods: SGC-7901/VCR cells were treated with TRAIL in different doses (50, 100, 200 and 400 μg/L) for 48 hours. After treatment, expression of GST-π mRNA in SGC-7901/VCR cells and concentration of GST-π in culture supernatant were detected by RT-PCR and ELISA, respectively. Results: TRAIL could inhibit mRNA expression and protein secretion of GST-π in SGC-7901/VCR cells in a dose-dependent manner within a certain range (≤200 μg/L). The relative expression levels of GST-π mRNA in 50, 100, 200 and 400 μg/L TRAIL groups were 0.89±0.04, 0.77±0.08, 0.65±0.06 and 0.61±0.03, respectively, and the concentrations of GST-π in culture supernatant in these groups were (57.56±1.19) ng/mL, (56.30±0.80) ng/mL, (31.41±1.65) ng/mL and (30.80±1.34) ng/mL, respectively, all were significantly lower than those in control group [1.01±0.13 and (58.62±1.38) ng/mL,Pall <0.05]. Conclusions: TRAIL may play a potential role in reversing multidrug resistance of gastric cancer cells through down-regulating GST-π expression.
Key wordsStomach Neoplasms;TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand;Glutathione Transferase;Multidrug Resistance
胃癌是消化系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤[1],化療是胃癌尤其是進展期胃癌的重要治療手段,而腫瘤細胞的多藥耐藥(multidrug resistance)現(xiàn)象是導(dǎo)致胃癌化療失敗的重要因素之一。因此,研究多藥耐藥的發(fā)生機制及其影響因素對尋求逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的對策具有重要意義。腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand, TRAIL)能增強化療藥物對腫瘤細胞的殺傷作用,并逆轉(zhuǎn)耐藥細胞株為敏感細胞株[2-3],但其確切機制尚不清楚。有研究[4-6]發(fā)現(xiàn)抑制腫瘤細胞多藥耐藥基因表達可有效逆轉(zhuǎn)多藥耐藥,增加對化療藥物的敏感性,由此推測TRAIL亦可能通過影響多藥耐藥基因表達而發(fā)揮化療增敏作用。谷胱甘肽硫轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase, GST)是一組具有解毒和代謝功能的酶類,在各類GST中,以GST-π占比最高,與腫瘤細胞多藥耐藥的關(guān)系最為密切,在耐藥腫瘤細胞中呈高表達[7]。本實驗以TRAIL為干預(yù)因素,觀察其對人胃癌耐藥細胞株SGC-7901/VCR多藥耐藥基因GST-π表達的影響,探討TRAIL逆轉(zhuǎn)胃癌細胞多藥耐藥的可能機制,以期為胃癌化療提供新的思路。
材料與方法
一、細胞株和主要試劑
人胃癌耐藥細胞株SGC-7901/VCR由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍消化病研究所樊代明教授惠贈。長春新堿(VCR,深圳萬樂藥業(yè)有限公司),TRAIL(PeproTech),TRIzol?RNA分離試劑、第一鏈cDNA合成試劑盒、PCR試劑盒(Thermo Fisher Scientific),GST-π和β-actin引物設(shè)計、合成[生工生物工程(上海)股份有限公司],GST-π ELISA試劑盒(R&D Systems, Inc.)。
二、方法
1. 細胞培養(yǎng):SGC-7901/VCR細胞置于37 ℃、50 mL/L CO2、飽和濕度條件恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),培養(yǎng)液為RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含100 mL/L FBS、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 μg/mL),并常規(guī)加入1.0 μg/mL VCR以維持細胞耐藥性,實驗前2周撤藥。
2. TRAIL配制:按試劑說明書將TRAIL溶于100 μL ddH2O中,配制成100 mg/L溶液,-20 ℃保存,實驗當天以培養(yǎng)基稀釋至所需濃度。
3. 細胞處理:取對數(shù)生長期SGC-7901/VCR細胞,以每孔1×108/L接種于25 cm×25 cm培養(yǎng)瓶中,待細胞生長至70%~80%,更換新鮮培養(yǎng)基,分別加入終濃度為50、100、200、400 μg/L的TRAIL,另設(shè)不予TRAIL干預(yù)、僅加入培養(yǎng)基的對照組。每24 h換液一次以維持藥物濃度,培養(yǎng)48 h后分別收集各組細胞,用于后續(xù)實驗。每一組別設(shè)3個復(fù)孔,實驗結(jié)果取均值。
4. RT-PCR:分別收集各組細胞1×109,以TRIzol?RNA分離試劑提取總RNA,經(jīng)鑒定所提取的總RNA樣本純度和完整性符合實驗要求。取總RNA 2 μg,以第一鏈cDNA合成試劑盒合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系:總RNA 2 μg,Oligo(dT) 1 μL,5×緩沖液4 μL,RNase抑制劑1 μL,10 mmol/L dNTP 2 μL,M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL,以去離子水補足至20 μL。反應(yīng)條件:42 ℃ 1 h,70 ℃ 5 min,4 ℃ 10 min。取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物2 μL,以β-actin為內(nèi)參行PCR擴增。GST-π引物序列:F 5’-CCC AAG TTC CAG GAC GGA GAC-3’,R 5’-TCA GCA GCA AGT CCA GCA GGT-3’,擴增片段長度325 bp[8];β-actin引物序列:F 5’-TCC TGT GGC ATC CAC GAA ACT-3’,R 5’-GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT-3’,擴增片段長度314 bp[9]。PCR反應(yīng)體系:PCR master mix 12.5 μL,上游、下游引物各1 μL,cDNA 2 μL,以去離子 水補足至25 μL。在Applied Biosystems?GeneAmp?9700 PCR系統(tǒng)中行PCR擴增。反應(yīng)條件:GST-π 94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,55 ℃ 45 s,72 ℃ 60 s,35個循環(huán);72 ℃ 10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)0.2%瓊脂糖凝膠電泳,以天能GIS-2010數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)對GST-π mRNA表達行半定量分析(GST-π mRNA/β-actin mRNA)。
5. ELISA:各組細胞培養(yǎng)48 h后,分別吸取培養(yǎng)上清液500 μL,3 000 r/min離心5~10 min,去除細胞碎片。將上清液加入已包被抗體的96孔板中,按ELISA試劑盒說明書進行操作。最后于酶標儀450 nm處讀取各樣本A值,根據(jù)標準蛋白濃度和相應(yīng)A值繪制標準曲線,計算GST-π含量。
三、統(tǒng)計學(xué)分析
結(jié)果
一、各組SGC7901/VCR細胞GST-π mRNA表達
RT-PCR檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,經(jīng)不同濃度TRAIL干預(yù)48 h的SGC7901/VCR細胞,GST-π mRNA表達受到不同程度的抑制,50、100、200、400 μg/L TRAIL組相對表達量分別為0.89±0.04、0.77±0.08、0.65±0.06和0.61±0.03,均低于對照組的1.01±0.13,除200 μg/L與400 μg/L組間,各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),表明TRAIL對SGC7901/VCR細胞GST-π mRNA表達的抑制作用在一定劑量范圍內(nèi)(≤200 μg/L)具有量效關(guān)系(圖1)。
M:DNA Marker;泳道1~5:對照組和50、100、200、400 μg/L TRAIL組;泳道a~e:與泳道1~5對應(yīng)的β-actin
圖1不同濃度TRAIL干預(yù)對SGC7901/VCR細胞GST-π mRNA表達的影響
二、各組SGC7901/VCR細胞培養(yǎng)上清液GST-π含量
ELISA檢測結(jié)果顯示,與對照組相比,經(jīng)不同濃度TRAIL干預(yù)48 h的SGC7901/VCR細胞,細胞培養(yǎng)上清液中的GST-π含量有不同程度的降低,50、100、200、400 μg/L TRAIL組GST-π含量分別為(57.56±1.19) ng/mL、(56.30±0.80) ng/mL、(31.41±1.65) ng/mL和(30.80±1.34) ng/mL,均低于對照組的(58.62±1.38) ng/mL,除200 μg/L與400 μg/L組間,各組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),表明TRAIL對SGC7901/VCR細胞GST-π蛋白分泌的抑制作用在一定劑量范圍內(nèi)(≤200 μg/L)具有量效關(guān)系。
討論
腫瘤細胞耐藥性的產(chǎn)生是一個多因素參與的復(fù)雜過程,現(xiàn)已確認耐藥基因的激活和表達上調(diào)與腫瘤耐藥有密切聯(lián)系[10]。GST-π是一種分布于細胞質(zhì)中的重要Ⅱ相解毒酶類,其解毒功能與腫瘤細胞多藥耐藥關(guān)系密切,可催化還原型谷胱甘肽(GSH)與親電子物質(zhì)結(jié)合,使細胞毒性藥物代謝成無毒性物質(zhì),并可直接與親脂性藥物結(jié)合,通過增加藥物的水溶性而促使其排出細胞外,同時可將化療藥物產(chǎn)生的過氧化物還原為無毒性物質(zhì),從而降低藥物療效[11],可作為腫瘤耐藥的獨立影響因素。研究發(fā)現(xiàn)GST-π在胃癌組織中呈高表達[8-9],而抑制GST-π表達可提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性,從而延長患者生存期[6]。
TRAIL是腫瘤壞死因子(TNF)家族成員,能通過與死亡受體結(jié)合誘導(dǎo)多種腫瘤細胞凋亡,對正常細胞則無明顯毒性作用,這一特性使其在腫瘤靶向治療方面顯現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[2-3,12-13]。TRAIL與細胞膜上的相應(yīng)死亡受體TRAIL-R1、TRAIL-R2結(jié)合后激活caspases通路,傳遞和放大凋亡信號,誘導(dǎo)靶細胞發(fā)生快速、大量、高效的凋亡反應(yīng)。此外,研究[14]還發(fā)現(xiàn)TRAIL如與化療藥物聯(lián)合使用,對腫瘤細胞的殺傷效應(yīng)較兩者單用顯著增強,但其增加腫瘤細胞化療敏感性的作用機制尚不明確。據(jù)相關(guān)文獻報道,TNF逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多藥耐藥的可能機制主要有[15-16]:①下調(diào)P-糖蛋白(P-gp)編碼基因多藥耐藥基因1(MDR1)表達,減少細胞內(nèi)化療藥物蓄積,從而逆轉(zhuǎn)由P-gp引起的經(jīng)典多藥耐藥;②下調(diào)GST-π表達,通過降低細胞內(nèi)解毒功能逆轉(zhuǎn)多藥耐藥。TRAIL作為TNF家族成員之一,其逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞多藥耐藥的機制是否與TNF類似,目前國內(nèi)外相關(guān)文獻報道尚少。本課題組前期研究[17]已發(fā)現(xiàn)TRAIL可抑制人胃癌耐藥細胞株SGC-7901/VCR中的MDR1/P-gp表達,且抑制作用在一定劑量范圍內(nèi)具有量效關(guān)系。本研究進一步探討了TRAIL逆轉(zhuǎn)胃癌細胞多藥耐藥的作用與GST-π的關(guān)系。實驗結(jié)果顯示,在SGC-7901/VCR細胞中,TRAIL可在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平抑制多藥耐藥基因GST-π表達,抑制作用具有良好的量效關(guān)系,但此種量效關(guān)系并不呈線性關(guān)系,TRAIL濃度>200 μg/L 后,GST-π表達不再進一步降低,分析其原因可能為該胃癌細胞株本身對TRAIL有一定耐藥性。劉玲等[18]關(guān)于TRAIL對SGC-7901細胞生長抑制和凋亡誘導(dǎo)作用的實驗研究發(fā)現(xiàn),TRAIL濃度>200 μg/L后,細胞生長抑制率即不再明顯增加,TRAIL濃度>500 μg/L時,細胞生長抑制率和凋亡率均不超過30%,提示SGC-7901細胞為TRAIL耐藥細胞株,與本實驗結(jié)果相符。
綜上所述,根據(jù)本實驗結(jié)果可初步推測 TRAIL與胃癌細胞多藥耐藥之間存在負相關(guān)關(guān)系,其可能通過下調(diào)多藥耐藥基因GST-π表達參與了胃癌細胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)。為了更深入地研究TRAIL對胃癌細胞多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)作用,后續(xù)擬聯(lián)合應(yīng)用TRAIL與化療藥物,觀察TRAIL 對胃癌細胞多藥耐藥基因表達和化療藥物療效的影響,探討TRAIL下調(diào)多藥耐藥基因表達具體機制的相關(guān)研究亦已在進行中。
參考文獻
1 孫秀娣,牧人,周有尚,等. 中國胃癌死亡率20年變化情況分析及其發(fā)展趨勢預(yù)測[J]. 中華腫瘤雜志, 2004, 26 (1): 4-9.
2 Schaefer U, Voloshanenko O, Willen D, et al. TRAIL: a multifunctional cytokine[J]. Front Biosci, 2007, 12: 3813-3824.
3 Cretney E, Takeda K, Smyth MJ. Cancer: novel therapeutic strategies that exploit the TNF-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)/TRAIL receptor pathway[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2007, 39 (2): 280-286.
4 Shi LX, Ma R, Lu R, et al. Reversal effect of tyroservatide (YSV) tripeptide on multi-drug resistance in resistant human hepatocellular carcinoma cell line BEL-7402/5-FU[J]. Cancer Lett, 2008, 269 (1): 101-110.
5 Song X, Wang JB, Yin DL, et al. Down-regulation of lung resistance related protein by RNA interference targeting survivin induces the reversal of chemoresistances in hepatocellular carcinoma[J]. Chin Med J (Engl), 2009, 122 (21): 2636-2642.
6 Beeghly A, Katsaros D, Chen H, et al. Glutathione S-transferase polymorphisms and ovarian cancer treatment and survival[J]. Gynecol Oncol, 2006, 100 (2): 330-337.
7 Tozawa K, Oshima T, Kobayashi T, et al. Oxaliplatin in treatment of the cisplatin-resistant MKN45 cell line of gastric cancer[J]. Anticancer Res, 2008, 28 (4B): 2087-2092.
8 于冬青,易永芬. MRP、GST-π、TopoⅡα和LRP在胃癌組織中的表達及意義[J]. 癌癥, 2003, 22 (5): 496-499.
9 Wideroff L, Vaughan TL, Farin FM, et al. GST, NAT1, CYP1A1 polymorphisms and risk of esophageal and gastric adenocarcinomas[J]. Cancer Detect Prev, 2007, 31 (3): 233-236.
10Zhang D, Fan D. Multidrug resistance in gastric cancer: recent research advances and ongoing therapeutic challenge[J]. Expert Rev Anticancer Ther, 2007, 7 (10): 1369-1378.
11Fojo T, Bates S. Strategies for reversing drug resistance[J]. Oncogene, 2003, 22 (47): 7512-7523.
12Wu GS. TRAIL as a target in anti-cancer therapy[J]. Cancer Lett, 2009, 285 (1): 1-5.
13Abdulghani J, El-Deiry WS. TRAIL receptor signaling and therapeutics[J]. Expert Opin Ther Targets, 2010, 14 (10): 1091-1108.
14曾四平,肖亞軍,章小平,等. TRAIL聯(lián)合順鉑體外殺傷前列腺癌PC-3細胞株的實驗研究[J]. 醫(yī)學(xué)研究雜志, 2010, 39 (3): 40-42.
15Komdeur R, Plaat BE, Hoekstra HJ, et al. Expression of P-glycoprotein, multidrug resistance-associated protein 1, and lung resistance-related protein in human soft tissue sarcomas before and after hyperthermic isolated limb perfusion with tumor necrosis factor-alpha and melphalan[J]. Cancer, 2001, 91 (10): 1940-1948.
16魏素菊,劉海英,史健,等. 重組改構(gòu)人TNF逆轉(zhuǎn)卵巢癌耐藥細胞株SKOV3/DDP的耐藥性及其機制[J]. 中國腫瘤生物治療雜志, 2008, 15 (2): 150-154.
17王慧群,張開光. TRAIL抑制胃癌多藥耐藥基因MDR1/P-gp的表達[J]. 安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2012, 47 (1): 31-34.
18劉玲,費素娟. TRAIL聯(lián)合PDTC對SGC-7901細胞生長抑制和凋亡誘導(dǎo)的實驗研究[J]. 徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2009, 29 (11): 718-721.
(2015-05-26收稿;2015-06-05修回)
DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.01.003
*Email: wanghuiqun1986@126.com
#本文通信作者, Email: zhangkaiguang@medmail.com.cn