李敏，黎紅華，盛沖霄

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肥胖合并動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能以及親環(huán)素A 和p-ERK1/2表達(dá)的變化

李敏，黎紅華，盛沖霄

摘要

關(guān)鍵詞肥胖癥；動(dòng)脈粥樣硬化；內(nèi)皮依賴性松弛因子類；親環(huán)素A

作者單位：430070 湖北省武漢市，南方醫(yī)科大學(xué)武漢臨床醫(yī)學(xué)院 廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科

Endothelial-dependent Vasodilatation and Expressions of CyPA, p-ERK1/2 in Experimental Rats With Obesity Combining Atherosclerosis

LI Min, LI Hong-hua, SHENG Chong-xiao.
Wuhan Clinical Institute Affiliated to Southern Medical University, Wuhan (430070), Hubei, China
Corresponding Author: LI Hong-hua, Email: Lihonghua567@aliyun.com

Abstract

Objective: To observe the endothelial-dependent vasodilatation and expressions of cyclophilin A (CyPA), phosphorylated extracellular signal regulated kinase1/2 (p-ERK1/2) in experimental rats with obesity combining atherosclerosis.

Methods: A total of 30 male Wistar rats were randomly divided into 3 groups: Control group, the rats received basic diet followed by intraperitoneal injection of normal saline; Atherosclerosis (AS) group, the rats received basic diet for 8 weeks followed by high cholesterol diet with intraperitoneal injection of a single dose vitamin D3 600,000 IU/kg; Obesity+AS group, the rats received high cholesterol diet for 8 weeks (which made their body weights at 20% higher than the other 2 groups) followed by intraperitoneal injection of a single dose vitamin D3 600,000 IU/kg. n=10 in each group. 16 weeks later, the endothelial-dependent vasodilatation was examined in all rats, expressions of CyPA and p-ERK1/2 in arterial wall were detected by HE staining and immunohistochemistry.

Results: Compared with Control group, both AS group and Obesity+AS group had reduced endothelial-dependentvasodilatation (72.49 ± 3.27) % and (42.28 ± 2.62) % vs (96.63 ± 3.85) %, such reduction was even more in Obesity+AS group (42.28 ± 2.62) % vs (72.49 ± 3.27) %, all P<0.05. HE staining displayed that in Control group, AS group and Obesity+AS group had normal vessel structure, the endothelial cell damage, vessel smooth muscle cell proliferation, atherosclerosis and calcification plaques at different degrees; immunohistochemistry indicated that the expressions of CyPA and p-ERK1/2 in endothelial and smooth muscle cells were increased accordingly in above 3 groups, all P<0.05 between any 2 groups.

Conclusion: The rats with obesity and AS had decreased endothelial-dependent vasodilatation, severe atherosclerosis and calcification plaques, increased expressions of CyPA and p-ERK1/2, which speculated that obesity might be an independent risk factor for atherosclerosis.

Key words Obesity; Atherosclerosis; Endothelium-dependent diastolic function; Cyclophilin A

(Chinese Circulation Journal, 2016,31:77.)

目前，隨著人們生活飲食習(xí)慣改變，肥胖癥的發(fā)生率逐年升高，已經(jīng)成為威脅人類健康主要危險(xiǎn)因素之一。肥胖癥是體內(nèi)脂肪大量堆積并伴有代謝紊亂的綜合征，患者多伴有血糖、血脂異常、瘦素抵抗和胰島素抵抗，與動(dòng)脈粥樣硬化（動(dòng)脈硬化）形成密切相關(guān)[1]。動(dòng)脈硬化以內(nèi)皮功能障礙為起始事件的血管壁慢性炎性過程。近年來，親環(huán)素A （cyclophilin A， CyPA）與氧化應(yīng)激、動(dòng)脈硬化病變的關(guān)系成為研究熱點(diǎn)[2]。CyPA是一種重要的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)分泌的生長(zhǎng)因子，在機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)下由血管內(nèi)皮細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）分泌[3]。分泌至細(xì)胞外的CyPA介導(dǎo)活性氧（ROS）介質(zhì)激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（extracellular signal regulated kinase, ERK1/2），磷酸化ERK1/2（p- ERK1/2）將信號(hào)從細(xì)胞膜表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞核，誘導(dǎo)核因子κB （NF-κB）活化 ,炎性細(xì)胞增殖、遷移,促炎性反應(yīng)；同時(shí)促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞DNA合成、增殖，抑制凋亡[4]。但是CyPA是否參與肥胖導(dǎo)致的動(dòng)脈硬化發(fā)生發(fā)展，目前尚少見報(bào)道。本文旨在研究肥胖基礎(chǔ)上聯(lián)合高脂飲食復(fù)制大鼠動(dòng)脈硬化模型，觀察內(nèi)皮依賴性血管舒張功能改變，以及CyPA、p-ERK1/2在血管內(nèi)皮和平滑肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，揭示肥胖促進(jìn)動(dòng)脈硬化的機(jī)制，為動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防及治療提供新依據(jù)。

1　材料與方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)健康雄性Wistar大鼠30只，體重180～200 g，動(dòng)物合格證號(hào)：420006000074S69，湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供。分籠飼養(yǎng)在華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF環(huán)境中，室內(nèi)溫度（22±1）℃，濕度（60±10）%，自由進(jìn)食水，12 h明暗交替。

主要實(shí)驗(yàn)藥劑：維生素D3注射液（上海通用藥業(yè)），膽固醇、膽酸鈉（武漢勝天宇生物科技有限公司），兔抗CyPA抗體、兔抗p-ERK1/2抗體（北京索萊寶科技有限公司）?；A(chǔ)飼料由華中科技大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，高脂飼料（81.3%普通飼料、5%蔗糖、10%豬油、3%膽固醇、0.5%膽酸鹽、0.2%丙基硫氧嘧啶）由湖北省萬千佳興生物科技有限公司加工。

主要儀器：BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)、HV-4離體組織器官恒溫灌流系統(tǒng)、JH-2型張力換能器，由成都泰盟公司生產(chǎn)。YB-6型生物組織包埋機(jī)，RM2016型Leica石蠟切片機(jī)，OLYMPUS BX51照相顯微鏡等。

方法：30只大鼠隨機(jī)分為3組，對(duì)照組10只，動(dòng)脈硬化組10只，肥胖+動(dòng)脈硬化組10只。動(dòng)脈硬化組先給予基礎(chǔ)飼料8周后改為高脂飼料喂養(yǎng)，并在高脂飼料喂養(yǎng)第2天給予一次性腹腔注射維生素D3注射液60萬IU/kg。對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料，腹腔注射等量生理鹽水；肥胖+動(dòng)脈硬化組給予高脂飼料（第8周測(cè)體重高于另外兩組20%以上，肥胖模型[5]），8周后給予一次性腹腔注射維生素D3注射液60萬IU/kg。造模16周后處死大鼠，取材。

取材：過量水合氯醛麻醉處死大鼠，剔除周圍組織，快速分離腹主動(dòng)脈。（1） 離體血管環(huán)內(nèi)皮依賴性舒張功能測(cè)定：每條腹主動(dòng)脈截取約4 mm長(zhǎng)血管環(huán)連接到JH-2型張力換能器，下方以鋼鉤固定于槽底，置于含Krebs液的HV-4離體恒溫組織器官灌流系統(tǒng)，給予2 g張力負(fù)荷，通入95% O2和5% CO2的混合氣體，在37℃水浴中平衡1 h，每15 min換Krebs液1次。血管環(huán)張力平衡后向浴槽中加入終濃度為1×10-6mol/L去甲腎上腺素收縮血管環(huán)，待其張力達(dá)平頂后依次加入不同濃度（1×10-9～1×10-4mol/L）的乙酰膽堿，記錄每一濃度下血管環(huán)的張力，取各組的平均張力，各濃度的內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)=[（最大張力-各濃度點(diǎn)的張力）/（最大張力-基礎(chǔ)值）]×100%，繪制濃度反應(yīng)曲線。（2）蘇木素—伊紅（HE）染色：新鮮腹主動(dòng)脈以4%多聚甲醛固定48 h后，行石蠟包埋，切片（橫切，片厚2 μm），按照HE染色步驟染色后置于400倍光鏡下觀察并攝片。（3）免疫組化SP法染色與數(shù)據(jù)采集： 石蠟切片按照免疫組化SP法步驟進(jìn)行染色。以胞漿胞膜出現(xiàn)棕黃色染色為CyPA染色陽性，以胞漿胞核出現(xiàn)棕黃色染色為p-ERK1/2染色陽性。每張切片隨機(jī)抽取3個(gè)不同的400倍視野，采用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)免疫組化圖片進(jìn)行分析，測(cè)定其平均光密度（平均光密度=累積光密度/測(cè)量區(qū)域面積）。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS21.0軟件。計(jì)量資料服從正態(tài)分布采用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，不服從正態(tài)分布采用中位數(shù)（四分位間距）描述，組間比較采用秩和檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腹主動(dòng)脈HE染色結(jié)果存在顯著差異。對(duì)照組大鼠腹主動(dòng)脈內(nèi)皮光滑完整，內(nèi)皮細(xì)胞排列整齊，無增生、凋亡，未見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；平滑肌細(xì)胞排列整齊，無平滑肌細(xì)胞增生，未見彈性纖維連續(xù)性中斷（圖1A）。動(dòng)脈硬化組大鼠動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，血管內(nèi)皮完整性損傷；平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)增生、細(xì)胞核排列紊亂，內(nèi)皮下可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞外基質(zhì)增大，彈性纖維連續(xù)性中斷，粥樣斑塊形成（圖1B）。肥胖+動(dòng)脈硬化組大鼠血管內(nèi)皮損傷脫落，彈性纖維斷裂，血管中層鈣化斑塊形成（圖1C）。

表1　三組大鼠腹主動(dòng)脈環(huán)在乙酰膽堿濃度梯度下內(nèi)皮依賴性舒張功能比較(n=10，%，±s）

表1　三組大鼠腹主動(dòng)脈環(huán)在乙酰膽堿濃度梯度下內(nèi)皮依賴性舒張功能比較(n=10，%，±s）

注： 表示各濃度下組間兩兩比較P<0.05

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圖1　三組大鼠腹主動(dòng)脈切片蘇木素—伊紅染色結(jié)果（×400）

2　結(jié)果

三組大鼠腹主動(dòng)脈環(huán)對(duì)乙酰膽堿誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張功能比較： 30只大鼠腹主動(dòng)脈環(huán)對(duì)濃度梯度（1×10-9～1×10-4）mol/L下的乙酰膽堿誘導(dǎo)的內(nèi)皮依賴性舒張功能均有不同反應(yīng)。對(duì)照組內(nèi)皮依賴性舒張功能良好，最大舒張功能達(dá)（96.63±3.85）%， 動(dòng)脈硬化組和肥胖+動(dòng)脈硬化組內(nèi)皮依賴性舒張功能下降，最大舒張功能分別是（72.49±3.27）%、（42.28±2.62）%，均明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），肥胖+動(dòng)脈硬化組又顯著低于動(dòng)脈硬化組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

各組大鼠血管HE染色結(jié)果：光鏡下各組大鼠

三組大鼠動(dòng)脈CyPA、p-ERK1/2免疫組化染色及平均光密度比較：免疫組化染色后光鏡下觀察三組大鼠腹主動(dòng)脈血管壁內(nèi)CyPA、p-ERK1/2均有不同程度的表達(dá)。CyPA主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞及血管平滑肌細(xì)胞胞漿，p-ERK1/2主要在血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞胞漿及胞核內(nèi)顯著表達(dá)。動(dòng)脈硬化組、肥胖+動(dòng)脈硬化組大鼠血管壁內(nèi)CyPA、p-ERK1/2的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，而肥胖+動(dòng)脈硬化組大鼠腹主動(dòng)脈血管壁內(nèi)上述指標(biāo)的表達(dá)又顯著高于動(dòng)脈硬化組（見圖2A、2B、2C及圖3A、3B、3C）。平均光密度測(cè)定結(jié)果提示，CyPA、p-ERK1/2的表達(dá)在對(duì)照組、動(dòng)脈硬化組和肥胖+動(dòng)脈硬化組成顯著遞增趨勢(shì)，三組之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均<0.05，見圖4）。

圖2　三組大鼠腹主動(dòng)脈親環(huán)素A免疫組化染色結(jié)果（×400）

圖3　三組大鼠腹主動(dòng)脈磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2免疫組化染色結(jié)果（×400）

圖4　三組大鼠腹主動(dòng)脈親環(huán)素A和磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2免疫組化平均光密度測(cè)定（n=10）

3　討論

肥胖癥是指體內(nèi)脂肪堆積過多并伴有代謝紊亂的綜合征，是一種慢性炎癥狀態(tài)。脂肪組織是最大的內(nèi)分泌器官，血管膜周脂肪組織分泌脂肪因子等加速血管內(nèi)皮炎性反應(yīng)，肥胖引起的脂代謝紊亂、胰島素抵抗亦可誘發(fā)血管內(nèi)皮功能障礙[6，7]。大量研究證實(shí)，過度的脂肪沉積尤其內(nèi)臟脂肪過度聚集誘發(fā)機(jī)體氧化與抗氧化能力失衡，導(dǎo)致活性氧在體內(nèi)大量堆積，在內(nèi)皮損傷下誘導(dǎo)血管膜周脂肪組織分泌脂肪因子、炎性因子等引起血管組織損傷，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展[8，9]。CyPA屬于親環(huán)素家族，是免疫抑制劑環(huán)孢素A（cyclosporine，CsA）的胞內(nèi)結(jié)合蛋白，目前研究認(rèn)為其還具有前炎癥因子及促動(dòng)脈硬化作用，貫穿動(dòng)脈硬化進(jìn)展全程[10]。CyPA作為氧化應(yīng)激誘導(dǎo)分泌的生長(zhǎng)因子，在氧化應(yīng)激下受活性氧誘導(dǎo)由血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生并通過囊泡運(yùn)輸方式分泌到細(xì)胞外，而分泌出的CyPA反過來通過細(xì)胞外信號(hào)途徑，促進(jìn)細(xì)胞產(chǎn)生更多ROS；兩者相互促進(jìn)相互誘導(dǎo)，放大機(jī)體氧化應(yīng)激狀態(tài)[11]。增加的CyPA主要在胞外發(fā)揮前炎性因子功能，參與對(duì)炎性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，促進(jìn)炎性反應(yīng)、內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡及平滑肌細(xì)胞增殖；同時(shí)通過對(duì)血管壁清道夫受體調(diào)節(jié)，促進(jìn)低密度脂蛋白膽固醇的攝取等均參與動(dòng)脈硬化的進(jìn)展。研究表明，細(xì)胞外CyPA可激活ERK1/2以其蛋白磷酸化形式存在（p-ERK1/2），ERK1/2的活化是將信號(hào)從細(xì)胞膜表面受體轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞核的關(guān)鍵[12]。在內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)NF-κB活化、DNA合成、炎性細(xì)胞增殖遷移，促進(jìn)炎性反應(yīng)；同時(shí)亦可促進(jìn)平滑肌細(xì)胞DNA合成、細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡。

根據(jù)文獻(xiàn)[13]，本實(shí)驗(yàn)通過運(yùn)用高脂飼料聯(lián)合維生素D3注射液復(fù)制肥胖癥、動(dòng)脈硬化大鼠模型。維生素D3注射液具有促進(jìn)小腸對(duì)鈣的吸收，短期大量給予實(shí)驗(yàn)動(dòng)物攝入維生素D3人為引起高鈣血癥，聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)刺激大鼠機(jī)體代謝紊亂、氧化應(yīng)激水平升高，誘導(dǎo)大鼠全身性血管鈣化。通過比較各組血管內(nèi)皮舒張功能、血管壁動(dòng)脈硬化斑塊形態(tài)學(xué)改變，以及血管壁CyPA、p-ERK1/2表達(dá)水平差異，明確了CyPA、p-ERK1/2與動(dòng)脈硬化嚴(yán)重程度的關(guān)系。結(jié)果顯示動(dòng)脈硬化組大鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能較對(duì)照組大鼠明顯下降，血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、完整性損傷；平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)增生、細(xì)胞核排列紊亂，內(nèi)皮下可見炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞外基質(zhì)增大，彈性纖維連續(xù)性中斷，粥樣斑塊形成；血管壁CyPA、p-ERK1/2表達(dá)明顯增高。推測(cè)高脂誘導(dǎo)氧化應(yīng)激狀態(tài)促進(jìn)CyPA分泌，胞外CyPA磷酸化ERK1/2并向核內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)，誘導(dǎo)炎性反應(yīng)、DNA合成、平滑肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)動(dòng)脈硬化發(fā)生發(fā)展[14]。

肥胖加劇動(dòng)脈硬化的發(fā)生是毋容置疑的，但是CyPA是否參與這一機(jī)制目前少見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在肥胖基礎(chǔ)上聯(lián)合高脂飼料喂養(yǎng)大鼠，通過與對(duì)照組、動(dòng)脈硬化組對(duì)比結(jié)果顯示，肥胖+動(dòng)脈硬化組大鼠內(nèi)皮依賴性舒張功能下降最顯著，血管內(nèi)皮脫落，彈性纖維斷裂，血管中層鈣化斑形成，血管壁CyPA、p-ERK1/2表達(dá)較其余組均明顯增加[15，16]。推測(cè)CyPA、p-ERK1/2信號(hào)機(jī)制參與肥胖癥加重血管動(dòng)脈硬化進(jìn)展，可能是動(dòng)脈硬化病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

綜上所述，高脂飲食誘導(dǎo)機(jī)體氧化應(yīng)激水平升高，血管動(dòng)脈硬化斑塊形成，CyPA、p-ERK1/2在動(dòng)脈硬化斑塊中顯著表達(dá)。在氧化應(yīng)激狀態(tài)下，分泌至胞外CyPA通過激活p-ERK1/2促進(jìn)動(dòng)脈硬化進(jìn)展，且與動(dòng)脈硬化嚴(yán)重程度密切相關(guān)。由此我們認(rèn)為，CyPA可能是動(dòng)脈硬化的始動(dòng)因子，參與動(dòng)脈硬化的發(fā)生發(fā)展。肥胖加重動(dòng)脈硬化病變程度，CyPA、p-ERK1/2信號(hào)機(jī)制參與肥胖癥加重血管動(dòng)脈硬化進(jìn)展，肥胖癥可能是動(dòng)脈硬化病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

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（編輯：漆利萍）

基礎(chǔ)與實(shí)驗(yàn)研究

(收稿日期：2015-07-18)

中圖分類號(hào)：R543

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-3614（2016）01-0077-05

doi:10.3969/j.issn.1000-3614.2016.01.017

作者簡(jiǎn)介：李敏 碩士研究生 研究方向?yàn)閯?dòng)脈粥樣硬化在心腦血管疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制 Email:1437681545@qq.com 通訊作者：黎紅華Email:Lihonghua567@aliyun.com

基金項(xiàng)目：湖北省自然科學(xué)基金（2013CFB428）

目的：觀察肥胖合并動(dòng)脈粥樣硬化（動(dòng)脈硬化）大鼠血管內(nèi)皮功能的改變以及親環(huán)素A（CyPA）和磷酸化細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2（p-ERK1/2）的表達(dá)變化。

方法：雄性Wistar大鼠30只隨機(jī)分為3組，對(duì)照組（10只）、動(dòng)脈硬化組（10只），肥胖+動(dòng)脈硬化組（10只）。對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料+腹腔注射等量生理鹽水；動(dòng)脈硬化組基礎(chǔ)飼料8周后給予高脂飼料+維生素D3注射液60萬IU/kg一次性腹腔注射；肥胖+動(dòng)脈硬化組給予高脂飼料（肥胖癥模型，高脂喂養(yǎng)8周體重大于其余組大鼠20%）+維生素D3注射液60萬IU/kg一次性腹腔注射。16周后測(cè)定血管內(nèi)皮依賴性舒張功能；蘇木素—伊紅（HE）染色、免疫組化檢測(cè)動(dòng)脈血管壁CyPA及p-ERK1/2的表達(dá)。

結(jié)果：與對(duì)照組相比，動(dòng)脈硬化組、肥胖+動(dòng)脈硬化組血管內(nèi)皮依賴性舒張功能下降[（72.49±3.27）% vs （96.63±3.85）%]，[（42.28±2.62）% vs （96.63±3.85）%]，且肥胖+動(dòng)脈硬化組下降更明顯[（42.28±2.62）% vs （72.49±3.27）%]，三組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05）。HE染色顯示，三組大鼠血管壁分別為正常結(jié)構(gòu)，內(nèi)皮細(xì)胞破壞、平滑肌細(xì)胞增生和粥樣鈣化斑塊形成等不同程度病變特征。免疫組化提示三組大鼠血管內(nèi)皮及平滑肌細(xì)胞內(nèi)CyPA及p-ERK1/2表達(dá)逐漸升高，組間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05）。

結(jié)論：肥胖+動(dòng)脈硬化組大鼠血管內(nèi)皮依賴性舒張功能顯著下降，動(dòng)脈硬化鈣化斑塊嚴(yán)重，CyPA及p-ERK1/2表達(dá)顯著增加。推測(cè)CyPA、p-ERK1/2信號(hào)機(jī)制參與肥胖癥加重血管動(dòng)脈硬化進(jìn)展，肥胖可能是動(dòng)脈硬化病變的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。