陳琳，陳燕，肖東

（南方醫(yī)科大學(xué)，廣州510515）

Eμ-VH啟動子調(diào)控c-Myc表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建及其體外功能

陳琳，陳燕，肖東

（南方醫(yī)科大學(xué)，廣州510515）

目的 構(gòu)建人B淋巴細(xì)胞特異性啟動子Eμ-VH調(diào)控癌基因c-Myc表達(dá)的慢病毒載體（pEMIR），并探討其體外功能。方法 以pLV-c-Myc-IRES-增強綠色熒光蛋白（EGFP）為模板，經(jīng)PCR擴增、酶切后得到pEVCHR；以pEVCHR為模板，PCR擴增、酶切后得到慢病毒載體pEMIR，并行測序和酶切鑒定。將pEMIR分別瞬時轉(zhuǎn)染入人源胚胎腎細(xì)胞293T、人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株（OCL-Ly3、OCL-Ly10），倒置熒光顯微鏡檢測各細(xì)胞EGFP和單體紅色熒光蛋白（mRFP）的表達(dá)，用qRT-PCR法檢測細(xì)胞內(nèi)c-Myc mRNA表達(dá)，用Western blotting法檢測293T細(xì)胞c-Myc蛋白表達(dá)。結(jié)果 Eμ-VH-c-Myc-H2BmRFP基因片段電泳結(jié)果與預(yù)測值4 129 bp相符，Vector DNA電泳可見一條帶與預(yù)測值8 561 bp相符；pEMIR酶切并電泳的結(jié)果與理論預(yù)測值相符；對pEMIR質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果與預(yù)期相符，證明pEMIR構(gòu)建成功。三種細(xì)胞經(jīng)pEMIR轉(zhuǎn)染后，倒置熒光顯微鏡下可見綠色和紅色熒光，同時轉(zhuǎn)基因c-Myc表達(dá)正常。結(jié)論 成功構(gòu)建Eμ-VH啟動子調(diào)控c-Myc表達(dá)的慢病毒載體，體外實驗證明該載體能夠在人正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中均可發(fā)揮功能。

Eμ-VH啟動子；c-Myc癌基因；慢病毒載體；彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤

目前，用于腫瘤研究的動物模型絕大多數(shù)是基于遺傳工程的小鼠［1］，極度缺乏人類腫瘤大動物模型。小型豬在常用大型實驗動物中具有諸多優(yōu)勢［2］。在小鼠轉(zhuǎn)基因過表達(dá)c-Myc，可誘發(fā)淋巴瘤［3～5］，且耗時較短。為此我們擬基于小型豬創(chuàng)制人類淋巴瘤模型。目前，慢病毒載體法已成功用于制備轉(zhuǎn)基因豬［6］。2015年3～12月，本研究構(gòu)建人B淋巴細(xì)胞特異性啟動子Eμ-VH調(diào)控c-Myc基因表達(dá)的慢病毒載體（pEMIR），并對載體的體外功能進(jìn)行初步驗證，為制備轉(zhuǎn)基因豬奠定堅實基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑 攜帶人B淋巴細(xì)胞特異性啟動子Eμ-VH的載體pEμ-VH-miR155由美國俄亥俄州立大學(xué)Carlo教授惠贈，載體pLV-c-Myc-IRES-增強綠色熒光蛋白（EGFP）（pEMIG）由中國上海生命科學(xué)研究院肖磊研究員惠贈，pHIV-H2BmRFP由美國加州大學(xué)的Zena教授惠贈，慢病毒載體pCD550A-1購自System Biosciences（SBI）公司。高保真Taq DNA聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶、In-Fusion克隆試劑盒均購自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自QIAGEN公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染劑Lipofectamine2000、高糖DMEM、Opti-MEM I Medium和DMSO等購自Invitrogen公司；培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板等購自Corning公司；其余試劑為國產(chǎn)或進(jìn)口化學(xué)純或分析純。人源胚胎腎細(xì)胞293T來源和培養(yǎng)方法見文獻(xiàn)［7］，人彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞株（OCL-Ly3、OCL-Ly10）由南方醫(yī)科大學(xué)趙彤教授惠贈。以上細(xì)胞所用培養(yǎng)基為含10%胎牛血清的DMEM。

1.2pEMIR的構(gòu)建 pEμ-VH-miR155進(jìn)行測序。以質(zhì)粒pLV-c-Myc-IRES-EGFP為模板，PCR擴增目的基因c-Myc，In-Fusion克隆至利用EcoR V／Sal I酶切的pEμ-VH-miR155中，構(gòu)建載體pEVC；以pEVC為模板，PCR擴增目的基因Eμ-VH-c-Myc，In-Fusion克隆至利用Hpa I酶切的pHIV-H2BmRFP中，構(gòu)建載體pEVMHR；以pEVMHR為模板，PCR擴增目的基因Eμ-VH-c-Myc-H2BmRFP，In-Fusion克隆至利用Nhe I／CIa I雙酶切的pCD550A-1中，最終獲得慢病毒表達(dá)載體pEMIR。次日挑選單菌落，提取質(zhì)粒并行測序和酶切鑒定。

1.3pEMIR體外功能檢測 采用LipofectamineTM2000將pEMIR、pCD550A-1（陰性對照）在六孔板內(nèi)分別瞬時轉(zhuǎn)染入293T、OCL-LY3和OCL-LY10細(xì)胞；同時將pEMIG（陽性對照）瞬時轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞；以上轉(zhuǎn)染均至少設(shè)兩個復(fù)孔。轉(zhuǎn)染24～48 h在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光情況，如果pEMIR瞬時轉(zhuǎn)染，293T、OCL-LY3和OCL-LY10細(xì)胞在倒置熒光顯微鏡下可見綠色熒光，則證明轉(zhuǎn)染成功。然后分別提取以上細(xì)胞總RNA，按照TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，qRT-PCR法檢測細(xì)胞內(nèi)c-Myc mRNA表達(dá)，采用2-ΔΔCt公式計算基因相對表達(dá)量。轉(zhuǎn)染72 h提取293T細(xì)胞的總蛋白，用Western blotting法檢測293T細(xì)胞c-Myc蛋白表達(dá)。用Image lab軟件分別對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析，用公式計算實驗組相對于對照組的表達(dá)倍數(shù)作為實驗組的相對表達(dá)量。以上實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1pEMIR構(gòu)建結(jié)果 Eμ-VH-c-Myc-H2BmRFP基因片段電泳結(jié)果與預(yù)測值4 129 bp相符，Vector DNA電泳可見一條帶與預(yù)測值8 561 bp相符；pEMIR酶切并電泳的結(jié)果與理論預(yù)測值相符；pEMIR質(zhì)粒測序結(jié)果與預(yù)期相符。證明pEMIR構(gòu)建成功。

2.2pEMIR體外功能檢測結(jié)果 pEMIR瞬時轉(zhuǎn)染293T、OCL-LY3和OCL-LY10細(xì)胞，在倒置熒光顯微鏡下可見綠色熒光，證明轉(zhuǎn)染成功。瞬時轉(zhuǎn)染48 h后倒置熒光顯微鏡下也可見紅色熒光（目的基因表達(dá)）。轉(zhuǎn)染pEMIR后，293T、OCL-LY3和OCL-LY10細(xì)胞c-Myc mRNA相對表達(dá)量（18.86±0.42、5 928.90±125.13、238.92±6.71）均高于轉(zhuǎn)染pCD550A-1（均為1.00±0.00），P均＜0.05。轉(zhuǎn)染pEMIG后，293T細(xì)胞c-Myc mRNA相對表達(dá)量為368.72±8.66。轉(zhuǎn)染pEMIR、pEMIG后293T細(xì)胞內(nèi)c-Myc mRNA相對表達(dá)量高于轉(zhuǎn)染pCD550A-1（P均＜0.05）。轉(zhuǎn)染pCD550A-1、pEMIR、pEMIG后72 h，293T細(xì)胞c-Myc蛋白相對表達(dá)量分別為0.07 ±0.01、0.15±0.01、3.05±0.05，轉(zhuǎn)染pEMIR、pEMIG后293T細(xì)胞內(nèi)蛋白相對表達(dá)量高于轉(zhuǎn)染pCD550A-1（P均＜0.05）。

3　討論

慢病毒屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒的一種，不僅可以高效感染處于分裂期的細(xì)胞，而且可以感染非分裂期的細(xì)胞；借助慢病毒可將其攜帶的外源目的基因高效整合進(jìn)宿主細(xì)胞基因組中，外源目的基因可在細(xì)胞內(nèi)長期穩(wěn)定地表達(dá)。目前，慢病毒載體法已成功用于制備轉(zhuǎn)基因豬。利用慢病毒載體法制作轉(zhuǎn)基因豬，操作比較簡單，而且能夠確保研究者在很短的時間內(nèi)獲得目標(biāo)轉(zhuǎn)基因動物，具有高的胚胎存活率和高的轉(zhuǎn)基因效率［6］。

本課題組擬采用慢病毒載體法建立小型豬淋巴瘤模型。因為以小鼠為模型的實驗結(jié)果表明相對于其他實體腫瘤而言，淋巴瘤模型更容易誘發(fā)，而且耗時比較短。在淋巴瘤中，非霍奇金淋巴瘤（NHL）占多數(shù)，我國約為90%，臨床上大多數(shù)NHL為B細(xì)胞型，約占總數(shù)的70%～85%，所以本課題組基于B淋巴細(xì)胞建立轉(zhuǎn)基因豬淋巴瘤模型。

c-Myc基因最早發(fā)現(xiàn)于伯基特淋巴瘤患者中，是一個非常強的促癌基因，在許多類型腫瘤中的表達(dá)都上調(diào)；c-Myc蛋白屬于Myc轉(zhuǎn)錄因子家族，此家族還包括N-Myc和L-Myc基因；c-Myc被認(rèn)為調(diào)節(jié)15%基因的表達(dá)。另外，已經(jīng)有研究證實，在轉(zhuǎn)基因小鼠的特定臟器過表達(dá)c-Myc，可以誘導(dǎo)相應(yīng)臟器腫瘤的發(fā)生，比如淋巴瘤、肝癌［8，9］和乳腺癌［10，11］等。而且本課題組之前研究結(jié)果顯示，單一過表達(dá)c-Myc基因就可以使小型豬胚胎成纖維細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)變。此外，目前基于過表達(dá)c-Myc的轉(zhuǎn)基因小鼠和斑馬魚，已經(jīng)分別建立了小鼠和斑馬魚［12］的淋巴瘤模型。本課題組擬應(yīng)用慢病毒載體法，建立B細(xì)胞特異表達(dá)c-Myc的轉(zhuǎn)基因豬，以實現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因小型豬B淋巴細(xì)胞特異性過表達(dá)c-Myc轉(zhuǎn)基因，進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因小型豬發(fā)生淋巴瘤，并以期基于該轉(zhuǎn)基因豬創(chuàng)制淋巴瘤小型豬模型。希望能夠更加真實地揭示人類腫瘤發(fā)病情況，更真實地模擬人類腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)的整個動態(tài)過程，為生物制藥的研發(fā)和醫(yī)學(xué)臨床前研究提供更好的研究對象。

本研究為實現(xiàn)豬B淋巴細(xì)胞特異轉(zhuǎn)基因過表達(dá)c-Myc，采用人B淋巴細(xì)胞特異性啟動子Eμ-VH調(diào)控c-Myc和報告基因mRFP表達(dá)。mRFP一方面可用來監(jiān)測啟動子Eμ-VH是否有活性，另一方面也有助于利用流式細(xì)胞儀分選出轉(zhuǎn)基因過表達(dá)c-Myc的細(xì)胞以做進(jìn)一步相關(guān)分析。此外，載體pEMIR中亦引進(jìn)了受泛表達(dá)啟動子PGK調(diào)控的報告基因GFP，GFP利于慢病毒生產(chǎn)和病毒滴度測定，同時借助GFP也有助于轉(zhuǎn)基因豬可視化篩選和鑒定。

本研究成功構(gòu)建了人B淋巴細(xì)胞特異性啟動子Eμ-VH調(diào)控c-Myc表達(dá)的慢病毒載體pEMIR。通過pEMIR瞬時轉(zhuǎn)染293T、OCL-Ly3和OCL-Ly10細(xì)胞證實，啟動子Eμ-VH可以正常調(diào)控c-Myc和mRFP表達(dá)。數(shù)據(jù)證實載體pEMIR在人正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中均可發(fā)揮功能?？傊琾EMIR的成功構(gòu)建為借助慢病毒載體法制備B淋巴細(xì)胞特異過表達(dá)c-Myc的轉(zhuǎn)基因豬打下了良好基礎(chǔ)。

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Construction and function of a lentiviral vector harboring c-Myc gene under the control of Eμ-VH promoter

CHEN Lin，CHEN Yan，XIAO Dong

（1 Southern Medical University，Guangzhou 510515，China）

Objective To construct a lentiviral vector harboring c-Myc gene under the control of human B lymphocytespecific Eμ-VH promoter（pEMIR），and to investigate its function.Methods Firstly，taking pLV-c-Myc-IRES-EGFP as a template，after PCR amplification and enzyme digestion，we got pEVCHR.Secondly，taking plasmid pEVCHR as a template，after PCR amplification and enzyme digestion，we got a lentiviral vector pEMIR.pEMIR was transiently transfected into human embryonic kidney cells 293T and human diffuse large B-cell lymphoma cell line（OCL-LY3 or OCL-LY10）.The expression of enhanced green fluorescent protein（EGFP）and mono-red fluorescence protein（mRFP）was detected under inverted fluorescence microscope，and the expression of c-Myc mRNA and protein was detected by qRT-PCR and Western blotting.Results The electrophoresis results of Eμ--VH-c-Myc-H2BmRFP gene fragment were in agreement with the predicted value of 4129 bp，and the electrophoresis of the vector DNA showed a band that was consistent with the predicted value of 8561 bp.Enzyme digestion and DNA sequencing demonstrated that pEMIR was successfully constructed.Cells transiently transfected with pEMIR displayed the green and red fluorescence under inverted fluorescence microscope，and the expression of c-Myc was normal.Conclusion The lentiviral vector harboring c-Myc gene under the control of Eμ-VH promoter is successfully constructed，and the experiments in vitro demonstrate that it can be expressed in human normal cells and tumor cells.

Eμ-VH promoter；c-Myc oncogen；lentivirus vector；diffuse large B-cell lymphoma

10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.001

R394

A

1002-266X（2016）21-0001-03

廣東省產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究與開發(fā)專項資金資助項目（2013B060300013）。

陳琳（1987-），女，在讀碩士，主要研究方向為基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用及其機制、小型豬腫瘤模型。E-mail：1797342278＠qq.com

（2016-01-14）