樊宏超 姚睿智 鄧清華 馬德慧（內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 內(nèi)蒙古 通遼 028000）

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RNA干擾在抑制PRRSV復(fù)制上的研究進(jìn)展

樊宏超 姚睿智 鄧清華 馬德慧*（內(nèi)蒙古民族大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 內(nèi)蒙古 通遼 028000）

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起豬的一種病毒性疾病，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前還沒有有效的疫苗和治療藥物，急需采取一種新的研究策略。RNA干擾（RNA interference，RNAi）技術(shù)已廣泛應(yīng)用于抗病毒研究，本文將對(duì)近幾年RNAi技術(shù)在抑制PRRSV復(fù)制上的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

PRRS是一種以導(dǎo)致懷孕母豬流產(chǎn)和仔豬呼吸困難為主要特征的疾?。?］。1990年在北美和歐洲首先發(fā)現(xiàn)了PRRS這種疾?。?］，1996年在我國(guó)大部分地區(qū)也發(fā)現(xiàn)有此病的存在；2006年我國(guó)10多個(gè)省份突然爆發(fā)高熱癥狀的PRRS，致使400多萬頭豬死亡［3］，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。雖然目前可應(yīng)用PRRSV疫苗進(jìn)行預(yù)防保護(hù)，但由于PRRSV具有高變異性，存在多個(gè)高度變異的區(qū)域，致使疫苗不能提供足夠的免疫保護(hù)作用［4］。此外，目前還沒有抗PRRSV的有效治療藥物，因此需要采取一種新的抗病毒策略。RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種由雙鏈RNA（Double-stranded RNA，dsRNA）介導(dǎo)的以序列特異性誘導(dǎo)同源mRNA降解的轉(zhuǎn)錄后機(jī)制［5］。RNAi能夠有效的抑制病毒的復(fù)制，一些研究表明小干擾RNA（Small interfering RNA，siRNA）或微RNA（microRNA，miRNA）靶向作用于病毒的特異基因能很好的抑制病毒的復(fù)制，同時(shí)還展現(xiàn)出抗病毒活性。

1 RNAi抑制病毒復(fù)制的作用機(jī)制

研究發(fā)現(xiàn)RNAi廣泛存在于各種生物體中，可以保護(hù)生物體基因免受外來基因的侵害，可有效地參與細(xì)胞防御與分化調(diào)控［6］。但目前針對(duì)RNAi的作用機(jī)制還沒有一個(gè)確切的結(jié)論，隨著研究的不斷深入，認(rèn)為RNAi包括起始階段和效應(yīng)階段。RNAi的起始階段主要發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中，dsRNA通過外源導(dǎo)入、轉(zhuǎn)基因或者病毒感染等方式進(jìn)入目的細(xì)胞，在Dicer酶的作用下將dsRNA切割成大小為21-23nt的雙鏈siRAN，siRNA是識(shí)別靶mRNA的標(biāo)志，它的生成啟動(dòng)了RNAi反應(yīng)［7］；siRNA具有一條正義鏈和一條反義鏈，當(dāng)siRNA與RNA介導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC）結(jié)合時(shí)，siRNA反義鏈在解旋酶作用下從RISC中分離出來，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)原則與同源的mRNA特異性結(jié)合，同時(shí)釋放出siRNA正義鏈，在siRNA反義鏈介導(dǎo)下，RISC中的核酸內(nèi)切酶切割與之互補(bǔ)的mRNA，導(dǎo)致mRNA發(fā)生降解，進(jìn)而產(chǎn)生RNAi效應(yīng)［8］。microRNA（miRNA）是一段長(zhǎng)度為19～25nt的單鏈RNA（ssRNA），在介導(dǎo)RNAi過程中與siRNA有類似的功能，誘導(dǎo)靶mRNA的剪切或抑制mRNA的轉(zhuǎn)錄后翻譯過程。

2 RNAi在抑制PRRSV復(fù)制方面的研究

目前，RNAi技術(shù)被認(rèn)為是抑制病毒感染的有效方法之一?？梢酝ㄟ^化學(xué)合成、體外轉(zhuǎn)錄、病毒載體等方法獲得siRNA，通過化學(xué)合成獲得miRNA，利用其來進(jìn)行RNAi技術(shù)在應(yīng)用方面的研究。

2.1 靶向PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白基因在RNAi過程中的研究

（1）N蛋白是PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，占病毒蛋白總量的20%～40%，在PRRSV感染細(xì)胞中起重要作用。當(dāng)N基因發(fā)生變異或受到抑制，將會(huì)導(dǎo)致整個(gè)病毒基因組功能喪失。楊閩南［9］根據(jù)N蛋白的特點(diǎn)，針對(duì)N基因篩選出3個(gè)高效靶位，構(gòu)建出3個(gè)短發(fā)夾RNA（short hairpin RNA，shRNA 是siRNA的前體分子，在體內(nèi)可被核酸酶切割成siRNA）干擾質(zhì)粒，在MARC-145細(xì)胞上通過病毒滴度測(cè)定，間接免疫熒光檢測(cè)等技術(shù)驗(yàn)證了RNAi靶向N基因抑制PRRSV的復(fù)制效果，結(jié)果表明shRNA干擾質(zhì)粒能很大程度的降低病毒滴度，阻止細(xì)胞病變的形成。黃良宗［10］等也針對(duì)PRRSV N蛋白基因設(shè)計(jì)、合成了3個(gè)siRNA，并構(gòu)建出3個(gè)siRNA表達(dá)質(zhì)粒，在細(xì)胞水平上檢測(cè)了siRNA表達(dá)質(zhì)粒對(duì)PRRSV復(fù)制的抑制效果，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)將三種siRNA表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，能夠起到很好抑制PRRSV復(fù)制的效果。（2）GP3、GP4、GP5和M蛋白都是PRRSV的結(jié)構(gòu)蛋白，在病毒感染機(jī)體的過程中都起到一定的調(diào)節(jié)作用。李紅梅［11］等針對(duì)GP3、GP4、GP5和M蛋白的基因構(gòu)建出相應(yīng)的shRNA干擾質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后能有效抑制PRRSV的增殖。周芳［12］根據(jù)PRRSV M及GP5蛋白基因結(jié)構(gòu)序列分別設(shè)計(jì)合成了相應(yīng)的shRNA，并將其鏈接到載體上，構(gòu)建成RNA干擾載體，在轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)下導(dǎo)入Marc-145細(xì)胞，同時(shí)接種PRRSV，48h后通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)得知，這兩種干擾質(zhì)粒均表現(xiàn)出抑制PRRSV增殖復(fù)制的作用。目前我們已經(jīng)初步了解PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白在病毒感染機(jī)體中的作用，針對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白基因篩選合成相應(yīng)的siRNA或shRNA，通過RNAi技術(shù)減少結(jié)構(gòu)蛋白基因的表達(dá)，也許將為控制PRRSV感染提供一種可能性的策略。

2.2 靶向PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白基因在RNAi過程中的研究PRRSV非結(jié)構(gòu)蛋白是由ORF1a和ORF1b編碼的，并不是病毒粒子的組成成分，但卻在病毒的復(fù)制過程中扮演重要的角色?；ㄦ茫?3］根據(jù)PRRSV 非結(jié)構(gòu)蛋白12（nsp12）的基因序列設(shè)計(jì)合成引物，PCR擴(kuò)增nsp12的全長(zhǎng)基因，并將其與pEGFP-N1質(zhì)粒相連接構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，與針對(duì)nsp12基因合成構(gòu)建的shRNA質(zhì)粒，共同轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，通過Western blot發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組中PRRSV nsp12蛋白的表達(dá)量要明顯低于對(duì)照組；同時(shí)她也驗(yàn)證了所構(gòu)建的shRNA質(zhì)粒對(duì)PRRSV的抑制效果，發(fā)現(xiàn)靶向nsp12設(shè)計(jì)合成的shRNA可以顯著降低細(xì)胞病變和PRRSV的感染率。Xie jie xiong［14］靶向PRRSV nsp9基因合成構(gòu)建了siRNA重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，接種PRRSV 24h后應(yīng)用間接免疫熒光技術(shù)（IFA）、實(shí)時(shí)定量PCR等技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，siRNA重組質(zhì)粒能夠有效的抑制PRRSV nsp9基因的表達(dá)，與對(duì)照組相比可以使PRRSV nsp9基因的表達(dá)量減少86.56%～93.66%，為后續(xù)RNAi技術(shù)在抑制PRRSV復(fù)制的研究中提供了一定的基礎(chǔ)。

2.3 miRNA抑制PRRSV復(fù)制的研究 MiRNA在病原體與宿主的相互作用中起到重要的調(diào)節(jié)作用，能通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控病毒的感染。為找到PRRSV基因組RNA上存在的miRNA結(jié)合位點(diǎn)，Li li wei［15］等通過生物信息學(xué)軟件對(duì)PRRSV VJX143毒株進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅有miR-130的結(jié)合位點(diǎn)位于PRRSV 5`UTR，同時(shí)發(fā)現(xiàn)它包含五個(gè)成員，分別是miR-130a、miR-130b、miR-1301b與miR-454，為探索miR-130與PRRSV復(fù)制之間的關(guān)系，合成了這5條miRNA模擬體，將其轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞，接種PRRSV進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-130模擬體組的病毒滴度和PRRSV ORF7基因的表達(dá)量明顯低于對(duì)照組，說明miR-130在抑制PRRSV復(fù)制的過程中發(fā)揮了不可或缺的作用。張瓊［16］也通過生物信息學(xué)軟件篩選出宿主中可以負(fù)向調(diào)控PRRSV復(fù)制的多種miRNA，經(jīng)過驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞中過表達(dá)miR-23、miR-378和miR-505能夠有效抑制PRRSV的復(fù)制。郭雪坤［17］通過應(yīng)用RNA免疫共沉淀技術(shù)證明了miR-181能夠靶向PRRSV的基因組RNA，將miR-181模擬體轉(zhuǎn)染豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）和Marc-145細(xì)胞，能顯著降低病毒滴度?？梢娎脙?nèi)源性miRNA的表達(dá)來抑制PRRSV的復(fù)制，將是控制PRRS的一種新方法。

3 展望

RNAi技術(shù)是目前進(jìn)行基因功能研究的一種主要方法，已被廣泛應(yīng)用于基因治療、遺傳、信號(hào)傳導(dǎo)等多個(gè)科研領(lǐng)域，并且有力的促進(jìn)了相關(guān)科學(xué)的發(fā)展。在高速發(fā)展的今天，隨著研究的不斷深入，人們對(duì)RNAi機(jī)理正逐步了解和明確。PRRSV作為一種RNA病毒，可以廣泛的應(yīng)用RNAi技術(shù)對(duì)抑制PRRSV復(fù)制進(jìn)行研究，并且已取得了重大的研究進(jìn)展，篩選合成了多種能夠抑制病毒復(fù)制的siRNA、shRNA和miRNA序列。相信在不遠(yuǎn)的將來，RNAi技術(shù)一定會(huì)從實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)入臨床應(yīng)用，充分發(fā)揮其在疾病治療、預(yù)防等方面的作用，成功控制PRRSV感染將指日可待。

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中圖分類號(hào)：S818.9

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-1733（2016）04-0050-02

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31460662）

*通訊作者

收稿日期：（2016–01–21）