張順禮, 胡繼衛(wèi), 馬　杰, 張景華, 王　宇, 谷　崢, 陳晶晶

(河北省唐山市人民醫(yī)院 乳腺外一科, 河北 唐山, 063001)

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不同亞型乳腺癌組織中p16基因甲基化與蛋白表達(dá)及臨床病理特征的關(guān)系

張順禮, 胡繼衛(wèi), 馬杰, 張景華, 王宇, 谷崢, 陳晶晶

(河北省唐山市人民醫(yī)院 乳腺外一科, 河北 唐山, 063001)

摘要:目的探討不同亞型乳腺癌組織中p16基因甲基化與蛋白表達(dá)及臨床病理特征的關(guān)系。方法PCR法檢測(cè)55例乳腺浸潤(rùn)型導(dǎo)管癌組織中p16基因甲基化情況，免疫組化法檢測(cè)p16蛋白表達(dá)情況，分析p16基因甲基化與蛋白表達(dá)及臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果55例標(biāo)本中，共12例(21.82%)發(fā)生p16基因甲基化，21例(38.18%)p16蛋白表達(dá)陽(yáng)性，其中基底樣型基因甲基化發(fā)生率顯著高于Luminal A型(P<0.05)，蛋白表達(dá)陽(yáng)性率顯著低于Luminal A型(P<0.05)。發(fā)生基因甲基化的組織中p16蛋白陽(yáng)性表達(dá)率為16.67%，未發(fā)生甲基化的組織中陽(yáng)性表達(dá)率為44.19%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。組織學(xué)分級(jí)Ⅱ～Ⅲ級(jí)、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ER蛋白表達(dá)陰性的組織中甲基化發(fā)生率高于組織學(xué)Ⅰ級(jí)、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ER蛋白表達(dá)陽(yáng)性的組織(P<0.05)。結(jié)論p16基因甲基化可能是基底樣型乳腺癌的重要分子特征之一，且與乳腺癌的病情進(jìn)展有關(guān)，可能成為預(yù)后評(píng)估及靶向治療的重要指標(biāo)。

關(guān)鍵詞:乳腺癌; 基底樣型乳腺癌; 抑癌基因p16; 甲基化

It is also valuable to disease prognosis and gene targeted therapy.

乳腺癌發(fā)生發(fā)展涉及多個(gè)基因的異常表達(dá)，DNA甲基化、組蛋白修飾、基因組印跡及非編碼RNA調(diào)控等表觀遺傳的改變?cè)诨虍惓１磉_(dá)中起關(guān)鍵作用，尤其是DNA甲基化可抑制抑癌基因轉(zhuǎn)錄導(dǎo)致其表達(dá)缺失，促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展[1-2]。抑癌基因p16編碼蛋白可抑制細(xì)胞周期進(jìn)展，是重要的細(xì)胞周期負(fù)向調(diào)控因子[3]。p16基因的變異形式包括點(diǎn)突變、甲基化及基因缺失，其中DNA甲基化是其基因失活的最重要機(jī)制，且甲基化通常在組織惡變之前就已經(jīng)發(fā)生，對(duì)癌前病變的早期診斷具有重要意義。大量研究[4-6]表明，p16基因甲基化在肺癌、甲狀腺癌、乳腺癌等惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，可作為疾病進(jìn)展的預(yù)測(cè)指標(biāo)之一。本研究通過(guò)檢測(cè)不同分子亞型乳腺癌組織中p16基因甲基化及蛋白表達(dá)的情況并探討其相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2013年5月—2015年5月河北省唐山市人民醫(yī)院收治的乳腺癌患者55例，納入標(biāo)準(zhǔn): ① 符合相關(guān)指南[7]標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)病理學(xué)檢查確診為浸潤(rùn)型導(dǎo)管癌; ② 術(shù)前未接受放、化療。患者均為女性，年齡39～60歲，中位年齡50歲；組織學(xué)分級(jí)：Ⅰ級(jí)18例，Ⅱ級(jí)22例，Ⅲ級(jí)15例；分子亞型：基底樣型10例, Luminal A型16例, Luminal B型14例，HER-2過(guò)表達(dá)型15例。收集55例患者的乳腺癌標(biāo)本組織待測(cè)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2方法

1.2.1儀器和試劑: ① 主要儀器。PCR擴(kuò)增儀, Oplympus全自動(dòng)顯微鏡掃描系統(tǒng)，凝膠成像分析系統(tǒng)，低溫高速離心機(jī)等。② 主要試劑。p16抗體，石蠟組織DNA提取試劑盒鏈霉卵白素(SP)試劑盒，DNA甲基化修飾試劑盒，DNA甲基化PCR試劑盒，甲基聯(lián)苯胺(DAB)試劑等。

1.2.2PCR法檢測(cè)p16基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)：所有標(biāo)本均經(jīng)福爾馬林固定后石蠟包埋，HE染色。石蠟組織連續(xù)切片后按說(shuō)明書(shū)提取基因組DNA，以紫外分光光度儀檢測(cè)其水平及純度。DNA經(jīng)修飾后，未甲基化的胞嘧啶(C)變?yōu)槟蜞奏?U)，甲基化的胞嘧啶(Cm)無(wú)改變。修飾后的DNA行PCR擴(kuò)增，甲基化引物片段為150 bp，未甲基化引物片段150 bp。

1.2.3免疫組化SP法檢測(cè)p16蛋白表達(dá)：組織切片脫蠟至水，抗原修復(fù)后采用雙氧水孵育，血清封閉，滴加p16抗體，PBS沖洗3次，滴加二抗后繼續(xù)孵育，滴加SP顯色。

1.3判定標(biāo)準(zhǔn)

甲基化判定標(biāo)準(zhǔn)：在凝膠成像分析系統(tǒng)下觀察DNA擴(kuò)增產(chǎn)物，出現(xiàn)150 bp產(chǎn)物為基因甲基化，出現(xiàn)151 bp產(chǎn)物為未發(fā)生甲基化。

蛋白表達(dá)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[8]：細(xì)胞核和細(xì)胞漿均出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性，于高倍鏡下隨機(jī)數(shù)10個(gè)視野觀察，綜合染色強(qiáng)度及陽(yáng)性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞的比例2項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行計(jì)分，2項(xiàng)分值乘積>3分判為陽(yáng)性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0軟件，定性資料采用百分比表示，采用卡方檢驗(yàn)；定量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1不同亞型乳腺癌組織中p16基因甲基化及蛋白表達(dá)的情況

55例標(biāo)本中，共12例(21.82%)發(fā)生p16基因甲基化。基因甲基化發(fā)生率在Luminal A型、Luminal B、HER-2過(guò)表達(dá)型及基底樣型中分別為12.50%(2/16)、21.43%(3/14)、20.00%(3/15)及40.00%(4/10)，其中基底樣型基因甲基化發(fā)生率顯著高于Luminal A型(P<0.05)。

55例標(biāo)本中，出現(xiàn)p16蛋白陽(yáng)性21例(38.18%)，p16蛋白在細(xì)胞核、細(xì)胞漿內(nèi)呈現(xiàn)不均勻染色，見(jiàn)圖1。在Luminal A型、Luminal B、HER-2過(guò)表達(dá)型及基底樣型p16蛋白陽(yáng)性率分別為50.00%(8/16)、42.86%(6/14)、33.33%(5/15)及20.00(2/10)，其中基底樣型p16蛋白陽(yáng)性率顯著低于Luminal A型(P<0.05)。

2.2p16基因甲基化與蛋白表達(dá)的關(guān)系

12例發(fā)生p16基因甲基化的標(biāo)本中，2例(16.67%)表達(dá)p16蛋白，10例(83.33%)未表達(dá)；43例未發(fā)生基因甲基化的標(biāo)本中，19例(44.19%)表達(dá)p16蛋白，24例(55.81%)未表達(dá)。發(fā)生基因甲基化與未發(fā)生的組織中p16蛋白陽(yáng)性表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3p16基因甲基化與臨床病理特征的關(guān)系

分析p16基因甲基化與乳腺癌患者臨床病理特征的關(guān)系，不同患者年齡、腫瘤直徑及PR蛋白表達(dá)的組織中p16基因甲基化發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；組織學(xué)分級(jí)Ⅱ～Ⅲ級(jí)、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ER蛋白表達(dá)陰性的組織中甲基化發(fā)生率顯著高于組織學(xué)Ⅰ級(jí)、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及ER蛋白表達(dá)陽(yáng)性的組織(P<0.05)。見(jiàn)表1。

與同一病理特征的另一亞項(xiàng)比較, *P<0.05。

3討論

乳腺癌的分子發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，其發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因共同協(xié)作的漸進(jìn)累積過(guò)程，表觀遺傳機(jī)制在此過(guò)程中發(fā)揮重要作用。DNA甲基化作為表觀遺傳學(xué)的重要內(nèi)容，為乳腺癌的早期診斷與靶向治療提供了新思路。抑癌基因p16屬于周期依賴(lài)性激酶抑制因子基因家族，其編碼的蛋白可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[9]，阻止DNA損傷的細(xì)胞發(fā)生分裂和增殖；p16基因信號(hào)通路在不同亞型乳腺癌發(fā)生發(fā)展中可能發(fā)揮不同作用[10]。近年來(lái)研究[11]表明，p16基因啟動(dòng)子CpG島甲基化后發(fā)生基因沉默，細(xì)胞出現(xiàn)生存優(yōu)勢(shì)，直接促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。

目前，p16基因甲基化在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用報(bào)道[12]較多，但大多集中于癌癥組織與良性病變組織中甲基化情況的對(duì)比；關(guān)于不同分子亞型乳腺癌組織中基因甲基化的研究方面，則多集中于SFRP1等其他基因[13]，偶見(jiàn)全基因組甲基化及基因表達(dá)概況的研究[14]。本研究檢測(cè)了55例不同分子亞型乳腺癌組織中p16基因甲基化及蛋白表達(dá)情況，結(jié)果表明，基底樣型乳腺癌組織中p16基因甲基化發(fā)生率最高，蛋白表達(dá)陽(yáng)性率最低，提示基底樣型乳腺癌組織中p16基因的表達(dá)情況較為特殊，p16基因啟動(dòng)子甲基化可能在基底樣型乳腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮更為重要的作用。ER、PR蛋白陽(yáng)性表達(dá)的乳腺癌患者對(duì)內(nèi)分泌治療較為敏感，且預(yù)后較好，目前關(guān)于這2種蛋白與p16基因甲基化的相關(guān)性尚存在爭(zhēng)議[8]。本研究進(jìn)一步分析p16基因甲基化與臨床病理特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，ER表達(dá)陽(yáng)性患者p16基因甲基化發(fā)生率低于陰性患者，提示兩者可能存在負(fù)相關(guān)，與Tao等[15]報(bào)道一致；而PR蛋白表達(dá)情況與p16基因甲基化無(wú)明顯相關(guān)性，與李莉等[16]報(bào)道一致。此外，乳腺癌的組織學(xué)分級(jí)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況是判定預(yù)后的重要指標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn)，組織學(xué)分級(jí)為Ⅱ～Ⅲ級(jí)，以及伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織中p16基因甲基化的發(fā)生率更高，提示p16基因甲基化與病情進(jìn)展有關(guān)，可能成為預(yù)測(cè)乳腺癌預(yù)后的參考指標(biāo)，與Barekati[17]、聶艷紅等[18]報(bào)道一致。

綜上所述，基底樣型乳腺癌組織中p16基因甲基化發(fā)生率高于其他分子亞型，蛋白表達(dá)率低于其他分子亞型。此外，p16基因甲基化與乳腺癌病情進(jìn)展密切相關(guān)，可能成為預(yù)后評(píng)估及靶向治療的參考指標(biāo)。

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Methylation of p16 gene promoter in different subtypes of breast cancer and its association with p16 protein expression and clinic pathological characteristics

ZHANG Shunli, HU Jiwei, MA Jie, ZHANG Jinghua, WANG Yu,GU Zheng, CHEN Jingjing

(DepartmentofBreastSurgery,TangshanPeople′sHospital,Tangshan,Hebei, 063001)

KEYWORDS:breast carcinoma; basal-like breast carcinoma; p16 gene; methylation

ABSTRACT:ObjectiveTo investigate the methylation of p16 gene promoter in different subtypes of breast cancer and its association with p16 protein expression and clinic pathological characteristics. MethodsMethylation-specific PCR was applied to detect methylation of p16 gene promoter and immune-histochemistry technique was used to detect p16 protein expression in 55 tissue samples of invasive ductal breast cancer. The relationship between methylation of p16 gene promoter and p16 protein expression and clinic pathological characteristics was analyzed. ResultsOut of 55 tissue samples, there were 12 cases (21.82%) with positive outcome in methylation and 21 cases (38.18%) with positive protein expression respectively. The methylation rate of p16 gene promoter was significantly higher and positive expression rate of p16 protein was significantly lower in those diagnosed as basal-like breast carcinoma than those as luminal A subtypes breast carcinoma (P<0.05). The positive expression rate of p16 protein was 16.67% in those with positive methylation and was 44.19% in those with negative methylation (P<0.05). The incidence rate of p16 gene promoter methylation was significantly higher in tissue samples with histological gradeⅡ～Ⅲ, lymph node metastasis, ER-negative than those with histological gradeⅠ, non-lymph node metastasis, ER-positive (P<0.05). ConclusionThe methylation of p16 gene promoter, as an important molecular feature to basal-like breast carcinoma, is potentially associated with disease progression.

收稿日期:2016-03-10

通信作者:張景華, E-mail: JHZH2010@163. com

中圖分類(lèi)號(hào):R 737.9

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1672-2353(2016)11-047-03

DOI:10.7619/jcmp.201611014