羅忠圣， 錢志瑤， 周 鎂， 黃秀平， 桂珊珊， 覃容貴*

（1.貴州康琦藥械有限公司，貴州貴陽550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽550004）

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正交試驗(yàn)優(yōu)選二巖虎果湯的水提醇沉工藝

羅忠圣1， 錢志瑤2， 周 鎂2， 黃秀平2， 桂珊珊2， 覃容貴2*

（1.貴州康琦藥械有限公司，貴州貴陽550025；2.貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，貴州貴陽550004）

摘要：目的 優(yōu)選二巖虎果湯的水提醇沉工藝。方法 以石吊蘭素含有量和浸膏得率的綜合評(píng)分為指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)考察加水量、提取次數(shù)、提取時(shí)間對(duì)水提工藝的影響，再考察藥液濃縮比例、乙醇沉降體積分?jǐn)?shù)、靜置時(shí)間對(duì)醇沉工藝的影響。然后，進(jìn)行水提醇沉工藝及藥效學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果 最佳提取工藝是加10倍量水，提取1次，每次1 h；最佳醇沉工藝是提取液減壓濃縮至藥材量與藥液的體積比為2∶1，加入乙醇量為75％，靜置12 h后除去沉淀。結(jié)論 該工藝所得產(chǎn)品與二巖虎果湯水提液的止咳抗炎作用無差異，而且穩(wěn)定可行，不影響藥效，可為其規(guī)范化生產(chǎn)提供參考。

關(guān)鍵詞：二巖虎果湯；水提醇沉工藝；石吊蘭素；浸膏得率；正交試驗(yàn)；止咳抗炎作用

二巖虎果湯復(fù)方的單味藥均為苗藥，由君藥巖豇豆、臣藥巖白菜、佐藥虎杖、使藥果上葉組成，為貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院名老中醫(yī)饒?zhí)炫嘟?jīng)驗(yàn)方，四味藥配伍合用時(shí)性涼，具有辛良解表、宣肺、補(bǔ)虛、化痰止咳、清血熱、解毒、養(yǎng)陰清肺等功效，可止咳、祛痰、平喘、抗炎，臨床主要用于治療大葉性肺炎、急性支氣管炎、小兒哮喘等，未見不良反應(yīng)。為了將傳統(tǒng)的二巖虎果湯水煎劑開發(fā)為現(xiàn)代中藥制劑，本實(shí)驗(yàn)采用正交試驗(yàn)法對(duì)其水提醇沉工藝進(jìn)行研究，結(jié)果報(bào)道如下。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agi1ent 1100高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；R308旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海申生科技有限公司）；HZT-A500、AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；98-1-C數(shù)字控溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；AS系列超聲波清洗機(jī)（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）。

1.2 材料 石吊蘭素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)111555-200602，20 mg）。甲醇為色譜純（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）；水為色譜純（自制）；其他試劑為分析純。巖豇豆、巖白菜、虎杖、巖果藥材均購(gòu)自貴州省貴陽市萬東橋中藥材市場(chǎng)，經(jīng)貴陽醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院覃容貴教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 石吊蘭素的測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取石吊蘭素對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含50 μg石吊蘭素的溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 按照處方比例稱取藥材適量，水提或水提醇沉后，將提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮成流浸膏，水浴蒸干，105℃恒溫干燥箱中干燥3 h，制成浸膏。再精密稱取浸膏粉末0.5 g，研細(xì)，置于具塞錐形瓶中，精密加入75％甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（240 W、40 kHz）20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，75％甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方比例（不含巖豇豆）稱取藥材適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.1.4 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 采用Diamonsi1（R）鉆石C18色譜柱（5 μm，250 mm×4.6 mm），包括VWD檢測(cè)器；流動(dòng)相為甲醇-水（50∶50）；檢測(cè)波長(zhǎng)330 nm；體積流量1 mL/min；柱溫30℃；進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)按石吊蘭素峰計(jì)算，應(yīng)不小于3 000。

在選定色譜條件下，取對(duì)照品、供試品、陰性對(duì)照品溶液各10 μL分別進(jìn)樣。結(jié)果，測(cè)得石吊蘭素對(duì)照品的保留時(shí)間約為69.9 min；供試品色譜中石吊蘭素峰與雜峰的分離效果良好，分離度大于2.0；理論塔板數(shù)按石吊蘭素峰計(jì)算，應(yīng)不小于3 000；陰性對(duì)照色譜在相應(yīng)位置上，無干擾峰產(chǎn)生，具體見圖1。

圖1　二巖虎果湯的HPLC色譜圖

2.1.5 線性關(guān)系考察 精密移取標(biāo)準(zhǔn)品母液（50 μg/mL）1、2、3、4、5 mL，加甲醇稀釋至10 mL，搖勻，微孔濾膜過濾，在“2.1.4”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定石吊蘭素峰的峰面積。以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（y），石吊蘭素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y=29.324x-6.1，r=0.999 7，表明石吊蘭素對(duì)照品在5～25 μg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，其RSD為0.38％，表明儀器精密度良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同批浸膏粉末0.5 g，共6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀測(cè)定，計(jì)算石吊蘭素的含有量。結(jié)果，浸膏中石吊蘭素的平均含有量為15.85 μg/mL，RSD 為0.66％，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 分別于0、2、4、6、8、12、24 h精密吸取供試品溶液（16.0 μg/mL）10 μL，注入液相色譜儀，記錄石吊蘭素的峰面積。結(jié)果，其RSD為1.12％，表明石吊蘭素溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.9 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品9份，每份0.25 g（含石吊蘭素1.42 mg/g），分為3組，分別精密加入質(zhì)量濃度為60、70、80 μg/mL的石吊蘭素對(duì)照品溶液5 mL，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果，平均回收率為99.72％，RSD為1.12％（n =9）。

2.1.10 樣品的測(cè)定 精密稱取正交試驗(yàn)所得的浸膏樣品適量，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。每份樣品測(cè)定兩次，按回歸方程計(jì)算，以平均值為測(cè)定值，計(jì)算樣品中石吊蘭素的含有量。

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化水提醇沉工藝

2.2.1 水提工藝設(shè)計(jì)［1-2］以加水量、提取次數(shù)、提取時(shí)間為考察因素，以石吊蘭素含有量和浸膏得率為考察指標(biāo)，選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平見表1。

表1　正交試驗(yàn)因素水平

2.2.2 水提工藝正交試驗(yàn)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析 以表2中的L9（34）設(shè)計(jì)表進(jìn)行9組試驗(yàn)，以石吊蘭素含有量和浸膏得率為指標(biāo)，同時(shí)以兩者的最大值為參照進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一，得出權(quán)重系數(shù)。將石吊蘭素含有量的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.7，由于原二巖虎果湯方中有效成分不明確，通常以浸出物得率為指標(biāo)，因此將其權(quán)重系數(shù)設(shè)定為0.3，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。水提正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。綜合評(píng)分M=0.7X×100/2.256 +0.3Y×100/26.307。

表2　水提工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

表3　水提工藝正交試驗(yàn)方差分析

從直觀分析中的極差大小來看，其影響因素順序?yàn)樘崛r(shí)間（C）＞加水量（A）＞提取次數(shù)（B）。比較各因素不同水平綜合評(píng)分的均值發(fā)現(xiàn)，對(duì)于因素C，其優(yōu)劣次序?yàn)?＞2＞1；對(duì)于因素A，其優(yōu)劣次序?yàn)?＞2＞1；對(duì)于因素B，其優(yōu)劣次序?yàn)?＞2＞3。

從方差分析結(jié)果來看，由于F0.05（2，2）=19，提取時(shí)間（C）、加水量（A）和提取時(shí)間（B）均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能是由于石吊蘭素為醇溶性物質(zhì)，在水溶液中的溶解度較低所致。綜合考慮，確定最優(yōu)提取方案為A3B1C3，即加水量12倍，提取1次，每次2 h。

2.2.3 醇沉工藝設(shè)計(jì)［3-5］以醇沉濃度、藥液濃縮比例和靜置時(shí)間為考察因素，以石吊蘭素含有量、浸膏得率為考察指標(biāo)，采用L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)醇沉工藝進(jìn)行優(yōu)選，因素水平見表4。

表4　醇沉工藝正交試驗(yàn)因素水平

2.2.4 醇沉工藝正交試驗(yàn)結(jié)果及統(tǒng)計(jì)分析 將石吊蘭素的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.7，浸膏得率的權(quán)重系數(shù)設(shè)為0.3，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。醇沉正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。綜合評(píng)分M=0.7X×100/2.478 +0.3Y× 100/24.217。

表5　醇沉工藝正交試驗(yàn)結(jié)果

表6　醇沉工藝正交試驗(yàn)方差分析

從直觀分析中的極差大小來看，其影響因素順序?yàn)榇汲翝舛龋˙）＞藥液濃縮比例（A）＞靜置時(shí)間（C）。比較各個(gè)因素不同水平綜合評(píng)分的均值發(fā)現(xiàn)，對(duì)于因素B，其優(yōu)劣次序?yàn)?＞3＞1；對(duì)于因素A，其優(yōu)劣次序?yàn)?＞2＞1；對(duì)于因素C，其優(yōu)劣次序?yàn)?＞3＞1。

從方差分析來看，由于F（1，2）=19，醇沉濃度（B）相對(duì)于藥液濃縮比例（A）和靜置時(shí)間（C）有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合考慮，因A（藥液濃縮比例）、C（靜置時(shí)間）對(duì)結(jié)果無顯著性影響，而且各水平相近，故考慮實(shí)際情況，確定最優(yōu)提取方法為A3B2C1，即提取液濃縮至藥材量與藥液的體積比為2∶1，醇沉濃度為75％，靜置12 h。

2.2.5 水提醇沉工藝驗(yàn)證 按處方比例，稱取1/10處方量藥材3份，即巖豇豆、巖白菜、虎杖、果上葉各3 g，剪碎混合，按優(yōu)選的水提醇沉工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，即加12倍量水，提取1次，每次2 h，提取液減壓濃縮至藥材量與藥液的體積比為2∶1，加入乙醇量75％，靜置12 h。濃縮后，置于105℃恒溫干燥箱中干燥3 h，再置于干燥器中冷卻30 min，迅速稱重，計(jì)算浸膏得率，測(cè)定其中石吊蘭素的含有量，結(jié)果見表7。由表可知，按最佳水提醇沉方案試驗(yàn)，浸膏得率可控制在21％左右，石吊蘭素含有量大于2.2 mg/g，表明優(yōu)選的工藝穩(wěn)定可行。

表7　驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 水提醇沉工藝的藥效學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 樣品的制備

原水提組：取巖豇豆、巖白菜、虎杖、果上葉各30 g，加10倍量水加熱煎煮2次，每次2 h，濾過，合并濾液并濃縮，即每1 mL濃縮液相當(dāng)于藥材量1 g，備用。

水提醇沉組：取巖豇豆、巖白菜、虎杖、果上葉各30 g，按水提醇沉工藝優(yōu)選條件制備樣品，濾液濃縮，回收乙醇，即每1 mL濃縮液相當(dāng)于藥材量1 g，備用。

2.3.2 藥效學(xué)考察 止咳試驗(yàn)［6-8］：取小鼠30只，分為模型對(duì)照組、原水提組、水提醇沉組，每組10只，按20 mL/kg劑量分別灌胃給藥，其中模型對(duì)照組給予同體積蒸餾水，每天1次，連續(xù)給藥7 d。第7天給藥1 h后，依次將小鼠置于噴霧器中，濃氨水恒壓定量噴霧10 s，立即取出，觀察小鼠是否腹肌收縮并同時(shí)張開大口，以此為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)咳嗽一次，統(tǒng)計(jì)小鼠開始咳嗽的時(shí)間（咳嗽潛伏期）。同時(shí)，繼續(xù)觀察并記錄3 min內(nèi)小鼠的咳嗽次數(shù)。

抗炎試驗(yàn)［9-11］：取小鼠30只，分組及給藥方法同上。第7天給藥40 min后，依次在小鼠右耳的兩面分別涂以0.04 mL二甲苯致腫，其中正常對(duì)照組為小鼠左耳，1 h后處死，分別在小鼠正常對(duì)照組左耳和二甲苯右耳的同一部位，用直徑5 mm的打孔器打下耳片，分別稱定質(zhì)量，記錄，計(jì)算耳腫脹率，公式為腫脹率=（右耳質(zhì)量-左耳質(zhì)量）/左耳質(zhì)量。

鎮(zhèn)咳、抗炎實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別見表8、表9。由表可知，與模型對(duì)照組比較，水提醇沉組具有明顯的延長(zhǎng)小鼠咳嗽潛伏期、減少咳嗽次數(shù)、抑制小鼠耳腫脹率的作用（P＜0.05）；與原水提組比較，水提醇沉組療效無顯著性差異（P＞0.05）。

表8　水提醇沉組對(duì)濃氨水致小鼠咳嗽的影響（±s，n=10）

表8　水提醇沉組對(duì)濃氨水致小鼠咳嗽的影響（±s，n=10）

注：與模型對(duì)照組比較，*P＜0.05；與原方組比較，▲P＞0.05，下同。

組別　　劑量/（g.kg-1）咳嗽潛伏期/s 3 min內(nèi)咳嗽次數(shù)模型對(duì)照組　　—　16.00±1.94　 50.50±8.22原水提組 　10　84.50±9.43*　14.00±3.37*水提醇沉組　10　87.10±8.44*▲12.50±2.80*▲

表9　水提醇沉組對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響（±s，n= 10）

表9　水提醇沉組對(duì)二甲苯致小鼠耳腫脹的影響（±s，n= 10）

組別　　劑量/（g.kg-1）　　腫脹率/％模型對(duì)照組　　—　168.6±6.3原水提組　10　50.1±10.1*水提醇沉組　10　52.1±2.3*▲

3 討論

巖豇豆（又名石吊蘭）是二巖虎果湯的君藥，而石吊蘭素為巖豇豆的有效成分，研究表明其具有良好的鎮(zhèn)咳、抗炎等作用［12］，與復(fù)方二巖虎果湯的功能主治一致，所以本實(shí)驗(yàn)選擇石吊蘭素作為二巖虎果湯水提醇沉工藝的含有量測(cè)定指標(biāo)。為考察提取是否完全，除石吊蘭素含有量外，還應(yīng)兼顧浸膏得率，鑒于前者比后者能更好地反映藥材的提取情況，故設(shè)計(jì)兩者的權(quán)重系數(shù)為7∶3。

據(jù)報(bào)道，單味石吊蘭藥材在流動(dòng)相為甲醇-1％醋酸（85∶15），檢測(cè)波長(zhǎng)為335 nm時(shí)，石吊蘭素的出峰時(shí)間為10.2 min［13］。本實(shí)驗(yàn)參照藥典標(biāo)準(zhǔn)，以甲醇-水（68∶32）為流動(dòng)相［14］，標(biāo)準(zhǔn)品石吊蘭素的出峰時(shí)間為11.9 min，但供試樣品出峰雜亂，未分離出石吊蘭素的色譜峰?？紤]到研究對(duì)象為復(fù)方，成分復(fù)雜，主峰前面有雜峰，分離度達(dá)不到要求，因此調(diào)整了流動(dòng)相比例。最終，確定以甲醇-水（50∶50）為流動(dòng)相時(shí)，石吊蘭素的出峰時(shí)間為69.9 min，雖然出峰時(shí)間偏長(zhǎng)，但分離效果良好，而且該比例下流動(dòng)相經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)證明，其分離效果和出峰時(shí)間穩(wěn)定，因此予以采用。

由于本方各味藥材含多糖、淀粉量較多，水提浸膏得率較高，會(huì)導(dǎo)致給藥劑量過大，而且這些雜質(zhì)還可能造成制劑不穩(wěn)定，所以后續(xù)進(jìn)行了醇沉除雜工藝研究。結(jié)果顯示，藥液的相對(duì)密度在實(shí)際操作中不易控制，故以藥材量與藥液的體積比代替，方便實(shí)用。

另外，二巖虎果湯的傳統(tǒng)劑型為水煎劑，為確保水提醇沉工藝不影響其療效，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了藥效學(xué)驗(yàn)證。結(jié)果表明，水提醇沉工藝產(chǎn)品與水煎劑比較，止咳、抗炎作用無差異，進(jìn)一步說明該工藝的可行性。

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*通信作者：覃容貴（1970—），女，博士，教授，主要從事中藥資源及藥理研究。Te1：（0851）6908218-709，E-mai1：1346812934@ qq.com

作者簡(jiǎn)介：羅忠圣（1971—），男，副主任藥師，主要從事中藥制藥及新藥研究工作。Te1：13885086747，E-mai1：1052318167 @ qq.com

基金項(xiàng)目：貴州省科學(xué)技術(shù)基金項(xiàng)目（黔科合J字［2012］2328號(hào)）；貴州省中醫(yī)藥管理局中醫(yī)藥、民族醫(yī)藥科學(xué)技術(shù)研究課題（QZYY2011-86）

收稿日期：2014-09-03

doi：10.3969/j.issn.1001-1528.2016.01.047

中圖分類號(hào)：R284.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號(hào)：1001-1528（2016）01-0193-05