吳　健，朱海霞，趙志荀，顏新敏，趙銀龍，吳　娜，李　健，張志東，張　強(qiáng)，李　影，吳國華*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118；3.西北民族大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730124)

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蛋白質(zhì)互作研究技術(shù)

吳健1,2，朱海霞1，趙志荀1，顏新敏1，趙銀龍3，吳娜1，李健1，張志東1，張強(qiáng)1，李影2*，吳國華1*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，甘肅蘭州 730046；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林長春 130118；3.西北民族大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅蘭州 730124)

摘要：蛋白質(zhì)在生物體的機(jī)制中是必不可少的，擔(dān)任著生物系統(tǒng)內(nèi)啟動以及執(zhí)行的任務(wù)。生物體的每一個(gè)生物過程，從遺傳物質(zhì)復(fù)制到細(xì)胞衰老與死亡，依賴于幾種甚至幾百種蛋白質(zhì)之間的功能協(xié)調(diào)。蛋白質(zhì)的功能，結(jié)構(gòu)的改變會破壞這種平衡，導(dǎo)致疾病的發(fā)生，通常這種情況是由于蛋白間的相互作用引起的。目前有很多蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能是未知的，所以蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)展的也尤為迅速。論文主要綜述了雙向電泳、噬菌體展示技術(shù)、GST pull-down、酵母雙雜交、串聯(lián)親和純化、雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片、Far Western blot、免疫共沉淀9個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)研究技術(shù)，并簡單介紹了近幾年這些技術(shù)在生物學(xué)中的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)相互作用；蛋白互作抑制劑；生物信息學(xué)

人類基因組序列早在本世紀(jì)初成功解碼，生物學(xué)領(lǐng)域的研究正式邁入后基因組時(shí)代，對基因研究的重心也轉(zhuǎn)移到了翻譯后的蛋白質(zhì)上[1]。蛋白質(zhì)作為生命活動的主要承擔(dān)者，在近年來越發(fā)地成為研究的熱點(diǎn)，而在蛋白質(zhì)組學(xué)方面，對蛋白質(zhì)的研究多停留在蛋白質(zhì)間的相互作用(protein-protein interaction，PPI)，蛋白間的互作會產(chǎn)生蛋白質(zhì)復(fù)合體，并且會調(diào)控生物體的生命活動，監(jiān)測蛋白質(zhì)間的互作是了解生物機(jī)制過程的關(guān)鍵。研究表明，許多疾病的誘因都是由于蛋白間的互作引起，如豬繁殖與呼吸綜合征、阿爾茨海默病、亨廷頓舞蹈癥、胰腺癌等等，所以詳細(xì)的了解并有效的阻斷這些蛋白間的互作對于臨床疾病的治療具有重大而深遠(yuǎn)的意義[2]。隨著科學(xué)技術(shù)手段不斷的成熟，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)也得到了高速的發(fā)展，包括雙向電泳、噬菌體展示技術(shù)、GST pull-down、酵母雙雜交、串聯(lián)親和純化、雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)、蛋白質(zhì)芯片、Far Western blot、免疫共沉淀等等。

1雙向電泳技術(shù)

雙向電泳(two-dimensional electrophoresis,2-DE)最早是1975年提出用于分離分析蛋白的技術(shù)，最初并非是為驗(yàn)證蛋白間的互作，但經(jīng)過不斷的發(fā)展及改良，該技術(shù)可以同TAP等技術(shù)及儀器的協(xié)同來進(jìn)行蛋白互作的驗(yàn)證，結(jié)果還可以反映出蛋白翻譯后的修飾狀態(tài)[3]。雙向電泳原理是根據(jù)預(yù)測蛋白的等電點(diǎn)先進(jìn)行等電聚焦電泳，然后再根據(jù)分子質(zhì)量大小進(jìn)行SDS-PAGE電泳進(jìn)行二次分離，經(jīng)染色得到二維分布的蛋白質(zhì)電泳圖，隨后通過圖像分析軟件來對蛋白質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行分析。該技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是可以高分辨，高靈敏的檢測出蛋白之間的性質(zhì)差異。缺點(diǎn)是后期凝膠染色如熒光染料或銀染分別需要昂貴的設(shè)備或成本，所以實(shí)驗(yàn)室大多采用低成本的考馬斯亮藍(lán)染色法。

有時(shí)，電泳的電解液中成分的改變會對試驗(yàn)造成不良影響，且極端酸/堿性蛋白的篩選相對比較困難，減少或消除這方面不利因素就可以大大提高試驗(yàn)成功率，Guo C G等[4]通過對電解液的改變有效的消除了定量時(shí)蛋白質(zhì)沉淀對試驗(yàn)的干擾，并增加了試驗(yàn)的分辨率(多分辨約16.4%的蛋白質(zhì))與靈敏度(較原始方法約提高2.7倍)。此進(jìn)步有益于復(fù)雜蛋白質(zhì)組的研究，尤其是極端酸/堿性蛋白的分析篩選。而雙向電泳與免疫印記法的聯(lián)用也在寄生蟲領(lǐng)域有新進(jìn)展。Cui J等[5]通過雙向電泳及免疫印記成功檢測到與旋毛蟲表面抗原相關(guān)聯(lián)的15種不同蛋白質(zhì)，經(jīng)過篩選，確定其中5個(gè)蛋白質(zhì)與旋毛蟲代謝相關(guān)并且這5個(gè)中的2個(gè)蛋白與細(xì)胞過程關(guān)聯(lián)。這為闡明宿主-寄生蟲相互作用，識別入侵相關(guān)蛋白，診斷早期抗原以及設(shè)計(jì)相關(guān)疫苗打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

2噬菌體展示技術(shù)

該技術(shù)最早是由美國Missouri大學(xué)的Smith G P建立。在過去的幾年里該技術(shù)發(fā)展迅猛，在各種領(lǐng)域大放異彩，如驗(yàn)證蛋白間互作、臨床應(yīng)用[6]、藥物發(fā)現(xiàn)[7]、疫苗開發(fā)[8]、抗體工程分離技術(shù)[9]、表位作圖[10]等等。該技術(shù)原理是將目的基因完整的閱讀框克隆到噬菌體外殼蛋白結(jié)構(gòu)的基因位置，使外源基因與噬菌體外殼蛋白進(jìn)行融合表達(dá)，融合蛋白隨子代噬菌體的重組而顯示在噬菌體表面。顯示的分子或蛋白保持相對獨(dú)立的結(jié)構(gòu)及活性，肽庫與固相上的靶蛋白分子經(jīng)過一定時(shí)間孵育后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體，然后以競爭受體或酸洗脫下與靶分子結(jié)合吸附的噬菌體，洗脫的噬菌體感染宿主細(xì)胞后經(jīng)繁殖擴(kuò)增，進(jìn)行下一輪洗脫，經(jīng)過3輪～5輪的“吸附-洗脫-擴(kuò)增”后，與靶分子特異結(jié)合的噬菌體得到高度富集。所得的噬菌體制劑可用來做進(jìn)一步富集有期望結(jié)合特性的目標(biāo)噬菌體。噬菌體展示技術(shù)系統(tǒng)又可詳細(xì)分為絲狀噬菌體展示系統(tǒng)、λ噬菌體展示系統(tǒng)、T4噬菌體展示系統(tǒng)、T7噬菌體展示系統(tǒng)。此技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是篩選高效，操作簡單，成本低廉。缺點(diǎn)是拷貝數(shù)低，表達(dá)量小，并且噬菌體展示系統(tǒng)依賴于細(xì)胞內(nèi)基因的表達(dá)，所以，一些對細(xì)胞有毒性的分子如生物毒素分子，很難得到有效表達(dá)和展示，限制了分子的多樣性。由于噬菌體展示技術(shù)操作便利、成本低，很多人熱衷于此技術(shù)并進(jìn)行了一定的改良，如Celik E等[11]利用糖陣列設(shè)計(jì)的噬菌體展示成功建立了高通量檢測的多糖 - 蛋白相互作用方法，為大規(guī)模篩選及臨床應(yīng)用鋪平道路。而近幾年報(bào)道也充分說明了噬菌體展示技術(shù)的廣泛應(yīng)用，如Malini E等[12]使用噬菌體展示技術(shù)成功發(fā)現(xiàn)了衰老纖維原細(xì)胞的染色質(zhì)上有高遷移率蛋白A(high-mobility group A，HMGA)的相互作用分子及蛋白，還有相互作用的特定氨基酸區(qū)域E-R-K，闡述了該技術(shù)在驗(yàn)證蛋白間相互作用的高效與敏感。并首次證明了E-R-L區(qū)域肽序列結(jié)合到HMGA，為研究相關(guān)肽與HMGA的相互作用提供依據(jù)，并進(jìn)一步為開發(fā)癌癥抑制劑(抑制HMGA族蛋白)奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

3GST pull-down技術(shù)

此技術(shù)目的用來驗(yàn)證在體外蛋白質(zhì)之間的互作關(guān)系，現(xiàn)已經(jīng)廣泛用于分子生物學(xué)領(lǐng)域[13]。此技術(shù)原理是先構(gòu)建帶有GST標(biāo)簽的融合表達(dá)載體，后經(jīng)過GST親和純化柱將蛋白純化，最后將待測蛋白過柱，若標(biāo)簽蛋白與待測蛋白間有相互作用，待測蛋白就可以結(jié)合到柱上，隨后經(jīng)過洗脫就可以得到相互作用蛋白。該技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是特異性極高。缺點(diǎn)是無法大規(guī)模篩選蛋白間的相互作用，且有些內(nèi)源性蛋白會干擾試驗(yàn)導(dǎo)致假陽性結(jié)果。

GST pull-down技術(shù)優(yōu)勢就在于其可以使靶蛋白保持“天然”的狀態(tài)，活性很高，對于要求活性的互作試驗(yàn)來說意義重大，所以應(yīng)用極為廣泛。Luo L等[14]對GST pull-down技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，進(jìn)一步增加了試驗(yàn)的敏感性，降低背景水平并使蛋白酶裂解步驟更容易。對于有內(nèi)源性蛋白干擾的GST pull-down 技術(shù)來說，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)間的協(xié)作可以使試驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確、更可信。如Wang X等[15]通過GST pull-down協(xié)同酵母雙雜交、免疫共沉淀等技術(shù)證實(shí)了豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PPRSV)的N蛋白與PABP之間的相互作用，確定了PABP的調(diào)節(jié)對于PRRSV復(fù)制過程起重要作用，并且為研發(fā)PPRSV疫苗提供了理論基礎(chǔ)，此外，調(diào)查PRRSV細(xì)胞增殖蛋白會提高我們對分子級病毒感染病理現(xiàn)象的理解。

4酵母雙雜交技術(shù)

酵母雙雜交最早由Field S等[16]在1989通過轉(zhuǎn)錄因子GAL4的研究結(jié)果建立。是在體內(nèi)驗(yàn)證蛋白間相互作用的經(jīng)典方法。原理是酵母內(nèi)有2個(gè)特殊結(jié)構(gòu)域：特異性結(jié)合結(jié)構(gòu)域(binding domin,BD)和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)。這2個(gè)結(jié)構(gòu)域即使分開時(shí)也仍具有功能，互不影響。當(dāng)BD結(jié)合某段基因需要表達(dá)時(shí)就必須識別AD進(jìn)行結(jié)合，這樣才能轉(zhuǎn)錄翻譯構(gòu)成完整的真核表達(dá)系統(tǒng)。所以只要將待測的倆個(gè)蛋白基因分別連接到AD與BD上，若靶蛋白之間有相互作用則AD與BD就可以結(jié)合完成轉(zhuǎn)錄并激活下游報(bào)告基因，根據(jù)報(bào)告基因就可以判斷互作結(jié)果。同時(shí)，報(bào)告基因的選擇建議使用倆種或倆種以上(如ADE2和URA3)，這樣可以使試驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確。酵母雙雜交的優(yōu)勢在于可以建立cDNA文庫，從中大規(guī)模篩選與目標(biāo)蛋白相互作用的多種蛋白，還可以建立基因組蛋白連鎖圖(genome protein linkage map，GPLM)。酵母雙雜交的優(yōu)點(diǎn)是效率高，蛋白間的瞬時(shí)與穩(wěn)定結(jié)合都有良好的敏感性，結(jié)果便于觀察，最重要的是酵母雙雜交是在體內(nèi)進(jìn)行，可以有效的排出體外因素的干擾使結(jié)果更可信。缺點(diǎn)是不能檢測細(xì)胞膜、胞漿以及分泌到細(xì)胞外的蛋白，另外試驗(yàn)周期略長，而且結(jié)果容易出現(xiàn)假陽性，需要進(jìn)行多重篩選以及回轉(zhuǎn)酵母等試驗(yàn)進(jìn)行排除。鑒于酵母雙雜交技術(shù)的高效、敏感，尤其是在酵母體內(nèi)驗(yàn)證互作排出外界干擾的情況下，酵母雙雜交在很多領(lǐng)域大放異彩，如Silva J V等[17]通過對酵母雙雜交技術(shù)改良驗(yàn)證了磷蛋白與磷酸酶1的相互作用，使其在制藥領(lǐng)域發(fā)揮作用。Mahajan S等[18]成功建立了衍生于感染口蹄疫病毒的豬腎細(xì)胞系(LFBK) 的cDNA文庫，并用口蹄疫病毒的2C蛋白做誘餌蛋白，從LFBK的cDNA文庫進(jìn)行酵母雙雜交篩選互作蛋白，并深入的研究了口蹄疫病毒與豬腎細(xì)胞的關(guān)系。最近幾年酵母雙雜交技術(shù)發(fā)展迅速，衍生出了單雜交系統(tǒng)、三雜交系統(tǒng)核外雙雜交系統(tǒng)、反向雙雜交系統(tǒng)、哺乳動物雙雜交系統(tǒng)等[19]相信在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域未來酵母雙雜交技術(shù)可以發(fā)揮更大的作用。

5串聯(lián)親和純化技術(shù)

串聯(lián)親和純化技術(shù)(tandem affinity purification,TAP)最早是由Rigaut G等[20]提出的接近原始自然狀態(tài)下測定蛋白互作的方法。最早用于酵母。原理是通過特殊設(shè)計(jì)的蛋白標(biāo)簽，將其與目標(biāo)蛋白進(jìn)行連接且不會對目標(biāo)蛋白調(diào)控造成影響，因此不會對蛋白表達(dá)及表達(dá)量造成不利，在經(jīng)過連續(xù)倆步的親和純化獲得活性接近自然狀態(tài)的蛋白復(fù)合物，隨后用Edman降解法或質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定。該方法優(yōu)點(diǎn)是假陽性率低、周期短、特異性高，可分析復(fù)合物中蛋白間穩(wěn)定以及瞬時(shí)結(jié)合的互作情況。缺點(diǎn)是TAP標(biāo)簽會影響目標(biāo)蛋白與親和柱的結(jié)合，并干擾蛋白復(fù)合物的活性狀態(tài)。

TAP的優(yōu)點(diǎn)是接近原始自然狀態(tài)下測定蛋白互作，受到很多研究人員的推崇，但標(biāo)簽會在一定程度上干擾試驗(yàn)，如何排除標(biāo)簽帶來的干擾對于提升TAP技術(shù)有重要意義。Gong W等[21]通過串聯(lián)親和純化與雙向電泳技術(shù)的結(jié)合，并借助電鏡等儀器成功發(fā)現(xiàn)5個(gè)新的立氏立克次體體感誘發(fā)電位，尤其是Adr1、Adr2及OmpW都與血管內(nèi)皮細(xì)胞有相互作用。而另一些人則通過對試驗(yàn)本身，通過對標(biāo)簽的改善提高TAP的靈敏度，如Higo T等[22]開發(fā)了用于高效標(biāo)記畢赤酵母中染色體的方法，通過使用串聯(lián)親和純化標(biāo)簽在特定位置進(jìn)行標(biāo)記，并用HIS及FLAG序列反標(biāo)記標(biāo)簽后進(jìn)行親和純化，成功從P.pastoris畢赤酵母中純化出RNA聚合酶123,為后續(xù)快速大規(guī)模制備真核生物結(jié)晶級多亞基蛋白復(fù)合物奠定基礎(chǔ)。

6雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)

雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)(bimolecular fluorescence complementation,BiFC)最早是由Hu C D等[23]報(bào)道的一種準(zhǔn)確直觀的判斷靶蛋白在活細(xì)胞中的定位以及相互作用的新技術(shù)。雙分子熒光互補(bǔ)技術(shù)原理為將熒光蛋白(GFP、YFP、CFP等)切開形成N-端與C-末端的倆段不發(fā)光的多肽鏈，然后分別將這倆段多肽鏈連接到要驗(yàn)證的相互作用的靶蛋白上，當(dāng)靶蛋白在體內(nèi)或體外共同表達(dá)并相互作用融合，被分割開來的熒光蛋白肽鏈就可以互補(bǔ)重新連接到一起形成完整的熒光蛋白。該方法優(yōu)點(diǎn)是簡單快速，適用范圍廣。缺點(diǎn)易出現(xiàn)假陽性與假陰性的結(jié)果，需多次重復(fù)確定結(jié)果。盡管該技術(shù)有所限制，但是經(jīng)過不斷的改良，其后更是發(fā)展出了多色熒光互補(bǔ)技術(shù)(multicolor BiFC)，可以同時(shí)對多種蛋白間的相互作用進(jìn)行驗(yàn)證，并且可以比對蛋白互作程度的強(qiáng)弱，非常便利。

隨著BiFC的深入研究和性能的不斷發(fā)掘，現(xiàn)在可以應(yīng)用到多種細(xì)胞及生物體內(nèi)的蛋白間互作的研究，并可確定互作在細(xì)胞中的發(fā)生部位，簡單、耗時(shí)短使近幾年有許多相關(guān)報(bào)道，如Chen M等[24]通過BiFC檢測到了HIV-1與輔助因子蛋白以及上皮衍生生長因子之間的相互作用，并且是一種強(qiáng)的相互作用。這項(xiàng)研究提供了新的蛋白質(zhì)生理?xiàng)l件下的成像系統(tǒng)，并為抗HIV療法的蛋白抑制劑類藥物研發(fā)提供信息。Nickerson A等[25]更是將雙分子熒光與PALM相結(jié)合，證實(shí)了GTPase Ras與Raf之間的相互作用，這個(gè)結(jié)果在分子級上為Ras/Raf之間的互作調(diào)節(jié)提供了新的方向。

7蛋白質(zhì)芯片技術(shù)

蛋白質(zhì)芯片又稱蛋白質(zhì)微列陣，根據(jù)制作方法和應(yīng)用的不同將蛋白質(zhì)芯片分為2種：①蛋白質(zhì)檢測芯片，類似于較早出現(xiàn)的基因芯片，即在固相支持物表面高度密集的排列探針蛋白點(diǎn)陣，當(dāng)待測靶蛋白與其反應(yīng)時(shí)，可特異性的捕獲靶蛋白，然后通過檢測系統(tǒng)對其進(jìn)行分析，常用的是表面增強(qiáng)激光解析離子化-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(SELD-TOF-MS)將靶蛋白離子化，直接對其進(jìn)行定性、定量分析。②蛋白質(zhì)功能芯片，即樣品中待測蛋白在電場作用下通過芯片上的微型孔道進(jìn)行分離，后經(jīng)過噴射進(jìn)入質(zhì)譜儀中來檢測靶蛋白。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是簡單快捷，高通量，重復(fù)性與敏感性好，可以檢測一些難以鑒定的低豐度，小分子質(zhì)量蛋白。缺點(diǎn)是進(jìn)行大量樣品測定時(shí)，需制備大量探針，另外芯片與靶蛋白結(jié)合特異性不高。蛋白質(zhì)芯片是近年來發(fā)展起來的新興生物檢測技術(shù)，經(jīng)過不斷的摸索與完善，該技術(shù)已經(jīng)在生物領(lǐng)域中廣泛使用。

目前，很多人著手于蛋白互作的課題，需要高通量、高敏感篩選互作蛋白時(shí)，蛋白質(zhì)芯片技術(shù)的優(yōu)勢就體現(xiàn)出來了，如Zhu H等[26]為深層探索酵母蛋白質(zhì)組，制備了多達(dá)5 800種的蛋白質(zhì)芯片，篩選它們與蛋白質(zhì)、磷脂質(zhì)等的互作能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了很多新的相互作用蛋白。而通過第二種功能芯片還可以進(jìn)一步的了解靶蛋白相關(guān)功能，如Jiang B等[27]也通過該方法將核因子κB誘導(dǎo)激酶(nuclear factor κB-inducing kinase,NIK)結(jié)合到芯片上確定了NIK的負(fù)調(diào)控可以阻止肝損傷。

8Far Western blot

Far Western blot與Western blot相似，區(qū)別在于Far Western blot的一抗用帶有標(biāo)記物的待測蛋白來代替，如果膜上蛋白與帶標(biāo)記蛋白間有相互作用，就可以達(dá)到Western blot一抗的效果，最終結(jié)果就可以證明目的蛋白間的相互作用，用這種分析方法使用合成肽作為探針檢查交互序列(interaction sequences，IS)可以對翻譯后修飾蛋白間的互作進(jìn)行研究，并確定在不使用抗原特異性抗體時(shí)的蛋白與蛋白之間的相互作用。該方法優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，將陽性率低，已經(jīng)在蛋白質(zhì)組學(xué)中廣泛應(yīng)用。缺點(diǎn)是每個(gè)試驗(yàn)需要的單抗如果買不到都要單獨(dú)制備，成本較高。

對于弱結(jié)合的互作來說，該技術(shù)未必能準(zhǔn)確檢測到，但由于技術(shù)不斷的成熟，使得弱結(jié)合也可以準(zhǔn)確檢測到。Sato Y等[28]通過far Western blot 檢測到微弱的蛋白質(zhì)相互作用并使微弱的條帶得到增強(qiáng)。通過該方法檢測倆種蛋白質(zhì)之間是否有穩(wěn)定結(jié)合互作，如果是瞬時(shí)結(jié)合，可以用候補(bǔ)蛋白進(jìn)一步檢查，確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，為瞬時(shí)結(jié)合不易被檢測到的問題進(jìn)行了優(yōu)化。近幾年該技術(shù)不斷改進(jìn)，由于其試驗(yàn)方便、快捷，使其應(yīng)用頻繁，有關(guān)報(bào)道如Liu Q H等[29]使用far Western blot證明了南美白對蝦核衣殼蛋白VP51與核糖體蛋白L7的相互作用，同時(shí)說明了L7參與對蝦白斑綜合(White spot syndrome,WSSV)感染，為進(jìn)一步研究探索L7在WSSV作用機(jī)制打下基礎(chǔ)。

9免疫共沉淀

免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)是根據(jù)抗原抗體專一性驗(yàn)證蛋白之間相互作用的經(jīng)典手段。該技術(shù)的原理是使用非變性劑對細(xì)胞進(jìn)行裂解，這樣原細(xì)胞內(nèi)的相互作用蛋白會很完整的保留下來，隨后加入靶蛋白的對應(yīng)抗體使之形成抗原抗體復(fù)合物沉淀，這樣與靶蛋白在細(xì)胞內(nèi)相互作用的蛋白也會一同被沉淀下來，故稱免疫共沉淀。該技術(shù)優(yōu)點(diǎn)是保持了蛋白的天然狀態(tài)，真實(shí)的反應(yīng)互作結(jié)果。缺點(diǎn)是不易檢測到瞬時(shí)以及不穩(wěn)定的互作關(guān)系(因?yàn)樗矔r(shí)以及不穩(wěn)定的互作無法形成穩(wěn)定的沉淀)，且由于蛋白并未經(jīng)過純化所以不能證明蛋白間的相互作用是直接的還是間接的。

當(dāng)確定某種互作關(guān)系后，形成的復(fù)合物的功能和性質(zhì)也將成為研究的目標(biāo)，而復(fù)合物的作用機(jī)制也需進(jìn)一步探究。Bilusic I等[30]通過免疫共沉淀檢測到大腸埃希菌RNA分子伴侶(host factor for RNA phage QB replicase,HFQ)與體內(nèi)許多sRNAs的結(jié)合并確定了25種新型RNA，另通過Northern blot發(fā)現(xiàn)了與HFQ結(jié)合的RNA形成的復(fù)合物均受HFQ的調(diào)控。Co-IP一般用于倆倆間的蛋白互作驗(yàn)證，無法大規(guī)模進(jìn)行驗(yàn)證，而凌夢婷等[31]以液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(liquid chromatograph-mass spectrometer,LC-MS/MS)鑒定技術(shù)為基礎(chǔ)，通過Co-IP大規(guī)模的篩選了45個(gè)與HBV病毒POL蛋白的互作蛋白，其中有11個(gè)已經(jīng)有過報(bào)道，在這些蛋白中有4種蛋白可能參與了3種主要分子機(jī)制，為進(jìn)一步探索HBV蛋白功能結(jié)構(gòu)提供理論依據(jù)，也看出蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)間的聯(lián)用可以對試驗(yàn)有很大改善。

10BIAcore

在蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)不斷更新?lián)Q代時(shí)，相關(guān)儀器設(shè)備也在不斷改良，測定偏向于蛋白互作弱結(jié)合的儀器設(shè)備是奧弗豪塞爾核效應(yīng)(nuclear overhauser effect,transfer-NOE)和等溫滴定量熱法(isothermal titration calorimetry,ITC)，偏向于測定強(qiáng)的蛋白互作比較流行的便是以表面離子共振(surface plasmon resonance,SPR)技術(shù)為基礎(chǔ)的生物分子相互作用分析(Biomolecular interaction analysis,BIAcore)，這里著重介紹BIAcore。

Amersham Bioscience公司是實(shí)現(xiàn)該技術(shù)商業(yè)化最成功的公司，其推出的儀器商品即為BIAcore,現(xiàn)有BIAcore1000/2000/3000/X等產(chǎn)品系列，BIAcore系統(tǒng)由微射流卡盤、傳感器芯片和SPR光學(xué)檢測系統(tǒng)3個(gè)核心部分組成，它的工作原理是基于SPR技術(shù)來實(shí)時(shí)追蹤生物分子間的相互作用。試驗(yàn)開始是先將一種生物分子固定在傳感器芯片表面，再通過微射流卡盤將待測相互作用的分子溶液傳送至傳感器芯片表面，SPR光學(xué)檢測系統(tǒng)則跟蹤檢測溶液與芯片表面的分子結(jié)合和解離的全過程，試驗(yàn)過程中獲取的各種特異性信號全部通過數(shù)據(jù)分析軟件BIAEvaluation處理，并整合成最終結(jié)果。在超過17年的時(shí)間里，BIAcore 系統(tǒng)為科學(xué)家們提供了獨(dú)到的洞察力來揭示蛋白質(zhì)的相互作用，發(fā)表文獻(xiàn)超過6 500篇，而近幾年國外也不斷有應(yīng)用BIAcore來進(jìn)行蛋白互作驗(yàn)證的例子[32-33]。由于其高度的自動化和靈敏特異性且具常規(guī)儀器方法難以比擬的實(shí)時(shí)、動態(tài)監(jiān)測優(yōu)點(diǎn)，而且該儀器可以與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合使用，使BIAcore廣泛地應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的研究。

11小結(jié)與展望

蛋白質(zhì)之間的互作是直接的還是間接的，瞬時(shí)的還是緩慢的，強(qiáng)結(jié)合還是弱結(jié)合，這些都與生物體內(nèi)機(jī)制息息相關(guān)，探究蛋白間的互作對于進(jìn)一步了解生物體機(jī)制有著深遠(yuǎn)的意義。蛋白間互作的抑制劑(protein-protein interact inhibitors, PPIIs)由此產(chǎn)生，通過對蛋白互作的阻斷達(dá)到病毒機(jī)制“失活”的效果，發(fā)揮抗病毒作用使臨床疾病得以完善治療，而最近幾年抗病毒藥物的快速研發(fā)也說明了PPIIs有發(fā)展成為抗癌藥物的潛力[34]。目前對于少量的蛋白互作檢測多用幾種方法協(xié)同驗(yàn)證，力求結(jié)果精準(zhǔn)。而對于未知的物種間蛋白的互作，則可以借用生物信息學(xué)來進(jìn)行初步篩選判斷，既可節(jié)約時(shí)間也可增加試驗(yàn)成功率。在過去的幾十年不僅蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)飛速發(fā)展，蛋白質(zhì)組學(xué)的生物信息學(xué)也嶄露頭角，筆者將國內(nèi)與國外的部分蛋白質(zhì)互作生物信息學(xué)相關(guān)的蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了整合[35-36](表1)。

可見生物信息學(xué)在蛋白質(zhì)組學(xué)中也占據(jù)了舉足輕重的地位，很多實(shí)驗(yàn)室都將生物信息學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相結(jié)合獲得更精確的結(jié)果。相信在未來蛋白質(zhì)組學(xué)研究重心將繼續(xù)向蛋白質(zhì)的互作研究發(fā)展并且協(xié)同生物信息學(xué)會在生命科學(xué)領(lǐng)域突飛猛進(jìn)，為探索臨床疾病發(fā)生機(jī)制指明新方向。

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獸醫(yī)臨床

Protein-protein Interaction Technology

WU Jian1,2,ZHU Hai-xia1, ZHAO Zhi-xun1, YAN Xin-min1,ZHAO Yin-long3, WU Na1,LI Jian1,ZHANG Zhi-dong1, ZHANG Qiang1, LI Ying2, WU Guo-hua1

(1.StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology/LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalScience,Lanzhou,Gansu,730046,China；2.CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgricultureUniversity,Changchun,Jilin,130118,China;3.AcademyofLifeScienceandTechnology,NorthwestUniversityforNationalities,Lanzhou,Gansu,730124,China)

Abstract:Protein in the mechanism of the organism is essential as a start within biological systems and perform tasks. Every biological step of the organism, from the genetic material copy to the cell aging and death, depends on a few or even hundreds of protein function coordination. The protein function and structural changes will destroy this balance, leading to the occurrence of disease, usually as a result of protein-protein interactions. There are still a lot of structures and functions of the proteins unknown, so it is particularly rapid in development of proteomics. This article reviewed the proteomics technologies,such as 2-DE, phage display technology, GST pull-down, yeast two-hybrid system,TAP,BiFC, protein chip, Far Western blot,Co-IP,and introducted the application of these technologies in biology in recent years.

Key words:protein-protein interaction; protein-protein interaction inhibitor; bioinformatics

文章編號:1007-5038(2016)02-0109-07

中圖分類號:S852.2

文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

作者簡介：吳健(1990-)，男，吉林長春人，碩士研究生，主要從事分子免疫學(xué)研究。

基金項(xiàng)目：國家質(zhì)檢總局公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201310093)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201892)；甘肅省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(1208RJZA101)；國家863計(jì)劃項(xiàng)目(2012AA101304)；甘肅省科技資助計(jì)劃項(xiàng)目(1504WKCA055)

收稿日期：2015-04-29