， ， (南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 南京 210037)

·綜述·

山茱萸科植物組織培養(yǎng)研究進(jìn)展

楊尋，張洋，洑香香
(南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心， 江蘇 南京 210037)

山茱萸科植物是一類(lèi)集觀賞、食用、藥用和材用于一體的多用途植物。掌握該科植物的組織培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)其種質(zhì)資源的開(kāi)發(fā)、利用與保存具有重要意義。本文從外植體、基本培養(yǎng)基、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和組培苗移栽等方面綜述了山茱萸科植物組織培養(yǎng)的研究進(jìn)展，并提出了在實(shí)際應(yīng)用中所存在的相應(yīng)問(wèn)題及解決方法。

山茱萸科； 組織培養(yǎng)； 外植體； 基本培養(yǎng)基；

山茱萸科(Cornaceae)為落葉喬木或灌木，稀常綠或草本，隸屬于被子植物門(mén)雙子葉植物綱薔薇亞綱(Rosidae)山茱萸目(Cornales)。全世界共有15屬，約119種，分布于全球各大洲的熱帶至溫帶以及北半球環(huán)極地區(qū)，以東亞最多。我國(guó)有9屬，約60種，分別為梾木屬(Svida)、山茱萸屬(Cornus)、四照花屬(Dendrobenthamia)、青莢葉屬(Helwingia)、單室茱萸屬(Mastixia)、鞘柄木屬(Toricellia)、桃葉珊瑚屬(Aucuba)、草茱萸屬(Chamaepericlymenum)以及燈臺(tái)樹(shù)屬(Bothroaryum)。除新疆外，其余各省區(qū)均有分布[1-2]。山茱萸科植物中的喬木，樹(shù)形高大，樹(shù)干挺拔，冠幅寬闊，枝葉茂盛，分枝較高，生長(zhǎng)迅速，壽命長(zhǎng)，其耐寒耐旱能力也較強(qiáng)，且對(duì)土壤和光照的要求較低，很適于作為行道樹(shù)，如梾木(S.macrophylla)、光皮梾木(S.wilsoniana)、燈臺(tái)樹(shù)(B.controversum)、香港四照花(D.hongkongensis)等[3-4]。山茱萸(C.officinalis)是我國(guó)傳統(tǒng)的珍貴中藥材，味酸、微溫，臨床用其干燥果肉，具有補(bǔ)益肝腎、收斂固脫的功效[5]。多數(shù)梾木類(lèi)的種子含油率高，是重要的燃料油資源，如光皮梾木與毛梾(C.walteri)是2種公認(rèn)的油料樹(shù)種，果實(shí)含油率均高于30%[6-7]，其中光皮梾木有望發(fā)展成為中國(guó)的“綠色生物燃料”[8-9]。偃伏梾木(C.stolonifera)、沙梾(C.bretchneideri)、小梾木(C.paucinervis)和紅瑞木(C.alba)等灌木類(lèi)還可作為優(yōu)良材料應(yīng)用于編織業(yè)[10]；四照花類(lèi)植物用于園林觀景可孤植在亭邊、榭旁、堂前、山坡或叢植于路邊、草坪、林緣池畔等處，可春賞亮葉，夏觀玉花，秋看紅果和紅葉；其果可鮮食、釀酒和制醋，含有高脂肪和高鈣，是一種有開(kāi)發(fā)利用價(jià)值的野生水果[11-12]；鮮葉敷傷口可消腫，根及種子煎水服用可補(bǔ)血；其木材堅(jiān)硬，紋理通直而細(xì)膩，易于加工，是良好的用材樹(shù)種[13]。

山茱萸科植物多分布于一些深山老林等不易被人們發(fā)現(xiàn)的區(qū)域，嚴(yán)重影響了該科植物的開(kāi)發(fā)利用和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。其傳統(tǒng)的繁殖方式有種子繁殖和扦插、嫁接等無(wú)性繁殖方式。四照花類(lèi)種子具有深休眠特性，自然條件下2年才能萌發(fā)[14-15]。梾木類(lèi)一些優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的栽培品種都以雜合形式存在，種子繁殖變異率大；扦插繁殖存活率低；嫁接繁殖則需要繁重的勞力[16]?；谀壳坝行?shù)種的開(kāi)發(fā)利用，已培育出許多優(yōu)良品種或無(wú)性系，如四照花屬的栽培品種已達(dá)100多個(gè)，如東京四照花(D.tonkinensis)、秀麗四照花(D.elegans)、香港四照花(D.hongkon-gensis)和大花四照花(C.florida)等，其繁殖主要通過(guò)無(wú)性繁殖。其中組織培養(yǎng)技術(shù)不僅能有效地克服其傳統(tǒng)育苗缺陷，而且繁育出的無(wú)性系苗木可保持親本的優(yōu)良性狀。因此利用植物組織培養(yǎng)技術(shù)對(duì)山茱萸科植物的快速繁殖，保護(hù)其種質(zhì)資源具有重要的意義。本文綜述了近幾十年來(lái)山茱萸科植物組織培養(yǎng)技術(shù)相關(guān)的研究，對(duì)外植體、基本培養(yǎng)基和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等方面及培養(yǎng)過(guò)程中出現(xiàn)的主要問(wèn)題和相應(yīng)的解決方案進(jìn)行了探討。

1 影響山茱萸科植物組織培養(yǎng)的主要因素

將植物的離體器官、組織和細(xì)胞等放在培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，使其逐漸增殖、分化，并發(fā)育出完整的小植株是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過(guò)程，其形態(tài)發(fā)生的過(guò)程必然受到許多因素和條件的影響制約。其中外植體、基本培養(yǎng)基和植物激素起到了關(guān)鍵性的作用。

1.1 外植體

1.1.1 外植體選擇

在植物組織培養(yǎng)中，外植體的選擇是最終培養(yǎng)能否成功的關(guān)鍵因素之一。外植體供體植株的發(fā)育階段、年齡、生長(zhǎng)環(huán)境及外植體取材部位等的不同均可導(dǎo)致外植體生理狀態(tài)的差異，從而影響組織培養(yǎng)的形態(tài)發(fā)生[17]。

山茱萸科大部分樹(shù)種都以莖尖[18-19]、帶芽莖段[20-25]等為外植體，通過(guò)器官直接發(fā)生途徑獲得再生植株，通過(guò)這種方式獲得的植株遺傳變異小，能保持親本的特性。其中，峨眉四照花(C.capitanavar.emeiensis)的幼嫩莖尖[18-19]、紅瑞木的莖段[20-21]就容易誘導(dǎo)不定芽。

愈傷組織的誘導(dǎo)常選用葉片、莖尖、莖段、花托、花柄、頂芽等作為外植體。峨眉四照花[18-19]、燈臺(tái)樹(shù)[22]、山茱萸[23,26]、角葉鞘柄木(T.angulata.var.intermedia)[27]的葉片均已成功誘導(dǎo)愈傷組織。路承香等[18]曾用峨眉四照花莖尖誘導(dǎo)產(chǎn)生大量愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)80.0%，但仍未進(jìn)行下一步的分化研究。李燾[23]對(duì)山茱萸的花托、花柄進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率分別為100%、96.2%，將誘導(dǎo)出的愈傷組織進(jìn)行增殖培養(yǎng)，大量增殖后部分可分化出不定芽，分化率可達(dá)54.8%。

體胚發(fā)生最適合用未成熟的外植體誘導(dǎo)。Trigiano 等[28]利用大花四照花的未成熟合子胚，在MS[29]或Schenk and Hildebrandt(SH)培養(yǎng)基上，以3(或5)mg/L 2,4-D+1.0 mg/L KT的激素配比組合成功誘導(dǎo)出胚狀組織，但最后并未成苗。

1.1.2 外植體消毒

對(duì)外植體材料進(jìn)行合理有效的消毒處理，是植物組織培養(yǎng)工作的重要環(huán)節(jié)。外植體是有生命的植物材料，因此要求在消毒過(guò)程中既能有效殺滅微生物，又不能損傷植物組織。外植體消毒主要采用化學(xué)藥劑進(jìn)行表面消毒，其關(guān)鍵在于滅菌藥劑的選擇和消毒時(shí)間的把握。不同的外植體類(lèi)型和不同的取材時(shí)期導(dǎo)致滅菌藥劑的選擇和消毒時(shí)間的確定存在一定的差異。李卉[19]對(duì)野外采集的峨眉四照花外植體用飽和漂白精溶液+吐溫-80法處理10 min，污染率較低，且植株褐化現(xiàn)象較輕。在山茱萸科組織培養(yǎng)試驗(yàn)的研究過(guò)程中，常用的滅菌組合為70%～75%酒精和0.1%升汞，消毒時(shí)間則因材料不同各異。其中，張明麗[20]在對(duì)金葉紅瑞木外植體進(jìn)行消毒時(shí)發(fā)現(xiàn)，用70%酒精20 s+0.1%升汞8 min組合污染率與褐化率降為最低。馮麗娜[22]在燈臺(tái)樹(shù)組培快繁的試驗(yàn)中比較了84消毒液(有效氯含量為4.8%～6.2%)及酒精和升汞組合的滅菌效果，結(jié)果顯示20% 84消毒液滅菌15 min外植體成活率最高，為96.7%。

1.2 基本培養(yǎng)基

山茱萸科植物組織培養(yǎng)常用的基本培養(yǎng)基有：woody plant medium(WPM)[30]、MS、1/2 MS(MS中的大量元素減半)、B5[31]和DKW[32]等，其中最常用的是WPM和MS。

WPM、MS、1/2 MS、DKW、M(MS培養(yǎng)基添加CaCl21 200 mg/L)、1/2 M培養(yǎng)基等可用于不定芽的直接誘導(dǎo)。狹葉四照花于WPM培養(yǎng)基上成功完成了不定芽的誘導(dǎo)、增殖與生根[33]；Kaveriappa 等[34]用WPM培養(yǎng)基對(duì)大花四照花幼苗的莖段和頂端分生組織進(jìn)行的組織培養(yǎng)首次獲得了成功，誘導(dǎo)出叢生芽并獲得了生根植株；MS培養(yǎng)基則應(yīng)用于峨眉四照花[18-19]、紅瑞木[20-21]、山茱萸[23]等植物的不定芽誘導(dǎo)。Li等[25]發(fā)現(xiàn)用DKW培養(yǎng)基誘導(dǎo)光皮梾木的帶芽莖段產(chǎn)生不定芽的效果最好，褐化程度最低；WPM、M和1/2 M培養(yǎng)基分別用于燈臺(tái)樹(shù)不定芽的誘導(dǎo)、增殖與生根[22]。

MS和B5培養(yǎng)基等可用于愈傷組織的誘導(dǎo)。峨眉四照花莖尖在MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)產(chǎn)生了大量愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)80.0%[18]；同樣燈臺(tái)樹(shù)葉片在MS培養(yǎng)基上也誘導(dǎo)出了愈傷組織，誘導(dǎo)率高達(dá)100%[22]；B5用于誘導(dǎo)角葉鞘柄木的愈傷組織[27]。

MS與SH培養(yǎng)基等可用于胚狀組織的誘導(dǎo)。大花四照花通過(guò)體胚發(fā)生途徑在MS和SH培養(yǎng)基上添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑2,4-D以及2,4-D與KT的組合，成功誘導(dǎo)了胚狀組織[28]。

1.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)

1.3.1 對(duì)不定芽誘導(dǎo)與增殖途徑的影響

外植體通過(guò)直接器官發(fā)生途徑產(chǎn)生不定芽是相對(duì)快捷的方式。在植物組織培養(yǎng)的過(guò)程中，外源激素對(duì)外植體材料的形態(tài)建成與調(diào)控起著十分重要的作用，其不同種類(lèi)的選擇和濃度的配比又影響著植株的再生頻率和再生方式[35-37]。山茱萸科植物較易誘導(dǎo)不定芽，各種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的綜合作用尤其是激素濃度的配比對(duì)不定芽的誘導(dǎo)和增殖有很大的影響。

植物細(xì)胞分裂素6-卞氨基嘌呤(6-BA)、6-糠氨基嘌呤(KT)、玉米素(ZT)與植物細(xì)胞生長(zhǎng)素3-吲哚丁酸(IBA)、吲哚-3-乙酸(IAA)或α-萘乙酸(NAA)等的特定組合及濃度配比可用于該科植物的不定芽誘導(dǎo)。以MS為基本培養(yǎng)基，較高濃度的激素水平可用于難以誘導(dǎo)出芽的樹(shù)種；反之，較低的濃度則可用于易誘導(dǎo)出芽的樹(shù)種，如，用2.0 mg/L 6-BA和0.5 mg/L IBA以及2.0 mg/L 6-BA和1.0 mg/L IBA可誘導(dǎo)峨眉四照花的莖尖產(chǎn)生不定芽[18]；0.5 mg/L 6-BA和0.1 mg/L IBA可誘導(dǎo)紅瑞木莖段的不定芽[20]。以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L IBA可用于偃伏梾木葉片的誘導(dǎo)，再生頻率高達(dá)100%，不定芽在添加0.5 mg/L 6-BA+0.25 mg/L IBA后能有效增殖[38]；0.5～1.0 mg/L 6-BA+0.05～0.10 mg/L IAA可誘導(dǎo)山茱萸的幼胚產(chǎn)生不定芽，其中平均每個(gè)幼胚可分化出6.7個(gè)芽，然后將6-BA與IAA的濃度降低1倍，再添加0.5～1.0 mg/L GA3可進(jìn)行增殖培養(yǎng)，增殖系數(shù)為2.5[39]；1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IBA可誘導(dǎo)山茱萸莖段萌發(fā)腋芽[23]。以WPM為基本培養(yǎng)基，1.0 mg/L 6-BA可誘導(dǎo)大花四照花叢生芽的增殖[34]；狹葉四照花誘導(dǎo)與增殖的植物激素分別為1.0 mg/L 6-BA+0.05 mg/L KT+0.1 mg/L NAA和1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，萌發(fā)率達(dá)到86.29%，增殖系數(shù)為4.07[33]；0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+1.0 mg/L GA3有利于燈臺(tái)樹(shù)新梢的啟動(dòng)[22]；2.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L ZT+0.1 mg/L NAA可使山茱萸的莖段側(cè)芽形成叢苗[24]。以M為培養(yǎng)基，0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L IBA可用于紅瑞木不定芽的增殖培養(yǎng)，增殖率為73.5%，增殖系數(shù)為2.32[20]；對(duì)于燈臺(tái)樹(shù)，適宜的增殖激素組合為1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+2.0 mg/L GA3，平均增殖系數(shù)為4.4[22]；以DKW為培養(yǎng)基，0.5(或1.0) mg/L ZT+0.1 mg/L IBA可用于光皮梾木不定芽的誘導(dǎo)，平均出芽數(shù)量為2.12，而0.5 mg/L ZT+0.1 mg/L IBA則可使其不定芽增殖系數(shù)達(dá)最高，為4.22[25]。

1.3.2 對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)與分化途徑的影響

山茱萸科植物外植體還可通過(guò)器官間接發(fā)生的途徑產(chǎn)生再生植株，即先經(jīng)過(guò)脫分化形成愈傷組織，再進(jìn)一步分化形成不定芽。

6-BA和IBA、NAA、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)等常用于該科愈傷組織的誘導(dǎo)與分化。其中NAA和2,4-D對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)具有十分重要的作用。以MS為基本培養(yǎng)基，2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L NAA可誘導(dǎo)峨眉四照花的莖尖產(chǎn)生大量愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)80.0%[18]；0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA可使燈臺(tái)樹(shù)的葉片出愈率達(dá)100%，其愈傷組織質(zhì)地松軟，米白色至淺綠色，生長(zhǎng)良好[22]。以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，李燾[23]經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，有利于山茱萸葉片愈傷組織誘導(dǎo)的激素組合為1.0 mg/L 6-BA+0.5～1.0 mg/L IBA，2,4-D則適于花柄、花托愈傷組織的形成，例如1.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D可誘導(dǎo)花柄、花托產(chǎn)生愈傷組織，其中花托的出愈率達(dá)100%；裴莉昕等[26]通過(guò)試驗(yàn)證明，1.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA是誘導(dǎo)山茱萸葉片產(chǎn)生愈傷組織的最佳組合；陳惠等[40]從試驗(yàn)中得出，0.5～1.0 mg/L激動(dòng)素(KT)+0.05～0.50 mg/L NAA對(duì)山茱萸葉片、頂芽、幼果、果柄等產(chǎn)生愈傷組織的誘導(dǎo)效果十分顯著，并指出NAA濃度越高，愈傷組織產(chǎn)生量就越大。以B5為基本培養(yǎng)基，角葉鞘柄木在激素組合0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L 2,4-D中產(chǎn)生愈傷組織且生長(zhǎng)良好[27]。

1.3.3 對(duì)體胚發(fā)生途徑的影響

從近幾十年的研究結(jié)果來(lái)看，對(duì)山茱萸科植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究較少。2,4-D和KT等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可用于體胚發(fā)生。Trigiano等[28]利用大花四照花的未成熟合子胚，以MS或SH為培養(yǎng)基，3(或5) mg/L 2,4-D+1.0 mg/L KT完成了對(duì)胚狀組織的誘導(dǎo)，但最后并未成苗。

1.3.4 對(duì)壯苗和生根的影響

影響植物離體培養(yǎng)過(guò)程中壯苗和生根的因素有很多，包括外植體自身的生理生化狀態(tài)，也有外部的多種因素，如基本培養(yǎng)基、植物激素、培養(yǎng)途徑、光照、pH值和溫度等的影響。

芽苗的生根與它的健壯程度有關(guān)，即生根前的壯苗培養(yǎng)很有必要[41]。山茱萸科植物壯苗和生根培養(yǎng)所選用的植物激素有IBA、NAA、鉀鹽吲哚丁酸(KIBA)等。以1/2 M為基本培養(yǎng)基，0.5 mg/L IBA可使紅瑞木生根率達(dá)91.7%，移栽成活率達(dá)78.9%[20]；3.0 mg/L IBA可誘導(dǎo)燈臺(tái)樹(shù)生根，暗培養(yǎng)10 d，生根率為60.0%[22]。以1/2 MS為基本培養(yǎng)基，0.5 mg/L IBA可誘導(dǎo)偃伏梾木生根[38]；1.0 mg/L IBA+0.1 mg/L 6-BA可使山茱萸生根率達(dá)60.0%以上[24]。以WPM為基本培養(yǎng)基，1.0 mg/L IBA 可誘導(dǎo)大花四照花生根[34,42]；1.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L ZT+0.5 mg/L GA3+0.1 mg/L NAA有利于山茱萸的叢苗進(jìn)行壯苗培養(yǎng)[24]；以DKW為培養(yǎng)基，1.0 mg/L KIBA 可誘導(dǎo)光皮梾木生根，生根率高達(dá)93.3%，平均根長(zhǎng)有2.8 cm[25]。

1.4 煉苗與移栽

組培苗是在恒溫、保濕、營(yíng)養(yǎng)豐富、光照適宜和無(wú)病蟲(chóng)害侵染的優(yōu)良環(huán)境中生長(zhǎng)的，其組織發(fā)育程度不佳，抗不良環(huán)境能力差。移栽時(shí)，由于環(huán)境條件變化，常會(huì)因組織失水和病菌感染而引起組培苗死亡。因此，移栽時(shí)要重點(diǎn)防失水、防感染。移栽前3～7 d，打開(kāi)瓶蓋煉苗，煉苗后用自來(lái)水洗掉根部培養(yǎng)基，以防病菌感染。

已報(bào)道的山茱萸科植物組培苗移栽成活率為70%～100%。燈臺(tái)樹(shù)的煉苗時(shí)間為3 d，移栽于消毒的混合基質(zhì)中，用水澆透，置于20～25 ℃的溫室內(nèi)，濕度保持在90%以上，試驗(yàn)得出以蛭石∶珍珠巖=1∶1(體積比)為移栽基質(zhì)成活率高[22]。狹葉四照花在煉苗7 d移栽至草炭土∶蛭石(1∶1)的基質(zhì)中培養(yǎng)成活率高[33]。

2 山茱萸科植物組織培養(yǎng)中存在的問(wèn)題

2.1 褐化問(wèn)題

山茱萸科中的部分植物酚類(lèi)物質(zhì)含量較高，當(dāng)細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化與破壞時(shí)，這些物質(zhì)相互接觸之后發(fā)生一系列反應(yīng)，并形成有毒害的褐色物質(zhì)，一般來(lái)講，組織的褐化是一系列酶的作用所致，有多酚氧化酶、過(guò)氧化酶以及L-苯丙氨酸解氨酶，即酶促褐變[43-44]。當(dāng)外植體褐化后，如果不加以控制，常會(huì)造成外植體死亡。褐化程度隨植物的基因型、外植體大小、取材時(shí)間、取材部位、損傷程度、培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基配方以及抗褐化劑添加等因素而不同。

在培養(yǎng)基中加入Vc可有效地防止組織褐化[45]。多胺、蛋白水解產(chǎn)物等物質(zhì)也可作為抑制劑防止褐變的發(fā)生[46]。選擇合適的滅菌藥劑和消毒方法，適當(dāng)降低培養(yǎng)基的pH值，適當(dāng)降低培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)鹽的濃度，適當(dāng)?shù)蜏?，降低外植體接種密度，縮短轉(zhuǎn)瓶周期等也可減輕褐化的發(fā)生。有一些研究表明光照也能影響褐化，但對(duì)于不同植物種類(lèi)所表現(xiàn)出的規(guī)律不同，甚至相反[47]。光能促進(jìn)多種植物組織培養(yǎng)中酚的氧化，在低光照或置于黑暗中培養(yǎng)一段時(shí)間能減輕褐變。同時(shí)應(yīng)注意，一些因素具有多重影響，如活性炭能防止褐化，但也能吸附培養(yǎng)基中的一些其他有機(jī)物，所以在添加活性炭的培養(yǎng)基中應(yīng)適當(dāng)調(diào)整激素配比使其維持在適宜的水平。有研究表明，隨著氣候的變化，氣溫的升高，四照花莖尖所分化的醌類(lèi)物質(zhì)可能增加，褐變率也隨之增高[18]。Li等[25]在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在對(duì)光皮梾木進(jìn)行組織培養(yǎng)中，未添加任何抗褐化劑的組培苗褐化率為100%，添加300 mg/L的活性炭后褐化率降到61.7%，而300 mg/L的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)則可使褐化率降到18.3%。

2.2 污染問(wèn)題

污染問(wèn)題是山茱萸科植物組織培養(yǎng)中經(jīng)常遇到的難題，污染物常出現(xiàn)在外植體表面、附近的培養(yǎng)基及其他位置，表現(xiàn)為渾濁、霉變、粘液狀等形狀，污染物的顏色有黃色、乳白、黑色、紅色等。造成污染的原因較多，如外植體帶菌、工作環(huán)境及儀器、培養(yǎng)基及器皿消毒不徹底、操作不規(guī)范等。造成污染的病源主要可分為細(xì)菌和真菌兩大類(lèi)[48-49]。

控制污染可從以下兩個(gè)方面入手：一方面，控制外植體材料自身帶菌。選擇最佳的取材時(shí)間以及生長(zhǎng)良好的外植體，然后經(jīng)過(guò)一系列的消毒處理可以降低到可接受的程度；然而外植體內(nèi)部帶菌(內(nèi)生菌)是不易清除的，但也可對(duì)外植體進(jìn)行前期預(yù)培養(yǎng)來(lái)加以控制；另一方面，操作污染和環(huán)境污染。理論上，這類(lèi)污染可通過(guò)規(guī)范操作程序，把污染控制在可接受的范圍。

山茱萸科部分植物在培養(yǎng)過(guò)程中較易出現(xiàn)內(nèi)生菌污染的問(wèn)題。內(nèi)生菌分為內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生真菌。內(nèi)生真菌主要屬于子囊菌和半知菌，少數(shù)為擔(dān)子菌和卵菌，它們均生活在健康的植物體內(nèi)不能引起任何病害癥狀[50-51]。在植物組織培養(yǎng)中，由于外植體材料內(nèi)部的內(nèi)生細(xì)菌不能被一般的表面消毒方法所清除，隨著材料一并帶入組織培養(yǎng)過(guò)程，隨培養(yǎng)過(guò)程的變化引起程度不一的污染，稱為內(nèi)生細(xì)菌污染[52]。一些研究認(rèn)為，植物組織培養(yǎng)中的細(xì)菌污染是休眠細(xì)菌芽孢萌發(fā)的結(jié)果，可以通過(guò)在培養(yǎng)基中添加抗菌素、降低pH值或者莖尖培養(yǎng)等措施防治和減少內(nèi)生菌污染[53]。

2.3 玻璃化現(xiàn)象

在繼代培養(yǎng)和快速增殖中，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)一種組培苗變成腫脹、半透明、易折斷的畸形苗現(xiàn)象，即是玻璃化現(xiàn)象。玻璃化苗的分化能力較低，難以增殖生根成苗，成苗之后也會(huì)因生理功能異常而難以移栽成活。一般認(rèn)為培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件不平衡、不適宜是發(fā)生玻璃化的主要原因。

目前有一些控制玻璃化的方法，如適量減少分裂素而增加生長(zhǎng)素的量；適當(dāng)增加光照以及適當(dāng)增加無(wú)機(jī)鹽；采用固體培養(yǎng)基時(shí)，適當(dāng)增加瓊脂的量；高溫季節(jié)要有降溫措施以及使用透氣良好的封口材料等方法，都可以有效減輕試管苗的玻璃化現(xiàn)象[54]。從金葉紅瑞木組培快繁的試驗(yàn)中得出，增殖培養(yǎng)過(guò)程中，把培養(yǎng)基中的瓊脂濃度增加到0.8%，蔗糖濃度增加到4%，用通氣性好的塑料薄膜封口，培養(yǎng)基滅菌后放置4，5 d再接苗，把轉(zhuǎn)接的苗放到晝夜溫差9～11 ℃的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，可克服玻璃化現(xiàn)象[20]。

3 展 望

對(duì)山茱萸科植物組織培養(yǎng)的研究多數(shù)仍處于探索階段。大多數(shù)植物的出芽率、增殖系數(shù)、生根率等都較低，離實(shí)際應(yīng)用還有較大的差距，尤其是對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生方面的研究還很空白，難以建立一套完整、高效的組織培養(yǎng)再生體系。山茱萸科植物具有很高的觀賞價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其組織培養(yǎng)方面還有十分廣闊的空間，因此，對(duì)該科的不同屬、不同種的植物都應(yīng)加強(qiáng)研究，找到適合各種的再生體系，提高它們的利用價(jià)值，對(duì)種質(zhì)資源的保護(hù)也具有極大的意義。

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(本欄目責(zé)任編輯：周介雄)

Research Progress of Tissue Culture for Species in Cornaceae

YANGXun，ZHANGYang，F(xiàn)UXiangxiang

2016-04-28

國(guó)家林業(yè)局“948”引進(jìn)項(xiàng)目(編號(hào)：2012-4-60)；江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)。

楊 尋(1992—)，女，四川巴中人；碩士研究生，研究方向：森林培育。

洑香香(1969—)，女，教授；E-mail:xxfu@njfu.edu.cn。

植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.08.050

S 567.1+9

A

1001-4705(2016)08-0050-06