袁建清，李志剛，黃櫻，王祥云，汪玲紅，廖春英

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西贛州341000)

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七氟烷預(yù)處理對(duì)缺血性腦損傷小鼠神經(jīng)保護(hù)作用及與TREK-1通道的關(guān)系

袁建清，李志剛，黃櫻，王祥云，汪玲紅，廖春英

(贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，江西贛州341000)

目的 觀察七氟烷預(yù)處理對(duì)缺血性腦損傷小鼠的神經(jīng)保護(hù)作用，并探討TREK-1通道與其保護(hù)作用的關(guān)系。方法 將野生型小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)1組、對(duì)照1組和假手術(shù)1組，TREK-1基因敲除型小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)2組、對(duì)照2組和假手術(shù)2組，各12只。實(shí)驗(yàn)組吸入最小肺泡濃度七氟烷，對(duì)照組和假手術(shù)組吸入100%空氣，均30 min/次，1次/d，連續(xù)處理4 d。實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組采用線栓法建立局灶性腦缺血再灌注模型，假手術(shù)組僅分離并結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈。用雙盲法對(duì)神經(jīng)功能缺損程度進(jìn)行評(píng)分；將小鼠處死取腦組織，用TTC染色法測(cè)定腦梗死面積；用免疫熒光法檢測(cè)腦組織中TREK-1表達(dá)；用TUNEL法檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡。結(jié)果 野生型小鼠腦片可見(jiàn)TREK-1大量、廣泛地表達(dá)于其海馬、皮層、腦室旁，而TREK-1基因敲除型小鼠腦片未見(jiàn)明顯TREK-1表達(dá)。造模后24 h，實(shí)驗(yàn)1組神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分、腦梗死面積、腦組織凋亡細(xì)胞百分比低于對(duì)照1組、實(shí)驗(yàn)2組(P均<0.05)，實(shí)驗(yàn)2組以上指標(biāo)與對(duì)照2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。結(jié)論 七氟烷預(yù)處理對(duì)缺血性腦損傷小鼠有神經(jīng)保護(hù)作用，TREK-1通道參與該作用過(guò)程。

缺血性腦損傷；TREK-1通道；七氟烷；小鼠

七氟烷是一種臨床常用的揮發(fā)性麻醉藥。近期有研究表明，七氟烷預(yù)處理在小鼠腦缺血中具有神經(jīng)保護(hù)作用，但其作用機(jī)制目前尚未完全明確[1]。TREK-1通道是一種新型的雙孔鉀離子通道亞型，可被機(jī)械牽張、多聚不飽和脂肪酸和一些揮發(fā)性麻醉藥如氟烷、七氟烷、乙醚等激活。TREK-1通道開(kāi)放后，介導(dǎo)線性I-V關(guān)系的背景K電流和低的膜電位，有助于調(diào)控水及離子動(dòng)態(tài)平衡、清除興奮性毒性物質(zhì)及氧自由基，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[2]。2016年1月筆者通過(guò)七氟烷預(yù)處理TREK-1基因敲除型和野生型小鼠，觀察七氟烷預(yù)處理對(duì)小鼠缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用，并探討TREK-1通道與該保護(hù)作用的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料及儀器 健康雄性8周齡野生型和TREK-1基因敲除型C57 BL/6J小鼠各36只，體質(zhì)量21～29 g，由贛南醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。七氟烷(美國(guó)Baxter公司)，氯化三苯基四氮唑(TTC)、4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(美國(guó)Sigma公司)，兔抗TREK-1(以色列Alomone Labs公司)，TUNEL試劑盒(美國(guó)Milipore公司)，花青素(Cy3)標(biāo)記的驢抗兔IgG、普通小牛血清、普通羊血清和普通驢血清(美國(guó)Jackson ImmunoResearch公司)。CM1900型恒冷切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)，F(xiàn)V500型激光掃描共聚焦顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 動(dòng)物分組及預(yù)處理 將野生型小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)1組、對(duì)照1組和假手術(shù)1組各12只，TREK-1基因敲除型小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)2組、對(duì)照2組和假手術(shù)2組各12只。實(shí)驗(yàn)組行七氟烷預(yù)處理，將小鼠放入麻醉呼吸箱(Drager公司)中，保持其清醒呼吸狀態(tài)，吸入最小肺泡濃度七氟烷(2.4%七氟烷/空氣)；對(duì)照組和假手術(shù)組吸入100%空氣。均30 min/次，1次/d，連續(xù)處理4 d。預(yù)處理結(jié)束后24 h，進(jìn)行局灶性腦缺血再灌注(MCAO)模型制備。預(yù)處理期間監(jiān)測(cè)各組生理指標(biāo)(pH、PaCO2、PaO2)，維持肛溫(37±0.5)℃。

1.3 MCAO模型制備 應(yīng)用線栓法建立MCAO模型[3]。各組均用6%水合氯醛麻醉(300 mg/kg)，術(shù)中維持動(dòng)物直腸溫度(36.6±0.5)℃。分離并結(jié)扎右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠于頸總動(dòng)脈近頸內(nèi)動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈分叉處剪一小口，將一直徑0.3 mm、前端5 mm處涂硅膠的尼龍魚(yú)線插入頸內(nèi)動(dòng)脈，距頸總動(dòng)脈分叉處1.8～2.0 cm，1 h后全部拔出絲線進(jìn)行再灌注，假手術(shù)組除不插線栓外余步驟同上。術(shù)后各組于20 ℃的空調(diào)環(huán)境下單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)水、進(jìn)食。

1.4 各組神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分 造模后24 h，通過(guò)雙盲法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]：0分，無(wú)神經(jīng)功能缺損；1分，不能完全伸直右側(cè)前爪；2分，向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分，向右側(cè)傾倒；4分，無(wú)自動(dòng)活動(dòng)伴有意識(shí)障礙；5分，死亡。

1.5 小鼠腦梗死面積測(cè)定 采用TTC染色法。造模后24 h，各組隨機(jī)取6只小鼠，斷頭取腦，自視交叉前4 mm開(kāi)始連續(xù)冠狀面冰凍切片(2 mm厚)。共取6片切片，置于2% TTC中染色，37 ℃避光孵育20 min，存活組織深紅，壞死組織呈白色，數(shù)碼相機(jī)(DSC-T300，SONY)拍照，輸入計(jì)算機(jī)，用Image Tool圖像處理軟件進(jìn)行不顯色部分面積分析，并計(jì)算梗死面積，梗死面積=(∑缺血對(duì)側(cè)面積×2 mm-∑缺血同側(cè)未梗死面積×2 mm)/(∑對(duì)側(cè)面積×2 mm)×100%[5,6]。

1.6 小鼠腦組織中TREK-1表達(dá)檢測(cè) 采用免疫熒光法。造模后3 d，各組各取剩余6只小鼠快速斷頭取腦，將腦組織置于-80 ℃冷凍保存。-20 ℃恒冷切片機(jī)自視交叉處開(kāi)始，行10 μm厚連續(xù)冠狀切片。冰凍切片置4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中(4 ℃)固定15 min，PBS振蕩清洗3次，每次5 min，滴加3%普通驢血清封閉液封閉2 h，棄血清，滴加兔抗TREK-1(1∶200)，對(duì)照組不加一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；PBS振蕩清洗3次，每次5 min，滴加驢抗兔Cy3(1∶200)，室溫避光孵育1 h，流水沖洗40 min，50%甘油封片。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)為550/565 nm的CY3呈紅色熒光，表示TREK-1蛋白陽(yáng)性。

1.7 小鼠腦組織細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用TUNEL法檢測(cè)腦組織細(xì)胞凋亡。TUNEL染色嚴(yán)格按照TUNEL試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，加DAPI復(fù)染細(xì)胞核。Olympus BX51熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況，TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞。每張片子隨機(jī)取5個(gè)視野，同一曝光條件下照相，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組造模前后神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分比較 造模前各組小鼠神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分為0分。造模后24 h，實(shí)驗(yàn)1組、對(duì)照1組、假手術(shù)1組神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分分別為(1.5±0.5)、(3.5±0.7)、0分，實(shí)驗(yàn)2組、對(duì)照2組、假手術(shù)2組分別為(3.0±0.7)、(3.5±0.8)、0分；實(shí)驗(yàn)1組評(píng)分低于對(duì)照1組、實(shí)驗(yàn)2組(P均<0.05)，實(shí)驗(yàn)2組評(píng)分與對(duì)照2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2 各組腦梗死面積比較 造模后24 h，實(shí)驗(yàn)1組、對(duì)照1組、假手術(shù)1組腦梗死面積分別為(16.58±5.88)%、(31.98±10.14)%、0，實(shí)驗(yàn)2組、對(duì)照2組、假手術(shù)2組分別為(25.12±8.91)%、(32.30±10.24)%、0；實(shí)驗(yàn)1組腦梗死面積少于對(duì)照1組、實(shí)驗(yàn)2組(P均<0.05)，實(shí)驗(yàn)2組腦梗死面積與對(duì)照2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 各組腦組織中TREK-1表達(dá)比較 野生型小鼠腦片可見(jiàn)TREK-1大量、廣泛地表達(dá)于其海馬、皮層、腦室旁，而TREK-1基因敲除小鼠腦片未見(jiàn)明顯TREK-1表達(dá)。

2.4 各組腦組織細(xì)胞凋亡比較 造模后3 d，假手術(shù)1組、實(shí)驗(yàn)1組、對(duì)照1組凋亡細(xì)胞百分比分別為(1.27±0.25)%、(9.90±1.68)%、(31.75±2.90)%，假手術(shù)2組、實(shí)驗(yàn)2組、對(duì)照2組分別為(1.40±0.28)%、(30.22±3.37)%、(33.27±3.02)%；實(shí)驗(yàn)1組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分比低于對(duì)照1組、實(shí)驗(yàn)2組(P均<0.05)，實(shí)驗(yàn)2組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞百分比與對(duì)照2組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

缺血性腦損傷是一種致死率、致殘率極高的多發(fā)病、常見(jiàn)病，且易再發(fā)和復(fù)發(fā)，嚴(yán)重危害人類身心健康，并帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。探討治療缺血性腦損傷的有效措施和藥物，是近年來(lái)醫(yī)學(xué)研究的一大熱點(diǎn)[7]。七氟烷是臨床上常用的一種揮發(fā)性麻醉藥，可增加腦血流量，降低腦的氧代謝率[8]。近期有研究表明，吸入性麻醉藥七氟烷在腦缺血中具有神經(jīng)保護(hù)作用[9～11]。但其作用的具體機(jī)制尚不清楚，可能對(duì)腦血流量、腦代謝、炎癥因子及其相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生一定影響[12]。有研究認(rèn)為，七氟烷可減少核因子κB入核，降低其轉(zhuǎn)錄調(diào)控的炎癥因子如環(huán)氧化酶2、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、腫瘤壞死因子α、白細(xì)胞介素1(IL-1)、IL-6等來(lái)抑制炎癥反應(yīng)[13]；激活KATP通道，抑制缺血期神經(jīng)元的鈣離子和興奮性氨基酸濃度的升高[12]；抑制腦缺血后的細(xì)胞凋亡[1,14]，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。國(guó)外通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)離體研究表明，雙孔鉀通道TREK-1參與了七氟烷預(yù)處理在腦缺血中的神經(jīng)保護(hù)作用。TREK-1通道是一種新型的雙孔鉀離子通道亞型，可被機(jī)械牽張、多聚不飽和脂肪酸、溶血磷脂和一些揮發(fā)性麻醉藥如氟烷、七氟烷、乙醚、氙氣等激活[15]。TREK-1廣泛表達(dá)于大鼠海馬、皮層，其活性可影響腦缺血時(shí)星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖活化以及平衡緩沖功能[16,17]。TREK-1通道開(kāi)放后，表達(dá)具有線性I-V關(guān)系的背景鉀電流，在細(xì)胞膜靜息電位的形成和膜電位的復(fù)極化中起重要作用。其能穩(wěn)定膜電位，調(diào)節(jié)細(xì)胞的興奮性，使細(xì)胞膜超極化，減少鈣離子內(nèi)流，降低谷氨酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和興奮性細(xì)胞毒性[2,15]。

本研究通過(guò)七氟烷預(yù)處理TREK-1基因敲除型和野生型小鼠后，建立MCAO，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，七氟烷可減輕野生型小鼠MCAO后的神經(jīng)功能缺損程度，減少腦梗死面積，抑制腦缺血后的細(xì)胞凋亡，但七氟烷預(yù)處理TREK-1基因敲除型后，則無(wú)以上作用。證實(shí)了七氟烷預(yù)處理對(duì)小鼠腦缺血后有神經(jīng)保護(hù)作用，且TREK-1通道參與了該保護(hù)作用，并推測(cè)這可能與七氟烷開(kāi)放TREK-1通道，使細(xì)胞膜電位超極化，細(xì)胞興奮性降低，減少興奮性毒性損傷，從而減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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