周　維，湯菊芬，高增鴻，甘　楨，簡紀(jì)常，吳灶和，丁　燏

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東　湛江　524088；2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東　湛江　524088；3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東　廣州　510225）

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哈維氏弧菌qnr基因的克隆及原核表達(dá)條件優(yōu)化

周維1,2，湯菊芬1,2，高增鴻1，甘楨1,2，簡紀(jì)常1,2，吳灶和2,3，丁燏1,2

（1.廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東湛江524088；2.廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東湛江524088；3.仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，廣東廣州510225）

摘要：根據(jù)GenBank中公布的哈維氏弧菌qnr基因序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增哈維氏弧菌qnr 序列，將其插入pET-32a質(zhì)粒，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32-qnr，并對誘導(dǎo)溫度、時間、IPTG濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，哈維氏弧菌qnr全長651 bp，編碼216個氨基酸；重組蛋白優(yōu)化條件為于28 ℃、IPTG濃度為0.05 mmol/L條件下誘導(dǎo)6 h。關(guān)鍵詞：哈維氏弧菌；qnr基因；原核表達(dá)；優(yōu)化

哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）隸屬于弧菌科（Vibrionaeeae），弧菌屬（Vibrio），是一種嗜鹽性革蘭陰性菌，彎桿狀，極生單鞭毛[1-2]，主要分布于海洋環(huán)境和海洋生物體中，是多種海洋魚類和無脊椎動物的條件致病菌[3-4]，在對蝦幼體階段危害尤為嚴(yán)重，曾導(dǎo)致斑節(jié)對蝦、凡納濱對蝦幼體大量死亡[5-7]，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。目前，國內(nèi)弧菌病的防治主要依賴于抗生素和化學(xué)藥物，喹諾酮類藥物在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用廣泛，水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中的細(xì)菌對此類藥物的耐藥性日趨顯著[8-10]，且部分耐藥菌可將其耐藥基因或耐藥質(zhì)粒轉(zhuǎn)移給其他菌株，甚至通過食物鏈傳遞而威脅人類健康[11-12]。1998年，在細(xì)菌質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)可水平傳播的喹諾酮類耐藥基因qnr[13]，其編碼的蛋白可保護(hù)喹諾酮類藥物的作用靶酶（DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV），從而降低細(xì)菌對此類藥物敏感性。隨后在多種細(xì)菌的染色體和質(zhì)粒上發(fā)現(xiàn)了一系列qnr基因家族[14-21]，并有很多證據(jù)支持水生來源的微生物是質(zhì)粒上qnr的最初來源，其中包括弧菌[15-16,20]。qnr基因的廣泛分布和多變異性暗示有更多qnr基因尚待發(fā)現(xiàn)。

隨著基因測序技術(shù)的進(jìn)步和推廣，許多細(xì)菌的基因組已經(jīng)完成測序，目前，在水生細(xì)菌哈維氏弧菌的全基因組中也發(fā)現(xiàn)了qnr相似基因，但尚無其功能和作用的研究報道，本實(shí)驗(yàn)首次從哈維氏弧菌基因組中擴(kuò)增出qnr基因，并構(gòu)建重組表達(dá)菌株，對融合蛋白表達(dá)進(jìn)行了優(yōu)化，為進(jìn)一步研究哈維氏弧菌染色體上qnr基因編碼蛋白的特性和功能，以及細(xì)菌對喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株和載體哈維氏弧菌ZJ0603分離自廣東省湛江海域患病紅笛鯛（Lutjanus sanguineus），分離鑒定后由廣東省水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病原生物學(xué)及流行病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。克隆載體pMD18-T購自TaKaRa公司，表達(dá)載體pET-32a、大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α以及表達(dá)菌株BL21(DE3)均由該實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2主要試劑ExTaq DNA聚合酶，r Taq DNA聚合酶，限制性核酸內(nèi)切酶BamH I、 Xho I，T4連接酶購自TaKaRa公司。細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購自賽默飛世爾科技(Thermo Fisher Scientific)公司。氨芐西林（Amp+）、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）購自上海生工有限公司。考馬斯亮藍(lán)快速染色液購自天根生化科技（北京）有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2方法

1.2.1哈維氏弧菌菌株的活化及基因組DNA的提取將-

80 ℃保存的哈維氏弧菌ZJ0603接種于TSA平板上，于28 ℃恒溫生化培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18 h后挑取單菌落接種于含20 mg/mL NaCl 的TSB液體培養(yǎng)基，于28 ℃條件下振蕩培養(yǎng)12～16h，收集菌液2～5 mL于離心管中，并參照試劑盒說明書提取細(xì)菌DNA。

1.2.2qnr基因的擴(kuò)增根據(jù)GenBank上哈維氏弧菌全基因組（登錄號CP009468.1）預(yù)測的喹諾酮類耐藥基因qnr序列，通過primer 5.0設(shè)計(jì)上游引物QF：5'-CGCGGATCCA TGATTAAGACCGATCTC A-3'；下游引物QR:5'-CCGCTCGAGCTAAATAAC GATCAGGCCAA-3'，下劃線部分分別為BamH I和Xho I酶切位點(diǎn)及其保護(hù)堿基。以1.2.1中提取的DNA為模板，用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增目的基因片段（PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，55 ℃40 s，72 ℃ 60 s，35個循環(huán)；72℃ 10 min）。將純化后PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)，在含100 μg/mL Amp+的LB平板上培養(yǎng)10～14 h，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，并將陽性克隆送至上海生物工程有限公司測序，并用BLAST分析比對序列。

1.2.3表達(dá)載體的構(gòu)建提取測序正確的重組質(zhì)粒pMD18-qnr和表達(dá)質(zhì)粒pET-32a，用BamH I、Xho I于37 ℃恒溫水浴鍋中酶切2 h，回收目的條帶和載體，并用T4連接酶連接10 h后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α。通過含氨芐的LB抗性平板篩選并結(jié)合菌落PCR，挑選陽性克隆送測。提取陽性克隆重組質(zhì)粒pET32-qnr轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)，同樣挑選陽性克隆送測。

1.2.4融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將測序正確的含重組質(zhì)粒的表達(dá)菌株接種于終濃度為100 μg/mL Amp+的LB液體培養(yǎng)基，當(dāng)D(600 nm)為0.4～0.6時，加IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，37 ℃條件下誘導(dǎo)5 h后收集細(xì)菌，提取蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，同時以未誘導(dǎo)的含重組質(zhì)粒pET32-qnr的表達(dá)菌株及含空質(zhì)粒pET-32a的BL21(DE3)表達(dá)菌株誘導(dǎo)前后作對照。

1.2.5原核表達(dá)條件優(yōu)化將構(gòu)建成功的重組表達(dá)菌株從溫度、時間、IPTG濃度3個方面進(jìn)行表達(dá)條件優(yōu)化。

1）溫度。在28、37 ℃條件下（IPTG終濃度為0.5 mmol/L）誘導(dǎo)5 h，分別收集10 mL菌液后置于冰上進(jìn)行超聲破碎，程序?yàn)椋汗β?00 W，超聲5 s，間隔5 s，超聲破碎約15 min至菌液澄清。取離心后的菌體裂解液的上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2）時間。其他條件不變，在誘導(dǎo)后的1、2、3、4、5、6、7 h分別收集菌體，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

3）IPTG濃度。其他條件不變，在 IPTG濃度為0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mmol/L下誘導(dǎo)，分別處理菌體，進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2　結(jié)果與分析

2.1目的基因 PCR擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增到一長約600 bp的條帶，而未加DNA模板的陰性對照未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶（圖1），菌落PCR的擴(kuò)增結(jié)果與目的條帶大小相符（圖1）。經(jīng)測序，擴(kuò)增的基因開放閱讀框（ORF）為651 bp，編碼216個氨基酸，BLAST比對結(jié)果表明，與哈維氏弧菌ATCC33843的Qnr編碼氨基酸序列同源性為99%，與霍亂弧菌（Vibrio cholerae）染色體上QnrB1（EKM30619.1）的同源性為96%，與副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）Qnr（WP_005482928.1）同源性為78%，具有Qnr蛋白特有的五肽重復(fù)序列。將該序列提交至GenBank，登錄號為KT633378。根據(jù)推導(dǎo)的Qnr氨基酸序列，預(yù)測其分子質(zhì)量為24.5 ku，理論等電點(diǎn)為4.75。

圖1　qnr基因PCR擴(kuò)增和菌落PCR鑒定Fig.1　Cloning and colony identification by PCR of qnr gene

2.2原核表達(dá)載體的構(gòu)建

提取陽性菌落的重組質(zhì)粒pMD18-qnr，雙酶切鑒定結(jié)果如圖2。圖2可見，BamH I和Xho I雙酶切pMD18-qnr后獲得兩條帶，其中目的條帶與直接擴(kuò)增的qnr條帶大小一致，經(jīng)測序比對證實(shí)為qnr目標(biāo)基因序列，表明qnr的克隆載體構(gòu)建成功?；厥漳康钠闻c雙酶切后pET-32a 連接、轉(zhuǎn)化后，同樣挑選陽性菌落進(jìn)行雙酶切鑒定，得到兩個片段（圖2），測序未發(fā)現(xiàn)有突變及錯配現(xiàn)象，說明pET32-qnr表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.3融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將測序正確的pET32-qnr重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞后，在37℃條件下經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)5 h，得到分子質(zhì)量約為42.5 ku的融合蛋白（圖3），其中預(yù)測的Qnr分子質(zhì)量為24.5 ku，pET32a表達(dá)的標(biāo)簽蛋白約為18 ku（圖3）。未誘導(dǎo)的菌及誘導(dǎo)的含空質(zhì)粒的菌均沒有出現(xiàn)目的條帶，說明融合蛋白成功表達(dá)。

圖2　qnr基因克隆載體及原核表達(dá)載體的鑒定Fig.2　Identification of cloning and prokaryotic expression vector of qnr

圖3　融合蛋白的原核表達(dá)Fig.3　Prokaryotic expression of pET32-qnr recombinant protein

2.4原核表達(dá)條件優(yōu)化

圖4表明，在37℃誘導(dǎo)條件下，目的蛋白主要存在于菌體裂解液的沉淀中，在菌體裂解液上清中含量極低，在28℃誘導(dǎo)條件下，目的蛋白在菌體裂解液沉淀和上清中均有表達(dá)，且表達(dá)量高于37℃下的表達(dá)量。這說明目的蛋白Qnr的最佳誘導(dǎo)溫度是28℃，主要以包涵體形式存在。時間優(yōu)化結(jié)果（圖4）表明，隨著誘導(dǎo)時間的增加蛋白表達(dá)量隨之增加，誘導(dǎo)6 h時表達(dá)量最高，之后蛋白表達(dá)量開始下降，因此，目的蛋白Qnr的最佳誘導(dǎo)時間是6 h。圖4可見，用0.05～1.00 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的目的蛋白表達(dá)量均較高。由于 IPTG具有細(xì)胞毒性，高濃度IPTG反而會妨礙細(xì)菌生長，因此最佳誘導(dǎo)濃度定為0.05 mmol/L。

圖4　融合蛋白誘導(dǎo)條件的優(yōu)化Fig.4 The optimization inducing conditions of the pET32-qnr fusion protein

3　討 論

養(yǎng)殖水體細(xì)菌及噬菌體種類、數(shù)量繁多，成為耐藥基因孕育和傳播的主要溫床。一些由細(xì)菌染色體介導(dǎo)的耐藥基因可通過轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因重組等方式進(jìn)行水平傳播，造成了海洋細(xì)菌耐藥機(jī)制的多樣性和傳播途徑的復(fù)雜性，抗生素的濫用促使細(xì)菌耐藥性的傳播和擴(kuò)散速度更加廣泛和迅速[22]。因此，研究耐藥基因的來源和特征對于耐藥菌的預(yù)防和控制很有必要。對于臨床耐藥菌中質(zhì)粒上qnr基因的起源和進(jìn)化研究表明，質(zhì)粒上的qnr基因很可能源自水產(chǎn)細(xì)菌的染色體，且通過水平傳播而來[14]。有學(xué)者[15]克隆了海洋中創(chuàng)傷弧菌Vibrio vulnificus、副溶血弧菌V.parahaemolyticus等參考菌株染色體上的qnr相似基因，分析其與腸桿菌中質(zhì)粒上QnrA、QnrB 和QnrS蛋白的同源性為40%～67%，并在大腸桿菌里表達(dá)，結(jié)果含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌對喹諾酮類藥物的敏感性均有所降低，表明水環(huán)境中的弧菌科很可能是喹諾酮耐藥蛋白Qnr的儲藏庫，弧菌科中已知的qnr相似序列有助于發(fā)現(xiàn)其他細(xì)菌中質(zhì)粒介導(dǎo)的新型qnr基因。之后用同樣的方法又發(fā)現(xiàn)燦爛弧菌（V.splendidus）是質(zhì)粒上QnrS家族的來源[16]。Sanchez等[17]在宏基因組里找到了多種水產(chǎn)細(xì)菌染色體的潛在qnr基因，并證實(shí)了嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）染色體上Smqnr編碼的蛋白為喹諾酮耐藥蛋白。本研究在海洋中常見的條件致病菌哈維氏弧菌的基因組里也發(fā)現(xiàn)了潛在的qnr基因，并通過序列分析發(fā)現(xiàn)其同源性與霍亂弧菌QnrB1（EKM30619.1）和副溶血弧菌Qnr(WP_005482928.1)同源性很高，分別為98%和78%，且具有五肽重復(fù)序列，與已證實(shí)的Qnr蛋白的結(jié)構(gòu)特征相符，說明哈維氏弧菌同其他弧菌一樣，其染色體上的qnr基因是一種潛在的可水平傳播的耐藥基因。

隨著越來越多qnr基因的發(fā)現(xiàn)，對Qnr蛋白結(jié)構(gòu)的研究也進(jìn)一步深入。已克隆、表達(dá)、純化嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）的AhQnr，并獲得晶體結(jié)構(gòu)，找出其與DNA促旋酶相互作用的功能結(jié)構(gòu)域，揭示了革蘭陰性細(xì)菌中Qnr蛋白和DNA促旋酶相互作用的一種普遍機(jī)制[19]。為獲得哈維氏弧菌的Qnr蛋白，本研究擴(kuò)增了哈維氏弧菌染色體上qnr基因，得到一段長為651 bp的序列，并將其在大腸桿菌里表達(dá)，獲得帶有標(biāo)簽蛋白的融合蛋白。選用的表達(dá)系統(tǒng)為大腸桿菌pET32表達(dá)系統(tǒng)，載體含有噬菌體T7啟動子，可在含有T7噬菌體RNA聚合酶基因（位于λ 噬菌體DE3區(qū)）的BL21(DE3)菌株中表達(dá)外源蛋白，具有轉(zhuǎn)化效率高、生長繁殖快、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)[23-24]。此外，重組蛋白的表達(dá)水平還與誘導(dǎo)條件有關(guān)，如溫度、誘導(dǎo)時間和IPTG濃度等[25]。為提高表達(dá)水平，優(yōu)化此3方面的表達(dá)條件，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低溫條件下獲得的蛋白較多，且更易獲得活性蛋白，這可能是由于低溫可降低細(xì)菌生長速度，增加重組質(zhì)粒拷貝數(shù)，最終增加融合蛋白的表達(dá)量，且低溫有助于蛋白正確折疊，高溫下易形成包涵體。本研究中，在誘導(dǎo)6 h后蛋白表達(dá)量最高，之后隨著誘導(dǎo)時間增加，蛋白表達(dá)量反而下降，這說明誘導(dǎo)時間并非越長越好。原因可能是隨著誘導(dǎo)時間延長，細(xì)菌次生代謝產(chǎn)物增多，培養(yǎng)基營養(yǎng)物質(zhì)大量消耗，不利于外源蛋白的積累。而IPTG濃度對重組蛋白的表達(dá)量影響不大，在低濃度（0.05 mmol/L）下即可獲得大量蛋白。最終確定的表達(dá)重組蛋白的最佳條件為：在28 ℃、IPTG濃度為0.05 mmol/L條件下誘導(dǎo)6 h。所得哈維氏弧菌Qnr蛋白為進(jìn)一步研究蛋白純化，蛋白的結(jié)構(gòu)和功能以及細(xì)菌的耐藥機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為發(fā)現(xiàn)新型的喹酮類耐藥基因和蛋白提供一定依據(jù)。

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（責(zé)任編輯：劉慶穎）

Cloning and Optimization of Prokaryotic Expression of Quinolone Resistance Gene in Vibrio harveyi

ZHOU Wei1,2,TANG Ju-fen1,2,GAO Zeng-hong1,GAN Zhen1,2,JIAN Ji-chang1,2,WU Zao-he2,3,DING Yu1,2
(1.Fisheries College of Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China; 2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Pathogenic Biology and Epidemiology for Aquatic Economic Animals,Zhanjiang 524088,China; 3.Zhongkai University of Agriculture and Engineering,Guangzhou 510225,China)

Abstract:The sequence of quinolone resistance gene of Vibrio harveyi was cloned based on the qnr of Vibrio harveyi published on GenBank and then inserted into the pET-32a vector to construct prokaryotic expression plasmid pET32-qnr.Then the expression conditions of temperature,induction time,and IPTG concentration of the pET32-qnr were optimized.The results showed that the complete open reading frame(ORF)length of qnr gene was 651 bp,encoding a protein of 216 amino acids.The optimization conditions of inducible expression for Qnr protein were inducing in 0.05 mmol/L IPTG for 6 hours at 28 ℃.

Key words:Vibrio harveyi; quinolone resistance gene; prokaryotic expression; optimization

通信作者：丁燏（1971－），男，博士，教授，研究方向?yàn)樗a(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物免疫學(xué)及病害控制。E-mail：dingy@gdou.edu.cn

基金項(xiàng)目：農(nóng)業(yè)部行業(yè)專項(xiàng)，漁藥使用風(fēng)險評估及其控制技術(shù)研究與示范（201203085）; 廣東省教育廳高等學(xué)校高層次人才項(xiàng)目(谷胱甘肽及其合成酶系在哈氏弧菌耐藥中的作用機(jī)制研究)。

收稿日期：2015-10-08

doi:10.3969/j.issn.1673-9159.2016.01.016

中圖分類號：Q786;Q939.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1673-9159（2016）01-0093-05

第一作者：周維（1990－），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗a(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物病害防治。E-mail：zw199008 @163.com