羅文武劉 姣朱元東劉貴軍于高水（魯抗舍里了藥業(yè)有限公司 山東 濟(jì)寧 272000 陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西 咸陽）

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重組卡介苗的應(yīng)用研究及進(jìn)展

羅文武①劉 姣②朱元東①劉貴軍①于高水①
（①魯抗舍里了藥業(yè)有限公司 山東 濟(jì)寧 272000 ②陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西 咸陽）

卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin Vaccine，BCG）是牛結(jié)核分枝桿菌的突變株。上世紀(jì)二十年代卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin Vaccine，BCG）被用于接種新生兒來預(yù)防結(jié)核病。在其安全性被確定后，卡介苗被在全世界范圍內(nèi)推廣應(yīng)用，是目前官方承認(rèn)的預(yù)防結(jié)核病最安全有效的疫苗［2］，是WHO推薦的，出生時(shí)預(yù)防接種的疫苗之一。到目前為止，卡介苗已經(jīng)在全球近200個(gè)國(guó)家和地區(qū)對(duì)將近40億的兒童進(jìn)行了免疫接種。隨著分子生物學(xué)技術(shù)水平的提高和基因工程技術(shù)的進(jìn)步，人們發(fā)現(xiàn)BCG不僅是是一種活疫苗，還易于接受外源基因的導(dǎo)入表達(dá)外源蛋白，這個(gè)重要發(fā)現(xiàn)為BCG的應(yīng)用開辟了新的機(jī)遇。隨后卡介苗做為疫苗活載體被人們逐漸重視?？ń槊缱鳛橐环N細(xì)胞內(nèi)寄生菌，接種到機(jī)體后，既可以刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫，也能刺激機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞免疫，是一類有廣泛前景的新疫苗。

1 重組卡介苗簡(jiǎn)介

1.1 重組卡介苗的優(yōu)點(diǎn)

rBCG是將外源基因?qū)隑CG內(nèi)，并利用BCG的活疫苗的特性，制成免疫機(jī)體后可產(chǎn)生針對(duì)不同抗原免疫應(yīng)答的疫苗。經(jīng)過近一個(gè)世紀(jì)的臨床應(yīng)用以來卡介苗的安全性和優(yōu)點(diǎn)逐漸顯現(xiàn)：（1）不受到母源抗體的干擾，免疫接種時(shí)間無限制；（2）免疫保護(hù)期長(zhǎng)，單次免疫產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可達(dá)5～50年；（3）卡介苗本身是一種免疫佐劑（4）生成成本低，生產(chǎn)技術(shù)簡(jiǎn)單，便于保存和運(yùn)輸；（5）免疫方式多樣可以口服靜脈注射和肌肉注射；（6）是一種免疫增強(qiáng)劑和免疫佐劑，能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生持久的體液免疫和特異的細(xì)胞免疫［2］；（7）卡介苗還易于接受外源基因的導(dǎo)入，可以通過改變啟動(dòng)子糾正表達(dá)不均衡的外源基因，進(jìn)而使得外源蛋白得以穩(wěn)定表達(dá)。因此卡介苗也是一種非常理想的疫苗活載體［3］。

1.2 卡介苗刺激機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答

機(jī)體產(chǎn)生的免疫應(yīng)答可大體分為兩種，特異性免疫和非特異性免疫。特異性免疫又有獲得性免疫和自然免疫。非特異性免疫又稱天然免疫?？ń槊缱鳛橐环N兼性細(xì)胞內(nèi)寄生菌，既能引起特異性和記憶性的獲得免疫，又能刺激機(jī)體產(chǎn)生非特異免疫應(yīng)答，這是很多外源微生物所無法比擬的?？ń槊缢碳C(jī)體產(chǎn)生的細(xì)胞免疫主要是由T細(xì)胞介導(dǎo)的。體內(nèi)巨噬細(xì)胞是卡介苗的主要宿主細(xì)胞。在抵抗卡介苗感染發(fā)揮主要作用的是CD4+和CD8+T細(xì)胞。卡介苗能夠被MHCII類分子進(jìn)行抗原加工遞呈給CD4+T細(xì)胞，進(jìn)而促使其分泌在抗卡介苗感染中起到重要作用的細(xì)胞因子IFN-γ。同時(shí)也能被MHCI識(shí)別，并提呈給CD8+T細(xì)胞然后直接識(shí)別溶解殺傷靶細(xì)胞［4］。構(gòu)成天然免疫的成份很多，主要包括吞噬細(xì)胞和體液殺菌成分如抗微生物肽、溶菌酶、補(bǔ)體等?？ń槊缒芤鸱翘禺愋悦庖叩脑蚱渚哂忻庖咦魟┗钚浴Ｑa(bǔ)體和抗原遞呈細(xì)胞表面的受體能夠識(shí)別BCG，從而使得卡介苗進(jìn)入吞噬細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行自我復(fù)制［5］。胞壁酰二肽是BCG細(xì)胞壁的刺激體熱激蛋白（HSP）表達(dá)特殊成分。熱激蛋白（HSP）含量升高可以使得機(jī)體天然免疫系統(tǒng)活化。MHCI類分子可以識(shí)別機(jī)體巨噬細(xì)胞攝取的HSP-肽復(fù)合物，激活CD8+T細(xì)胞的免疫應(yīng)答［6，7］。BCG可以間接刺激DC細(xì)胞發(fā)育成熟，從而加強(qiáng)抗原遞呈的能力。

2 重組卡介苗在疾病預(yù)防中的應(yīng)用

2.1 細(xì)菌rBCG疫苗

肺炎球菌蛋白A（PspA）是一種細(xì)胞表面蛋白，在所有的肺炎球菌菌株表面都能穩(wěn)定的表達(dá)，具有較好免疫原性。Langermann等［8］將PspA部分部分基因片段，構(gòu)建多個(gè)不同的載體，轉(zhuǎn)入到卡介苗內(nèi)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因分別以包漿蛋白、分泌蛋白以及嵌合輸出膜結(jié)合脂蛋白形式存在，所有的重組卡介苗均能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較高的抗體水平。血清學(xué)研究表明PspA血清有交叉免疫保護(hù)作用。Hess等［9］將李斯特菌融合核蛋白基因構(gòu)建重組質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)入卡介苗中，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，該重組卡介苗可以明顯的增強(qiáng)MHCI對(duì)可溶性蛋白的抗原提呈作用，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該融合蛋白的表達(dá)可促進(jìn)誘導(dǎo)刺激機(jī)體產(chǎn)生CD8+T細(xì)胞。Baumgart等［10］構(gòu)建能夠表達(dá)麻風(fēng)分枝桿菌18kD蛋白的重組卡介苗，實(shí)驗(yàn)表明，該疫苗可以刺激誘導(dǎo)抗體的產(chǎn)生以及淋巴細(xì)胞曾生應(yīng)答。Ohara等［11］將麻風(fēng)桿菌的Ag85A蛋白基因重組到卡介苗中來表達(dá)蛋白，免疫小鼠發(fā)現(xiàn)小鼠足墊中的麻風(fēng)桿菌繁殖率降低，抑菌效果比親本BCG更顯著。Nasoimento 等［12］［13］將百日咳毒素S1亞基基因轉(zhuǎn)入到卡介苗中，該重組卡介苗能表達(dá)S1PT蛋白。用rBCGS1PT免疫小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其能刺激機(jī)體產(chǎn)生Th1 型免疫反應(yīng)，可以保護(hù)小鼠抵抗腦內(nèi)百日咳桿菌的攻擊。

2.2 病毒rBCG疫苗

據(jù)報(bào)道，引起新生嬰兒死亡的主要原因之一是麻疹病毒感染。Zhu等［14］將麻疹病毒核蛋白（NP）基因全長(zhǎng)片段克隆，并導(dǎo)入卡介苗內(nèi)構(gòu)建rBCG（BCG-N），表達(dá)病毒蛋白。用麻疹病毒感染免疫接種過rBCG（BCG-N）的新生猴，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫該重組卡介苗不能阻止全身性的麻疹病毒感染，但是在新生猴體內(nèi)仍能檢測(cè)到NP蛋白的特異的淋巴細(xì)胞應(yīng)答，減輕了人工感染后的肺部炎癥。同時(shí)一些臨床癥狀例如鼻咽部分泌病毒排泄物的時(shí)間顯著縮短。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，接種rBCG（BCG-N）疫苗可以刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)麻疹病毒的T細(xì)胞免疫應(yīng)答，進(jìn)而減輕了病毒對(duì)肺部的傷害。目前認(rèn)為，HIV-1的主要抗原有在其他細(xì)菌系統(tǒng)很難表達(dá)的Gag、逆轉(zhuǎn)錄酶、聚合酶、Env蛋白gp 120和gp 41等。

2.3 寄生蟲rBCG疫苗

2.3.1 瘧原蟲 瘧疾是由瘧原蟲引起的急性、傳染性寄生蟲病，該病呈全球分布。Matsumoto等［15］于1998年將瘧原蟲（Plasmodium yoelii）的孢子蛋白（CSP）中的一段B細(xì)胞表位的基因片段和質(zhì)粒載體重組后轉(zhuǎn)入到BCG，該基因片段成功在BCG中表達(dá)出融合蛋白。用該重組卡介苗免疫小鼠，結(jié)果顯示能刺激機(jī)體產(chǎn)生較高的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫，進(jìn)而抵抗瘧疾紅內(nèi)期的感染，而且免疫保護(hù)期可長(zhǎng)達(dá)半年以上。以后的研究中發(fā)現(xiàn)了瘧疾重組卡介苗的免疫保護(hù)機(jī)制，即rBCG能刺激機(jī)體產(chǎn)生IFN-γ，繼而誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生在后期清除瘧疾起到重要作用的免疫球蛋白抗體IgG2a。以后將編碼P1yoeliiMSP-1羧基端月15000bp的基因片段重組到BCG中進(jìn)行蛋白表達(dá)，免疫小鼠后也能產(chǎn)生免疫應(yīng)答［16］。

2.3.2 利什曼原蟲 目前研究表明，LCR1基因和GP63基因是利什曼原蟲的重要保護(hù)性抗原。用重組LCR1蛋白免疫小鼠，可刺激機(jī)體T 細(xì)胞因子IFN-γ的分泌量上升，使得小鼠可以獲得部分免疫保護(hù)。Streit 等［19］將LCR1基因的一端編碼序列和pMV261穿梭載體進(jìn)行重組，重組的rBCG-LCR1卡介苗能表達(dá)與預(yù)期相符的融合蛋白，免疫印跡驗(yàn)證該目的蛋白具有良好的免疫原性。用該重組卡介苗皮下和腹腔注射免疫接種小鼠，然后進(jìn)行攻蟲實(shí)驗(yàn)，4周后解剖小鼠發(fā)現(xiàn)，皮下注射組小鼠的肝臟損傷明顯減輕，且能刺激小鼠產(chǎn)生Th1免疫應(yīng)答，但是腹腔注射免疫組未能產(chǎn)生理想的保護(hù)效果。

2.3.3 血吸蟲 Kremer等［20］構(gòu)建一種曼氏血吸蟲（Schistosoma mansoni）的重組卡介苗，這種疫苗是將谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（Sm28GST）基因片段克隆轉(zhuǎn)進(jìn)BCG中，結(jié)果這種重組卡介苗可以表達(dá)出具有酶活性的Sm28GST蛋白。這種重組蛋白可以被谷胱甘肽特異的識(shí)別。隨后將這株重組卡介苗免疫小鼠后，結(jié)果可以在小鼠體內(nèi)檢測(cè)到IgG1、IgG2a、IgG2b抗體亞型和中和抗體反應(yīng)。這些抗體的產(chǎn)生對(duì)血吸蟲的感染的保護(hù)性良好。通過靜脈注射、腹腔注射、皮下注射和鼻內(nèi)等免疫方式將重組卡介苗免疫小鼠，均能刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)。并且免疫效果隨免疫次數(shù)的增加而增強(qiáng)。后來又將重組卡介苗構(gòu)建成表達(dá)Sh28GST的重組體，并且發(fā)現(xiàn)該蛋白具有酶活性，免疫小鼠表現(xiàn)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答［21］。

2.3.4 肝片吸蟲 肝片吸蟲是一種寄生在動(dòng)物機(jī)體肝臟膽管內(nèi)能引起急性或慢性肝炎的寄生蟲。肝片吸蟲病呈世界性分布，對(duì)機(jī)體危害較大。目前研究表明FH3基因是肝片吸蟲主要的保護(hù)性抗原基因之一。周宇［22］在2003年篩選到肝片吸蟲的FH3抗原基因，并對(duì)其進(jìn)行研究，首先構(gòu)建pMV261-FH3重組穿梭質(zhì)粒，然后用電轉(zhuǎn)化的方式構(gòu)建重組卡介苗，經(jīng)過熱激誘導(dǎo)后檢測(cè)能表達(dá)與預(yù)期相符的相對(duì)分子質(zhì)量約為22000的融合蛋白。為今后的肝片吸蟲重組卡介苗的研究提供重要的理論依據(jù)。

2.3.5 雞球蟲 王秋悅［23］將篩選到的柔嫩艾美耳球蟲（E.tenella）膜內(nèi)絲氨酸蛋白酶Rhomboid基因重組到梭表達(dá)載體pMV261和整合表達(dá)載體pMV361中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒，用電轉(zhuǎn)化的方法將其導(dǎo)入卡介苗中，然后熱激誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)成功表達(dá)了具有抗原活性的Rhomboid。后期實(shí)驗(yàn)中，將兩種重組卡介苗經(jīng)多種方式免疫雛雞后用一定數(shù)量E.tenella卵囊進(jìn)行感染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組卡介苗有一定的免疫保護(hù)作用，抗球蟲指數(shù)高達(dá)174.6。同時(shí)，她用熒光蛋白（EGFP）對(duì)重組卡介苗pMV361-Rho株進(jìn)行標(biāo)記，免疫雛雞一周后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rhomboid基因在雞體內(nèi)各組織器官均有表達(dá)，表達(dá)量大約在免疫后14d達(dá)到最多，隨后逐漸下降，28d以后基本消失。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，為了增強(qiáng)免疫效果，將雞的白介素2基因和Rhomboid基因串聯(lián)，并構(gòu)建了聯(lián)合基因重組卡介苗，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，以滴鼻的免疫的pMV261-Rho-IL-2重組卡介苗效果最好，抗球蟲指數(shù)超過180。

2.3.6 弓形蟲 王洪法［24］［25］首先將弓形蟲ROP2 基因在大腸桿菌中進(jìn)行原核表達(dá)及免疫原性分析，發(fā)現(xiàn)該基因有較好的免疫原性。然后將ROP2基因和卡介苗穿梭表達(dá)載體pMV262以及整合表達(dá)載體 pOIP23H進(jìn)行重組，電轉(zhuǎn)化到卡介苗中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)可誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。經(jīng)靜脈注射和口服兩種方式將重組卡介苗免疫小鼠，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)免疫組血清細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2及CD4+、CD8+T 細(xì)胞與對(duì)照組比較差異顯著。靜脈注射免疫pMV262-ROP2重組卡介苗組小鼠的存活時(shí)間顯著延長(zhǎng)。

3 重組卡介苗的前景

走過80多年歷程的卡介苗是唯一用于預(yù)防結(jié)核病的疫苗。在預(yù)防人類結(jié)核病的中發(fā)揮著非常重要的作用。近十幾年以來國(guó)內(nèi)外研究者已經(jīng)證實(shí)，BCG作為活載體表達(dá)系統(tǒng)以成功誘導(dǎo)包括病毒、細(xì)菌、寄生蟲抗原基因以及細(xì)胞因子在內(nèi)的多種蛋白。如今，rBCG的研制引起了廣泛的關(guān)注，人們希望對(duì)rBCG的載體和選擇系統(tǒng)的穩(wěn)定方面進(jìn)行改進(jìn)，進(jìn)而使其在預(yù)防更多疾病方面發(fā)揮更出色的表現(xiàn)。但是目前，針對(duì)重組卡介苗需要解決的問題還很多。首先外源基因的導(dǎo)入能否改變其弱毒疫苗的性質(zhì)［26］。其二，BCG表達(dá)的蛋白缺少真核生物所具有的翻譯后的加工修飾以及糖基化、裝配等問題。再者，如何保證同時(shí)將多種外源基因?qū)隑CG時(shí)，各基因能協(xié)同高效的表達(dá)。相信伴隨著基因工程手段的不斷提高和分子生物學(xué)的發(fā)展，加上研究者們堅(jiān)持不懈的努力，rBCG疫苗在疾病的治療和預(yù)防方面有更出色的表現(xiàn)。

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中圖分類號(hào)：S852.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1007-1733（2016）04-0047-03

收稿日期：（2016–01–12）