熊克宮 陳麗芳 柯坤宇

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AIH患者外周血PD-1表達(dá)與肝臟炎癥活動(dòng)度的相關(guān)性分析

熊克宮 陳麗芳 柯坤宇

【摘要】目的 研究細(xì)胞表面程序性死亡受體1（PD-1）與肝臟病變程度的相關(guān)性。方法 收集43例AIH患者，并選擇18例健康體檢者為對(duì)照組。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞中PD-1的表達(dá)。結(jié)果 AIH組外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞表達(dá)PD-1的細(xì)胞百分比高于對(duì)照組（P＜0.05）；AIH活動(dòng)期組外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞表達(dá)PD-1的細(xì)胞百分比高于緩解期組和對(duì)照組（P＜0.05）。外周血CD4+、CD8+T細(xì)胞PD-1的表達(dá)在AIH患者病理重度炎癥組、輕度炎癥組及緩解期逐漸下降（P＜0.05）。 結(jié)論 PD-1可作為評(píng)判肝臟炎癥活動(dòng)度的參考指標(biāo)之一。

【關(guān)鍵詞】自身免疫性肝炎；PD-1；T細(xì)胞；肝臟炎癥活動(dòng)度

自身免疫性肝炎（autoimmune hepatitis，AIH）是一種病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全明確的慢性進(jìn)行性肝臟炎癥性疾病［1］。程序性死亡受體1（programmed death-l，PD-1）是CD28家族中新發(fā)現(xiàn)的傳導(dǎo)抑制信號(hào)的共刺激分子，主要功能是調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化及分化［2］。本研究以AIH患者為研究對(duì)象，探討AIH患者外周血CD4+﹑CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)情況及其與肝臟炎癥活動(dòng)度的相關(guān)性，為AIH的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

43例AIH患者均為2013年1月～2015年8月福州市傳染病醫(yī)院收治并臨床確診的病例，31例為活動(dòng)期（治療前）患者，12例為免疫抑制劑治療后緩解期患者。入選病例均經(jīng)活體肝臟組織學(xué)檢查并臨床確診的AIH患者，肝組織切片均由副主任醫(yī)師以上病理專家閱片。AIH診斷標(biāo)準(zhǔn)：參照1999國(guó)際AIH工作組制定的診斷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［3］，激素治療前評(píng)分≥15分明確診斷AIH，10 ～15分者為疑似診斷AIH。緩解是指癥狀消失，血清轉(zhuǎn)氨酶﹑膽紅素﹑IgG正常，肝組織正?；驘o活動(dòng)性肝硬化。同時(shí)選取18例年齡和性別配對(duì)的健康體檢者為對(duì)照組。排除病毒性﹑藥物性﹑酒精性和遺傳代謝性肝病等。

1.2 主要試劑

鼠抗人CD4-FITC﹑鼠抗人CD8-FITC﹑鼠抗人CD3-perCP5.5﹑鼠抗人PD-1-APC﹑同型對(duì)照抗體IgG1-APC﹑紅細(xì)胞裂解液（均購自美國(guó)BD公司）及1%的多聚甲醛（購自北京化學(xué)試劑公司）。

1.3 外周血T細(xì)胞PD-1表達(dá)的檢測(cè)

每例采取外周靜脈血5 ml，EDTA抗凝，6 h內(nèi)送檢。采集外周靜脈血2 ml，肝素抗凝，取100 μl全血，分別加入小鼠抗人PD-l-PE CD3-FITC和CD4-APC﹑CD8-APC各10 ml，避光孵育30 min；加入2 ml紅細(xì)胞裂解液避光靜置10 min，加緩沖液洗滌3次后，取2%多聚甲醛300 L重懸細(xì)胞，立刻上機(jī)（BD FACS CantoTMⅡ型流式細(xì)胞儀）檢測(cè)，用Cell Quest軟件獲取標(biāo)本中的細(xì)胞，以FSC和SSC設(shè)門讀取細(xì)胞，以CD3及CD4雙陽性圈定為CD4+T細(xì)胞，以 CD3及CD8雙陽性圈定為CD8+T淋巴細(xì)胞，再分別測(cè)定外周血CD4+﹑CD8+T細(xì)胞PD-1陽性比例。

1.4 肝組織標(biāo)本采集和處理

患者均于入院病情穩(wěn)定后在彩超引導(dǎo)下，采用巴德BARD一次性全自動(dòng)活檢槍進(jìn)行檢驗(yàn)（購自美國(guó)巴德公司，型號(hào)MN1620）。肝組織標(biāo)本長(zhǎng)度2.0 cm左右，匯管區(qū)數(shù)≥8個(gè)，4%甲醛固定，常規(guī)脫水﹑石蠟包埋﹑切片﹑HE染色。光學(xué)顯微鏡多視野觀察。肝組織均由兩名有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生獨(dú)立閱片，進(jìn)行組織學(xué)診斷，按照2000年《病毒性肝炎防治方案》中的組織病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)標(biāo)本組織中肝細(xì)胞的變性﹑壞死和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度，間質(zhì)增生﹑細(xì)胞再生及纖維分隔的病理改變，將肝組織炎癥活動(dòng)度（G）分為G0～G4級(jí)。并按照慢性肝炎病理炎癥程度分為三組： G1～G2為輕度炎癥組﹑G3～G4為重度炎癥組﹑G0為治療緩解組。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）（±s）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對(duì)象的一般情況

43例AIH患者，其中31例為活動(dòng)期患者，男性3例﹑女性29例，平均年齡（47.2±12.4）歲，存在不同程度的肝功能異常﹑IgG升高﹑自身抗體陽性；12例為免疫抑制劑治療后緩解期患者，男1例﹑女11例，平均年齡（48.6±11.8）歲，血清轉(zhuǎn)氨酶﹑膽紅素﹑IgG正常，但自身抗體仍為陽性，且與活動(dòng)期比較，血清轉(zhuǎn)氨酶﹑膽紅素﹑GGT﹑ALP﹑IgG均下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但自身抗體譜﹑自身抗體的滴度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（詳見表l）。

表1　AIH患者一般情況

2.2 AIH患者肝組織病理特征

31例活動(dòng)期AIH患者以界面性肝炎和匯管區(qū)淋巴細(xì)胞﹑漿細(xì)胞及單核細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)為主，且大部分肝小葉內(nèi)可見點(diǎn)狀或碎屑樣壞死，多數(shù)不累計(jì)膽管。界面性肝炎29例（93.5%），淋巴﹑漿細(xì)胞浸潤(rùn)27例（87.1%），膽管破壞性炎癥2例（6.45%）。12例緩解期患者無界面性炎，匯管區(qū)均無明顯壞死及淋巴細(xì)胞﹑漿細(xì)胞浸潤(rùn)。

2.3 AIH組及對(duì)照組外周血CD4+﹑CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)

AIH組的CD4+﹑CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)率分別為（7.36± 4.45）%，（6.71±3.84）%均高于對(duì)照組（4.17±2.32）%，（3.47±2.18）%（P＜0.05）?；罨诮MCD4+T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)（8.73±6.81）%高于緩解期組（5.42±2.14）%及對(duì)照組（4.17±2.32）%（P＜0.05），且緩解期組高于對(duì)照組（P＜0.05）?；罨诮MCD8+T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)（7.44±2.75）%高于緩解期組（4.82±2.04）%及對(duì)照組（3.47±2.18）%（P＜0.05），且緩解期組高于對(duì)照組（P＜0.05）。并且AIH患者病理重度炎癥組﹑輕度炎癥組及緩解期外周血CD4+﹑CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)逐漸下降（P＜0.05）。

2.4 AIH患者外周血CD4+﹑CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)與肝組織炎癥活動(dòng)度相關(guān)性分析

AIH患者外周血CD4+﹑CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)與肝組織炎癥活動(dòng)度分級(jí)正相關(guān)（r分別為0.852﹑0.882，P＜0.05）。

3 討論

國(guó)外的研究者用免疫組化和RT-PCR對(duì)未接受治療的AIH和PBC患者肝中PD-1的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)在AIH組中PD-1的表達(dá)高于健康組及PBC。另外，在PD-Ll缺陷AIH小鼠中還觀察到肝內(nèi)聚積的凋亡功能受損的CD8+T細(xì)胞導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷加快，說明PD-1/PD-L1介導(dǎo)的免疫異常參與了AIH發(fā)生發(fā)展。Miyake Y等研究發(fā)現(xiàn)血清PD-1抗體對(duì)于1型AIH是一個(gè)有用的診斷指標(biāo)，且血清PD-1抗體水平能反映1型AIH臨床特征。但AIH患者外周血T細(xì)胞PD-1的表達(dá)情況及與肝臟組織炎癥病變程度之間的關(guān)系研究甚少。

本研究觀察PD-1在AIH患者外周血CD4+﹑CD8+T細(xì)胞的表達(dá)，結(jié)果顯示在AIH患者外周血CD4+﹑CD8+T細(xì)胞的表達(dá)高于對(duì)照組，AIH患者病理重度﹑輕度炎癥組及緩解期肝組織PD-1逐漸下降。這可能說明AIH患者外周血CD4+﹑CD8+T細(xì)胞雖代償性提高了PD-1的表達(dá)，但是表達(dá)PD-1的CD4+﹑ CD8+T細(xì)胞的增殖能力反而下降，不足以控制疾病的發(fā)生，導(dǎo)致機(jī)體免疫耐受失衡，以致其對(duì)免疫反應(yīng)的抑制性調(diào)控作用不能顯現(xiàn)，繼而發(fā)生病變。PD-1在AIH活動(dòng)期組外周血CD4+﹑CD8+T細(xì)胞的表達(dá)高于免疫抑制劑治療后緩解期組。說明免疫抑制劑治療藥物等可能通過提高表達(dá)PD-1的CD4+﹑CD8+T細(xì)胞的增殖能力，下調(diào)PD-1的表達(dá)而發(fā)揮作用。此外，AIH患者外周血CD4+﹑CD8+T細(xì)胞PD-1的表達(dá)且與肝組織炎癥活動(dòng)度呈正相關(guān)。在機(jī)體激活特異性效應(yīng)T淋巴細(xì)胞的同時(shí)，逐漸表達(dá)更多的PD-l，考慮可能為機(jī)體應(yīng)對(duì)自身免疫反應(yīng)的代償所表現(xiàn)的反應(yīng)。當(dāng)這種平衡關(guān)系出現(xiàn)異常時(shí)，可以因免疫反應(yīng)劇烈而引起免疫損傷。PD-1的升高與肝組織炎癥活動(dòng)度相關(guān)，炎癥活動(dòng)度越明顯，機(jī)體通過產(chǎn)生更多的PD-1，抑制反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞，從而能夠減輕自身免疫損傷。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)AIH患者外周血CD4+﹑CD8+T細(xì)胞表面PD-1表達(dá)率增加，且與肝組織炎癥活動(dòng)度呈正相關(guān)，提示PD-1在AIH的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且外周血PD-1可作為評(píng)判肝臟炎癥活動(dòng)度的參考指標(biāo)。

參考文獻(xiàn)

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Expression of PD-1 on Peripheral Blood T Cells and the Correlation With Liver Inflammatory Activity in Patients With Autoimmune Hepatitis

XIONG Kegong CHEN Lifang KE Kunyu Department of Liver Deseases，The Infection Disease Hospital of Fuzhou City，F(xiàn)uzhou 350012，China

【Abstract】

Objective To investigate the correlation of programmed cell death receptor 1（PD-1）with liver inflammatory activity.Methods The percentages of PD-1 on CD4+，CD8+T lymphocytes in peripheral blood of patients with AIH（n=43）and healthy controls（n=18）was determined by flow cytometry.Results We found that the percentages of PD-1 on CD4+，CD8+T lymphocytes in peripheral blood of patients with AIH were higher than the healthy controls.The percentages of PD-1 on CD4+，CD8+T lymphocytes peripheral blood in activity stage，remission stage and the control groupwere gradually declined.The expression of PD-1 in severe inflammation，mild inflammation and remission stage were gradually decline，and PD-1 expression was a positively correlated with inflammation grading of hepatitis tissues.Conclusion PD-1 can be used as a reference index evaluation of liver inflammatory activity.

【Key words】Autoimmune hepatitis，Programmed cell death receptor 1，T cells，Liver inflammatory activity

基金項(xiàng)目：福州市衛(wèi)生系統(tǒng)科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014-S-w21）

doi：10.3969/j.issn.1674-9316.2016.02.025

【中圖分類號(hào)】R575.1

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1674-9316（2016）02-0034-03

作者單位：350012 福州市傳染病醫(yī)院肝病科 通訊作者：柯坤宇，E-mail：465347646@qq.com