肖婷，吳志雄，羅健，李芳，曾歐，楊軍

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硫化氫對糖尿病大鼠心肌膠原重構(gòu)的影響及其機制探討

肖婷，吳志雄，羅健，李芳，曾歐，楊軍

摘要

關(guān)鍵詞糖尿病;硫化氫；膠原；心肌纖維化

作者單位：421001 湖南省衡陽市，南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院 心血管內(nèi)科

Impact and its Mechanism of Hydrogen Sulfide on Myocardial Collagen Remodeling in Experimental Rats With Diabetic Mellitus

XIAO Ting, WU Zhi-xiong, LUO Jian, LI Fang, ZENG Ou, YANG Jun.
Department of Cardiology, First Affiliated Hospital of South China University, Hengyang (421001), Hunan, China
Corresponding Author: YANG Jun, Email: yangjunincn@163.com

Abstract

Objective: To investigate the impact and its possible mechanism of hydrogen sulfide (H2S) on myocardial collagen remodeling in experimental rats with diabetic mellitus (DM).

Methods: Rat’s DM model was established by intraperitoneal injection of STZ at 40 mg/kg. A total of 40 SD rats were randomly divided into 4 groups: Control group, DM group, DM + NaHS group, in which NaHS worked as exogenous donor of H2S and NaHS control group. n=10 in each group, all animals were treated for 8 weeks. The cardiac collagen deposition was observed by Masson staining, protein expressions of cardiac collagen types I, III, IV and transforming growth factor β1(TGF-β1), connective tissue growth factor (CTGF) were examined by Western blot analysis.

Results: Compared with Control group, DM group showed increased protein expressions of cardiac collagen types I and III, up-regulated expressions of TGF-β1and CTGF, P<0.05; while the expressions of collagen type IV were similar between 2 groups. Compared with DM group, DM + NaHS group presented reduced cardiac collagen expression, decreased expression of collagen types I and III, down-regulated expressions of TGF-β1and CTGF, P<0.05; while the expressions of collagen type IV were similar between 2 groups.

Conclusion: H2S may improve the myocardial collagen remodeling in experimental DM rats, the mechanism might be related to the down-regulation of TGF-β1 and CTGF expression.

Key words Diabetic mellitus; Hydrogen sulfide; Collagen; Myocardial fibrosis

(Chinese Circulation Journal, 2016,31:87.)

糖尿病心肌?。―CM）是糖尿病重要的慢性并發(fā)癥之一，心肌膠原重構(gòu)是DCM主要的病理改變[1]。心肌膠原重構(gòu)是一個復(fù)雜的病理過程。大量研究表明，轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）是參與心肌膠原重構(gòu)發(fā)生的關(guān)鍵細(xì)胞因子。而結(jié)締組織生長因子（CTGF）被認(rèn)為是介導(dǎo)TGF-β1導(dǎo)致膠原重構(gòu)的一個重要介質(zhì)[2]，參與腎臟、肝臟、肺等多種器官的纖維化過程[3-5]。有研究顯示TGF-β1/CTGF信號通路也參與糖尿病心肌膠原重構(gòu)的發(fā)生過程[6]。硫化氫（H2S）作為一種氣體信號分子，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，其對心血管系統(tǒng)的保護作用受到越來越多關(guān)注。有研究報道H2S對心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷具有一定的保護作用[7]。而H2S對糖尿病心肌膠原重構(gòu)的作用以及相關(guān)機制的研究目前尚少見報道。本實驗采用鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)建立糖尿病大鼠模型，探討H2S對糖尿病大鼠心肌膠原重構(gòu)的作用，并通過觀察H2S對TGF-β1和CTGF表達(dá)的影響，初步探討其可能的作用機制。

1　材料與方法

實驗動物與主要試劑：2014-10至2015-05選擇40 只成年雄性SD大鼠，體重（300±20）g，購自長沙動物實驗中心； STZ購自美國MP Biomedicals Company USA；硫氫化鈉（NaHS）作為H2S供體，購自美國Sigma公司；兔源Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、TGF-β1及CTGF一抗、抗兔二抗購自中國博士德公司；BCA蛋白定量試劑盒、細(xì)胞裂解液購于中國碧云天公司。

動物分組及處理方案：將SD大鼠隨機分4組：對照組、糖尿病組（STZ組）、糖尿病硫氫化鈉干預(yù)組（STZ+NaHS組）、硫氫化鈉對照組（NaHS組），每組各10只。大鼠禁食12 h后，糖尿病大鼠模型通過單次腹腔注射STZ（40 mg/kg，溶解于檸檬酸鈉緩沖液中，pH=4.4）建立，非糖尿病大鼠單次腹腔注射相同劑量的檸檬酸鈉。3天后經(jīng)由尾靜脈取血，檢測血糖高于16.7 mmol/L表示糖尿病動物造模成功，用于后續(xù)試驗。STZ+NaHS組和NaHS組大鼠每日腹腔注射NaHS（100 μmol/kg），對照組和STZ組僅注射同等劑量的生理鹽水。第8周末，采用10%水合氯醛（350 mg/kg）行腹腔注射麻醉，迅速打開胸腔，摘取心臟后用冰生理鹽水沖洗，濾紙吸干，除去心臟周圍組織和大血管，取適量組織于甲醛中固定用作石蠟切片，余保存在 -80℃冰箱，用于免疫印跡測定蛋白等。

Masson染色觀察心肌膠原沉積：分別取4組大鼠左心室心肌組織，以10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，進(jìn)行Masson染色，心肌膠原纖維呈藍(lán)色，于光鏡下觀察。

Western blot檢測心肌組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、TGF-β1和CTGF蛋白含量：取大鼠新鮮左心室組織，提取蛋白后進(jìn)行蛋白定量；以SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，濕轉(zhuǎn)法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。5%脫脂奶粉封閉2 h后，以Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原一抗、TGF-β1和CTGF一抗（稀釋度均為1:400）37℃孵育1 h后4℃過夜，TBST（由Tris-HCl、NaCl和Tween20配制，pH=7.6）洗膜3次，洗膜后用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗（稀釋度為1:4000）37℃孵育1 h，同樣用TBST洗膜3次，化學(xué)發(fā)光液（BeyoECL Plus）顯色、曝光后掃描，以目的條帶和內(nèi)參條帶3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）的灰度比值分別表示Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、TGF-β1和CTGF一抗蛋白含量表達(dá)水平。

統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

4組大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果（圖1）：圖中心肌細(xì)胞間藍(lán)色染色即為膠原纖維。從圖中可見STZ組大鼠心肌排列紊亂，細(xì)胞間藍(lán)染膠原纖維明顯增加（如箭頭所示），存在明顯心肌纖維化；而STZ+NaHS組心肌排列紊亂明顯改善，藍(lán)染膠原纖維明顯減少，大鼠心肌纖維化較STZ組有所改善。

4組大鼠心肌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)的比較（圖2):Western blot檢測4組大鼠心?、裥湍z原、Ⅲ型膠原及Ⅳ型膠原蛋白表達(dá)，與對照組比較，STZ組大鼠心肌組織中的Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與STZ組比較，STZ+NaHS組大鼠心?、裥湍z原和Ⅲ型膠原表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。而STZ組大鼠Ⅳ型膠原與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），NaHS組大鼠Ⅳ型膠原與STZ組相比差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。與對照組相比，NaHS組大鼠心肌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及Ⅳ型膠原表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖1　4組大鼠心肌組織Masson染色結(jié)果（×200）

圖2　Western blot檢測4組大鼠心肌組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和Ⅳ型膠原的表達(dá)(n=3)

Western blot檢測4組大鼠心肌組織中TGF-β1和CTGF蛋白的表達(dá)（圖3）：與對照組相比，STZ組大鼠心肌組織TGF-β1及CTGF表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），STZ+NaHS組大鼠心肌組織TGF-β1和CTGF均較STZ組明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。NaHS組大鼠心肌TGF-β1和CTGF蛋白表達(dá)與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

圖3　Western blot檢測4組大鼠心肌組織TGF-β1和CTGF蛋白的表達(dá)(n=3)

3　討論

糖尿病心肌病臨床上的早期表現(xiàn)通常為左心室肥厚和舒張功能減退[8]，而其病理改變與心肌膠原重構(gòu)密切相關(guān)[9]。心肌膠原重構(gòu)是一個膠原沉積和降解的平衡過程，而心肌膠原纖維過度沉積或膠原成分比例的改變可導(dǎo)致心室重構(gòu)，進(jìn)而導(dǎo)致心肌僵硬并損害心肌舒張功能。心肌膠原重構(gòu)是一個復(fù)雜的病理過程，眾多機制參與其中，包括炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激及免疫調(diào)節(jié)機制等[10, 11]。近年來發(fā)現(xiàn)TGF-β1/CTGF也參與心肌膠原重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展。CTGF是近年發(fā)現(xiàn)的一種致纖維化因子，有增強成纖維細(xì)胞活化遷移和合成細(xì)胞外基質(zhì)的能力[12]，并可被TGF-β1在轉(zhuǎn)錄水平誘導(dǎo)大量表達(dá)[13]，且參與多臟器纖維化的發(fā)生。TGF-β1是目前公認(rèn)的與纖維化發(fā)生密切相關(guān)的調(diào)控因子。有研究表明，TGF-β1發(fā)揮致纖維化作用需通過上調(diào)CTGF的表達(dá)。本實驗結(jié)果顯示，糖尿病大鼠與對照組相比，存在明顯心肌纖維化，心肌組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)明顯增多，但Ⅳ型膠原無顯著差異性改變。Ⅳ型膠原與層粘連蛋白一起參與構(gòu)成細(xì)胞外基底膜，反映基底膜膠原的更新率，在某些情況下其含量升高也可以反映心肌纖維化過程[14]。在本實驗中，糖尿病大鼠心肌組織中TGF-β1和CTGF表達(dá)較正常大鼠明顯升高，提示TGF-β1和CTGF可能參與了糖尿病心肌膠原重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機制。

近年來，大量研究表明，同一氧化氮與一氧化碳一樣，H2S是體內(nèi)一種重要的細(xì)胞信號調(diào)控氣體分子。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，H2S可改善高血壓大鼠的心肌重構(gòu)[15]，而其能否改善糖尿病心肌膠原重構(gòu)目前尚不清楚。本實驗結(jié)果顯示，糖尿病大鼠心肌間質(zhì)出現(xiàn)明顯膠原沉積，而H2S干預(yù)后可使糖尿病大鼠心肌間質(zhì)膠原纖維顯著減少。且H2S可下調(diào)糖尿病大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原和Ⅲ型膠原的表達(dá)，但對Ⅳ型膠原表達(dá)無明顯影響，提示H2S可改善糖尿病大鼠的心肌膠原重構(gòu)。結(jié)果還顯示，H2S在改善糖尿病大鼠心肌纖維化的同時也可下調(diào)心肌組織TGF-β1和CTGF的表達(dá)，而這也可能是H2S改善糖尿病心肌膠原重構(gòu)的重要信號調(diào)控機制。以上結(jié)果可為糖尿病心肌膠原重構(gòu)的發(fā)病機制探討以及研究糖尿病心肌纖維化新的臨床藥物防治策略提供新的思路。

參考文獻(xiàn)

[1] Aneja A, Tang WH, Bansilal S, et al. Diabetic cardiomyopathy: insights into pathogenesis, diagnostic challenges, and therapeutic options. Am J Med, 2008, 121: 748-757.

[2] Sakharova OV, Taal MW, Brenner BM. Pathogenesis of diabetic nephropathy: focus on transforming growth factor-beta and connective tissue growth factor. Curr Opin Nephrol Hy, 2001, 10: 727-738.

[3] Liu Y, Li W, Liu H, et al. Inhibition effect of small interfering RNA of connective tissue growth factor on the expression of extracellular matrix molecules in cultured human renal proximal tubular cells. Ren Fail, 2014, 36: 278-284.

[4] Gressner OA, Fang M, Li H, et al. Connective tissue growth factor （CTGF/CCN2) in serum is an indicator of fibrogenic progression and malignant transformation in patients with chronic hepatitis B infection. Clin Chim Acta, 2013, 5: 126-131.

[5] Ponticos M, Holmes AM, Shi-wen X, et al. Pivotal role of connective tissue growth factor in lung fibrosis: MAPK-dependent transcriptional activation of type I collagen. Semin Arthritis Rheu, 2009, 60: 2142-2155.

[6] Wang L, Yuan T, Du G, et al. The impact of 1, 25-dihydroxyvitamin D3 on the expression of connective tissue growth factor and transforming growth factor-beta1 in the myocardium of rats with diabetes. Diabetes Res Clin Pr, 2014, 104: 226-233.

[7] 張昱, 程衛(wèi)平. 硫化氫對乳鼠心肌細(xì)胞缺氧-復(fù)氧損傷的保護作用. 中國循環(huán)雜志, 2009, 24: 227-230.

[8] Niemann M, Herrmann S, Ertl G, et al. Echocardiography in diabetic cardiomyopathy. Herz, 2013, 38: 42-47.

[9] 馮新星, 陳燕燕. 糖尿病心肌病的研究進(jìn)展. 中國循環(huán)雜志, 2015, 1: 87 -89.

[10] 黃海, 宋成運, 馬建新, 等. 氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)在糖尿病性心肌病中的作用及相互關(guān)系. 中華臨床醫(yī)師雜志, 2012, 6: 4905-4906. [11] 趙林雙, 廖玉華, 王敏, 等. 糖尿病心肌病患者與抗G-蛋白偶聯(lián)型受體血管緊張素Ⅱ1型受體和腎上腺素能α1受體自身抗體的初步研究. 中國循環(huán)雜志, 2004, 19: 133-135.

[12] Lipson KE, Wong C, Teng Y, et al. CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair, 2012, 6: S24.

[13] Igarashi A, Okochi H, Bradham DM, et al. Regulation of connective tissue growth factor gene expression in human skin fibroblasts and during wound repair. Mol Biol Cell, 1993, 4: 637-645.

[14] 謝朝暉, Elifuraha FM, 楊作成. TGF-β1對新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞Ⅰ型和Ⅳ型膠原合成的影響. 湖南師范大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)報), 2007, 4: 5-8.

[15] 黃賢生, 王東明, 鄭錦濱. 硫化氫下調(diào)血管緊張素Ⅱ1型受體表達(dá)抑制高血壓大鼠心肌重構(gòu). 中國動脈硬化雜志, 2012, 20: 787-791.

（編輯：汪碧蓉）

基礎(chǔ)與實驗研究

收稿日期：（2015-04-09）

中圖分類號：R541.6

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-3614（2016）01-0087-04

doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.01.019

作者簡介：肖婷 碩士研究生 主要從事糖尿病心肌病的研究 Email: 1459593600@qq.com 通訊作者：楊軍 Email: yangjunincn@163.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金（81202830）；湖南省自然科學(xué)基金（11JJ2046）資助項目

目的：探討硫化氫（H2S）對糖尿病大鼠心肌膠原重構(gòu)的作用及其可能機制。

方法：40只SD大鼠隨機分成4組：對照組、糖尿病組（STZ組）、糖尿病硫氫化鈉（NaHS）干預(yù)組（STZ+NaHS組)、NaHS對照組（NaHS組），每組各10只。腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）40 mg/kg建立糖尿病模型，以NaHS作為外源性H2S供體。8周后處死大鼠，Masson染色觀察心肌膠原沉積，Western blot 觀察大鼠心肌組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1） 和結(jié)締組織生長因子（CTGF）蛋白的表達(dá)水平。

結(jié)果：與對照組相比，STZ組心肌膠原纖維明顯增多，Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)顯著升高，Ⅳ型膠原無顯著差異性改變，同時TGF-β1及CTGF表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05）；與STZ組相比，STZ+NaHS組大鼠心肌膠原纖維明顯減少，Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達(dá)顯著下降，Ⅳ型膠原無顯著差異性改變，同時TGF-β1及CTGF表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05）。

結(jié)論：H2S可改善糖尿病大鼠心肌膠原重構(gòu)，其機制可能與其下調(diào)TGF-β1及CTGF表達(dá)有關(guān)。