黃向榮，李小玲，黃華偉，萬(wàn)譯文，曾春芳，陳湘藝，肖　維，李傳武（1.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南　長(zhǎng)沙　410153；.農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（長(zhǎng)沙），湖南　長(zhǎng)沙　410153；3.湖南省水產(chǎn)原種場(chǎng)，湖南　長(zhǎng)沙　410153；4.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南　常德　415000）

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孔雀石綠在鱖魚幼魚體內(nèi)的富集和消除規(guī)律

黃向榮1,2,4，李小玲1,2，黃華偉1,2，萬(wàn)譯文2，曾春芳2，陳湘藝2，肖維2，李傳武1,3,4
（1.湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所，湖南長(zhǎng)沙410153；2.農(nóng)業(yè)部漁業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心（長(zhǎng)沙），湖南長(zhǎng)沙410153；3.湖南省水產(chǎn)原種場(chǎng)，湖南長(zhǎng)沙410153；4.水產(chǎn)高效健康生產(chǎn)湖南省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南常德415000）

摘要：用0.5、1.0和2.0 mg/L的孔雀石綠（MG）藥浴人工繁養(yǎng)的鱖魚（Siniperca chuatsi）幼魚 [（1.30± 0.05）g、（4.6±0.2）cm ] 2 h后，再轉(zhuǎn)移至水泥池中微流水飼養(yǎng)，用HLPC-MS法跟蹤監(jiān)測(cè)鱖魚幼魚體內(nèi)孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠的殘留量。結(jié)果表明：藥浴至80～100 min時(shí)，孔雀石綠總量在鱖魚幼魚體內(nèi)的富集達(dá)到峰值；停止藥浴后15 min時(shí)，孔雀石綠總量明顯下降；停藥后6～16 d時(shí)孔雀石綠已基本代謝為隱色孔雀石綠；孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠在鱖魚幼魚體內(nèi)的殘留量分別于停藥后37、55 d時(shí)低于判定值1.0 μg/kg；在鱖魚幼魚體內(nèi)，隱色孔雀石綠的消除速度明顯低于孔雀石綠。

關(guān)鍵詞：鱖魚；孔雀石綠；隱色孔雀石綠；殘留；消除規(guī)律

孔雀石綠（Malachite green，MG）又名堿性綠，為有毒的三苯甲烷類化學(xué)物[1-2]，曾被用作化工染料，以及水產(chǎn)動(dòng)物水霉病、鰓霉病和小瓜蟲病等的殺菌劑[3]。MG及其代謝產(chǎn)物隱色孔雀石綠（Leucomalachite green，LMG）殘留時(shí)間長(zhǎng)，具有致癌、致畸和致突變等毒性[4]，歐美等國(guó)家和地區(qū)將其列入水產(chǎn)養(yǎng)殖禁用藥物，我國(guó)也于2002年5月將其列入“食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單”。但因孔雀石綠高效價(jià)廉，替代品少，仍有少數(shù)養(yǎng)殖和經(jīng)營(yíng)者在苗種、商品魚的養(yǎng)殖、運(yùn)輸和銷售等環(huán)節(jié)中違規(guī)使用或誤用，嚴(yán)重影響水產(chǎn)品的質(zhì)量安全。因此，研究水產(chǎn)苗種中孔雀石綠殘留監(jiān)測(cè)及消除規(guī)律尤為重要。

鱖魚（Siniperca chuatsi）是我國(guó)的特色優(yōu)質(zhì)經(jīng)濟(jì)魚類品種。近年來(lái)常有鱖魚體內(nèi)檢測(cè)出孔雀石綠的報(bào)道。目前，已有孔雀石綠在鯽魚（Carassius auratus）[5]、歐洲鰻鱺（Anguilla anguilla）[6]、大菱鲆（Psetta maxima)）[7]、羅非魚（Oreochromisco）[8]、青石斑魚（Epinephelus awoara）[9]、斑點(diǎn)叉尾鮰（Ietalurus punetaus）[10]以及雜交鱧（Channa maculata♀×Channa argus♂）[11]等魚類體內(nèi)代謝消除的研究，而有關(guān)鱖魚體內(nèi)孔雀石綠消除規(guī)律研究卻鮮有報(bào)道。筆者以鱖魚幼魚為對(duì)象，用不同濃度的孔雀石綠對(duì)鱖魚進(jìn)行藥浴，然后轉(zhuǎn)入微流水飼養(yǎng)，研究藥浴期間孔雀石綠在鱖魚體內(nèi)的富集以及停藥后孔雀石綠及其代謝物隱色孔雀石綠在鱖魚幼魚體內(nèi)的消除規(guī)律，以期為職能部門加強(qiáng)藥物監(jiān)管以及食品安全溯源提供理論和技術(shù)支持。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)用魚

鱖魚幼魚2100尾，由湖南省澧縣柳耳壩魚類苗種繁育場(chǎng)提供，為人工繁殖的翹嘴鱖魚苗種，體質(zhì)健壯，無(wú)殘缺及傷病，初始體質(zhì)量為（1.3± 0.05）g，體長(zhǎng)為（4.6±0.2）cm，無(wú)MG及LMG殘留。幼魚暫養(yǎng)2 d，暫養(yǎng)期間不投餌。

1.2試劑與儀器

孔雀石綠（MG）、隱色孔雀石綠（LMG）標(biāo)準(zhǔn)品及其同位素內(nèi)標(biāo)氘代孔雀石綠（D5-MG）、氘代隱色孔雀石綠（D6-LMG），純度大于98%，均購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrensorfer公司；乙腈和甲醇，色譜純，德國(guó)MERCK公司；中性氧化鋁柱，500 mg/3mL，美國(guó) Supelclean；乙酸銨為分析純，實(shí)驗(yàn)用水由Millipore純水系統(tǒng)所制。

試驗(yàn)儀器有Thermo TSQuatum液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀、配有電噴霧（ESI）離子源、超純水儀、高速冷凍離心機(jī)（日本日立公司）、超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司）、平行蒸發(fā)儀（瑞士Buchi）、FA25均質(zhì)器（德國(guó)Fluko公司）、精密電子天平（梅特勒-托利多稱重設(shè)備系統(tǒng)有限公司）、漩渦振蕩器、固相萃取裝置（美國(guó)Supelco公司）等。

1.3養(yǎng)殖條件

試驗(yàn)于湖南省水產(chǎn)原種場(chǎng)繁育基地進(jìn)行，試驗(yàn)池4個(gè)，面積200 m2。所有養(yǎng)殖池排灌方便，試驗(yàn)前一周用生石灰消毒，經(jīng)測(cè)試安全后投入使用。試驗(yàn)用水體無(wú)MG及LMG殘留。采用微流水養(yǎng)殖，日換水量約為40%，保持水質(zhì)清新，水溫22.0～31.5℃，溶氧不低于5 mg/L，pH值為6.42～6.86，透明度為40～50 cm。

1.4試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1試驗(yàn)分組及給藥試驗(yàn)設(shè)3個(gè)試驗(yàn)組及1個(gè)空白對(duì)照組，每組鱖魚各500尾。試驗(yàn)組分別用0.5、1.0、2.0 mg/L的孔雀石綠溶液藥浴120 min；對(duì)照組鱖魚不使用孔雀石綠藥浴。

1.4.2樣品采樣與制備藥浴期間分別在藥浴后20、40、60、80、100、120 min采樣。待藥浴2 h后，立即撈出幼魚，分別轉(zhuǎn)入對(duì)應(yīng)的水泥池中微流水養(yǎng)殖。分別于停藥后15 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、16 h、20 h、1 d、2 d、4 d、6 d、8 d、12 d、16 d、20 d、25 d、30 d、35 d、40 d、45 d、50 d、55 d、60 d、65 d、70 d、75 d、80 d采樣。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各組隨機(jī)采集 2個(gè)平行樣，每平行樣幼魚5～8尾，置于-20℃速凍保存。制樣時(shí)，先將每份樣品自然解凍，待去除鱖魚頭部及鰭條后，再將剩余組織勻漿混勻，于-20℃條件下保存?zhèn)溆谩Ｃ拷M檢測(cè)結(jié)果取平行樣品測(cè)定值的平均值。

1.5樣品前處理

參照GB/T 19857-2005[12]進(jìn)行。稱取勻漿后鱖魚樣品（5.00±0.05）g于50 mL離心管中，加入1.00 mL混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入11 mL乙腈，經(jīng)超聲波振蕩提取5 min，均質(zhì)提取30 s，以8 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中；用11 mL乙腈重復(fù)提取1次，上清液合并至25 mL比色管中，用乙腈定容至25.0 mL，搖勻備用。移取5.00 mL樣品溶液加至已活化的中性氧化鋁柱上（使用前用5 mL乙腈活化），用10 mL玻璃離心管接收流出液，用4 mL乙腈洗滌中性氧化鋁柱，收集全部流出液，45 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，殘液中準(zhǔn)確加入2.00 mL體積比1∶1乙腈-乙酸銨（5 mmol/L），超聲振蕩1 min，樣液經(jīng)0.22 μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.6色譜條件

色譜柱：Thermo Scientific Hypersil GOLD C18(2.1 mm×100 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃，流動(dòng)相A為乙腈；B為5 mmoL/L的乙酸銨溶液（含體積分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸）；進(jìn)樣體積：10 μL；流速：0.35 mL/min，流動(dòng)相梯度洗脫條件如表1所示。質(zhì)譜條件如表2所示。

表1　流動(dòng)相梯度洗脫條件Tab.1 The gradient elution conditions of mobile phase

表2　質(zhì)譜參數(shù)條件Table 2　MS parameter conditions

2　結(jié)果與分析

2.1孔雀石綠及隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)色譜圖

在上述色譜條件下，MG和 LMG標(biāo)準(zhǔn)溶液基線平穩(wěn)，峰形良好，無(wú)干擾峰，其保留時(shí)間（Retention time,RT）分別為5.71、7.85 min，分別如圖1、2所示。

圖1　孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液提取離子流色譜圖（25 ng/mL）Fig.1　Extraction ion chromatograms of malachite green standard solution（25 ng/mL）

圖2 隱色孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)溶液提取離子流色譜圖（25 ng/mL）Fig.2　Extraction ion chromatograms of leucomalachite green standard solution（25 ng/mL）

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍

在質(zhì)量濃度為1～25 ng/mL范圍內(nèi)，以峰面積（Y）與質(zhì)量濃度（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，MG和LMG的標(biāo)準(zhǔn)方程分別為Y=33.14 X + 2.01和Y=23.54 X + 63.88，相關(guān)系數(shù)r分別為0.999 4和0.999 6。

2.3回收率與精密度

在加標(biāo)水平2～10 μg/kg時(shí)，MG和LMG的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表3。

表3　空白樣品加標(biāo)回收率和精密度Table 3　Recoveries of spiked samples and RSD

2.4藥浴期間鱖魚幼魚體內(nèi)孔雀石綠和隱色孔雀石綠富集變化

對(duì)供試鱖魚幼魚用孔雀石綠藥浴2 h期間，在藥浴20 min后，MG在鱖魚幼魚體內(nèi)富集，并迅速轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)MG，0.5、1.0、2.0 mg/L組鱖魚幼魚體內(nèi)的MG質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別達(dá)20.9、34.7、55.4 μg/kg；同時(shí)，LMG質(zhì)量分?jǐn)?shù)則分別達(dá)116.4、338.9、405.2 μg/kg。隨藥浴時(shí)間的延長(zhǎng)，MG和LMG的殘留量呈逐漸升高趨勢(shì)，具體表現(xiàn)為：0.5 mg/L組在藥浴100 min時(shí)，MG殘留量達(dá)峰值為78.8 μg/kg，LMG在120 min時(shí)，其殘留量達(dá)峰值為722.7 μg/kg；1.0 mg/L組在藥浴80 min時(shí)，MG殘留達(dá)峰值81.1 μg/kg，LMG 在100 min時(shí)殘留達(dá)峰值1 196.7 μg/kg；2.0 mg/L組在藥浴80 min時(shí)，MG殘留量達(dá)峰值97.9 μg/kg，LMG在藥浴100 min時(shí)達(dá)峰值為1 456.9 μg/kg（表4）。

表4 藥浴期間MG和LMG在鱖魚幼魚體內(nèi)的富集濃度Table 4　Enrichment concentration of MG and LMG in Siniperca chuatsi Parr during exposure process with malachite green μg/kg

2.5停藥后鱖魚幼魚體內(nèi)孔雀石綠和隱色孔雀石綠殘留量變化

停止藥浴后，將供試鱖魚幼魚轉(zhuǎn)入水泥池微流水養(yǎng)殖。總體而言，鱖魚幼魚轉(zhuǎn)入清水后，其體內(nèi)MG和LMG的代謝呈前期消除速率慢，中期加快，后期逐漸變緩的態(tài)勢(shì)（表5）。不同組間，藥浴濃度越高，MG和LMG在鱖魚幼魚體內(nèi)的殘留量越高，代謝時(shí)間越長(zhǎng)，但鱖魚幼魚體內(nèi)MG的代謝速度均明顯快于LMG，表現(xiàn)為0.5、1.0、2.0 mg/mL組幼魚體內(nèi)MG分別于停藥后6、12、16 d時(shí)已檢測(cè)不出，而LMG分別至37、45、55 d時(shí)而低于方法檢出限。

表5　停藥后MG和LMG在鱖魚幼魚體內(nèi)的殘留量Table 5　Residual quantity of MG and LMG in Siniperca chuatsi parr after the medicated bath treatment with malachite green　　　　　　　　　　　μg/kg

續(xù)表　5(Con tinued)

3　討 論

3.1藥浴期間鱖魚幼魚體內(nèi)孔雀石綠和隱色孔雀石綠富集變化

研究表明，孔雀石綠及其代謝物對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的毒性不僅與水產(chǎn)動(dòng)物種類和規(guī)格、暴露時(shí)間、用藥濃度以及水溫相關(guān)，而且與水質(zhì)環(huán)境，尤其是pH值、硬度和溶解氧有關(guān)[13]。同時(shí)，MG進(jìn)入動(dòng)物體內(nèi)后，通過(guò)生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化成脂溶性主要代謝產(chǎn)物L(fēng)MG并在組織中蓄積[14]，其殘留毒性比MG更強(qiáng)。本試驗(yàn)條件下，供試鱖魚幼魚用孔雀石綠藥浴2 h期間，在藥浴20 min后，MG在鱖魚幼魚體內(nèi)富集，并迅速轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)MG，而且藥浴濃度越高，MG和LMG在鱖魚體內(nèi)的富集也相應(yīng)越高，其殘留量達(dá)到峰值所需時(shí)間也相對(duì)較短，這與高露姣等[6]對(duì)歐洲鰻鱺以及楊賢慶等[8]對(duì)羅非魚的研究結(jié)果較為一致。

此外，彭景書等[9]分別研究了不同藥浴濃度及藥浴時(shí)間兩種作用方式下MG在青石斑魚體內(nèi)的富集和消除規(guī)律，結(jié)果顯示，用0.10、0.15、0.20 mg/L的孔雀石綠浸泡青石斑魚5 h，隨著藥浴濃度的增加，MG的殘留水平也增高；同時(shí)，藥浴濃度相同條件下，連續(xù)藥浴5 h組較3次間斷藥浴15 min組青石斑魚體內(nèi)的MG含量高，這與本研究的隨著用藥濃度的增加及藥浴時(shí)間的延長(zhǎng)，MG和LMG的殘留量也逐漸升高的結(jié)果較為相似。上述研究也進(jìn)一步表明，MG和LMG在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的富集量與用藥濃度和用藥時(shí)間成正相關(guān)。

3.2停藥后鱖魚幼魚體內(nèi)孔雀石綠和隱色孔雀石綠殘留量變化

跟蹤檢測(cè)藥浴期間和停藥后供試鱖魚幼魚體內(nèi)的MG和LMG含量，結(jié)果表明，在藥浴80～100 min內(nèi)，各試驗(yàn)組鱖魚體內(nèi)的MG均已達(dá)到峰值，藥浴100～120 min內(nèi)各組LMG的殘留量達(dá)到峰值；同時(shí)，鱖魚幼魚轉(zhuǎn)入清水后，其體內(nèi)MG和LMG的殘留量均會(huì)出現(xiàn)一個(gè)明顯的回落，并且總體呈現(xiàn)出前期代謝消除速率慢，中期加快，后期減緩的態(tài)勢(shì)，這與彭景書等[9]的青石斑魚肌肉組織中MG的消除規(guī)律較為一致。

諸多研究表明，MG在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的代謝速率明顯快于LMG。在養(yǎng)殖魚類方面，邱緒建等[5]研究表明，鯽魚在0.2 mg/L孔雀石綠藥浴1 h轉(zhuǎn)入清水后20 d 肌肉中檢測(cè)不出MG，而LMG則在30 d后仍有17.7 μg/kg的殘留；曲志娜等[7]以800 ng/mL 的MG溶液藥浴大菱鲆1 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MG消除至檢出限以下需20.3 d，LMG則需281.9～356.7 d；楊賢慶等[8]研究指出，用0.5、2.0 mg/L 的MG藥浴羅非魚1 h，60 d后各試驗(yàn)組均檢測(cè)不出MG，但LMG仍有檢出。此外，楊金蘭等[15]以0.15 mg/L的MG溶液藥浴凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）幼蝦2 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MG代謝消除完畢需3 d，而LMG則需9 d。另外，黃金田等[16]用2 mg/L MG溶液藥浴中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）1 h后發(fā)現(xiàn)，藥浴后34 d MG 及LMG在中華絨螯蟹體內(nèi)的殘留量均低于檢測(cè)限，MG的代謝速率快于LMG。本文研究表明，各試驗(yàn)組分別于停藥后6、12、16 d時(shí)MG殘留量低于檢測(cè)限，而LM分別至37、45、55 d時(shí)方未檢出，這與上述研究結(jié)果基本一致，代謝時(shí)間不同可能與供試對(duì)象種類、規(guī)格、用藥時(shí)間與方式、水體環(huán)境以及飼養(yǎng)管理等因素有關(guān)。

本研究方案設(shè)計(jì)、鱖魚幼魚養(yǎng)殖日常管理得到了中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院王群博士、湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所伍遠(yuǎn)安研究員、湖南省水產(chǎn)原種場(chǎng)曾國(guó)清副研究員、李紹明副研究員和澧縣柳耳壩魚類苗種繁育場(chǎng)麻和才等同志的大力幫助，謹(jǐn)致謝忱。

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（責(zé)任編輯：劉慶穎）

Accumulation and Elimination of Metabolic Regularity of Malachite Green in Siniperca chuatsi Parr

HUANG Xiang-rong1,2,4,LI Xiao-ling1,2,HUANG Hua-wei1,2,WAN Yi-wen2,ZENG Chun-fang2,CHEN Xiang-yi2,XIAO-wei2,LI Chuan-wu1,3,4
（1.Fishery Science Research Institute of Hunan Province,Changsha 410153,China; 2.Fishery Products Quality Supervision and Inspection with Test Center of the Ministry of Agriculture in Changsha,Changsha 410153,China; 3.The Aquatic Seed Farm of Hunan Province,Changsha 410153,China; 4.Collaborative Innovation Center for Efficient and Health Production of Fisheries in Hunan Province,Changde 415000,China）

Abstract:The artificial breeding Siniperca chuatsi Parr,with body weight(1.30±0.05)g,body length(4.6±0.2)cm,were bathed for two hours malachite green solution with concentrations of 0.5,1.0 and 2.0mg/L,and then transferred to the cement ponds that feeding by micro flowing water.During artificial cultivation period,high performance liquid hromatography-mass spectroscopy(HLPC-MS)was employed to monitor the residue of malachite green and its metabolite leucomalachite green in Siniperca chuatsi Parr that by periodic sampling.The results showed that the total amount of malachite green accumulated in S.chuatsi reached the peak value when medicated bath for 80–100 min.Besides,the total amount of malachite green decreasedbook=52,ebook=55significantly when the time reached 15 minutes after the medicated bath by micro flow feeding.In addition,the malachite green in S.chuatsi were basically metabolized into leucomalachite green when the time reached six to sixteen days after the medicated bath.Moreover,the residual quantity of malachite green and its metabolite leucomalachite green in S.chuatsi were lower than the decision value(1.0 μg/kg)when the time reached thirty-seven and fifty-five days,respectively,after the medicated bath.At the same time,the metabolic rate of leucomalachite green in Siniperca chuatsi Parr was obviously slower than that of malachite green.

Key words:Siniperca chuatsi; malachite green; leucomalachite green; residual; eliminate metabolic regularity

通信作者：李小玲（1976－），女，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事水產(chǎn)品質(zhì)量安全及漁業(yè)生態(tài)環(huán)境監(jiān)測(cè)方面的研究，E-mail:hns-11@126.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家水產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)基金項(xiàng)目(2011C008)；湖南省養(yǎng)殖業(yè)科研指導(dǎo)項(xiàng)目(201115)；長(zhǎng)沙市基礎(chǔ)性研究與軟科學(xué)資金專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目（K1308009-31）

收稿日期：2015-06-30

doi:10.3969/j.issn.1673-9159.2016.01.009

中圖分類號(hào)：S942.2+.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1673-9159（2016）01-0051-06

第一作者：黃向榮（1964－），男，副研究員，主要從事水產(chǎn)品質(zhì)量安全及漁業(yè)生態(tài)環(huán)境方面的研究。