劉　果，紀(jì)　雪，孫　洋，劉　哲，祝令偉，劉　軍，周　偉，郭學(xué)軍，馮書章

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130122)

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寵物源大腸埃希菌的分離鑒定和耐藥性研究

劉果，紀(jì)雪*，孫洋，劉哲，祝令偉，劉軍，周偉，郭學(xué)軍，馮書章*

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林長春 130122)

摘要:為調(diào)查長春地區(qū)寵物源大腸埃希菌耐藥流行情況，從2家寵物醫(yī)院采集135份寵物肛拭子樣品，分離和鑒定大腸埃希菌并進(jìn)行多重PCR分群。測(cè)定大腸埃希菌分離株對(duì)19種抗菌藥物的耐藥性，并鑒定超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)表型。共分離鑒定獲得95株寵物源大腸埃希菌，它們對(duì)氨芐西林和哌拉西林的耐藥率最高(78.9%和76.8%)；其次是四環(huán)素(61.6%)；對(duì)頭孢唑林、頭孢噻肟、頭孢吡肟、慶大霉素、復(fù)方新諾明、環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率均超過了50%；所有分離株均對(duì)亞胺培南和美羅培南敏感。其中15個(gè)分離株對(duì)受試的抗菌藥物全部敏感(15.8%)，63株呈多重耐藥表型(66.3%)。ESBLs型菌株占53.7%。本研究探明了長春地區(qū)寵物源大腸埃希菌的耐藥流行情況，對(duì)寵物臨床上用藥具有指導(dǎo)價(jià)值。

關(guān)鍵詞:大腸埃希菌；耐藥性；超廣譜β內(nèi)酰胺酶；寵物

隨著我國寵物行業(yè)的快速發(fā)展，越來越多的抗生素被用于寵物疾病的預(yù)防和治療。在抗生素的選擇壓力下，細(xì)菌耐藥性也越來越嚴(yán)重，耐藥性的產(chǎn)生和加劇必然為細(xì)菌性疾病的治療帶來困難。由于寵物壽命長，與主人接觸多，促進(jìn)了微生物群落在二者之間的相互轉(zhuǎn)移，通過皮膚接觸或由攜帶微生物的唾液、糞便直接傳播，或通過家庭環(huán)境間接傳播[1]。因此，寵物的抗生素耐藥性不僅是獸醫(yī)上的一個(gè)重要問題，同時(shí)也對(duì)公共衛(wèi)生產(chǎn)生威脅[2]。大腸埃希菌作為機(jī)體腸道內(nèi)較為常見的細(xì)菌之一，成為各種耐藥基因的儲(chǔ)存庫。因此，研究寵物源大腸埃希菌的耐藥性具有重要意義。本研究調(diào)查了2015年長春地區(qū)寵物源大腸埃希菌的耐藥流行情況，為寵物的臨床用藥提供了科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品采集2015年4月，從吉林省長春市2家寵物醫(yī)院共采集135份肛拭子樣品(其中犬122份、貓13份)。

1.1.2主要儀器生物安全柜(1300A2)為美國Thermo公司產(chǎn)品；BD PhoenixTM-100 System細(xì)菌鑒定儀、PhoenixSpecTM 比濁儀均為美國BD公司產(chǎn)品。

1.1.3主要試劑與培養(yǎng)基麥康凱瓊脂為青島高科園海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；胰蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸粉、可溶性淀粉為英國Oxoid公司產(chǎn)品；大腸埃希菌顯色培養(yǎng)基為法國科瑪嘉公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1大腸埃希菌分離純化向肛拭子樣品管中加入1 mL 8.5 g/L的無菌生理鹽水， 37 ℃恒溫180 r/min震蕩10 min，靜置2 min。無菌條件下，用接種環(huán)蘸取上清液于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上劃線，37 ℃過夜培養(yǎng)。每塊平板上隨機(jī)挑取一個(gè)紫紅色、邊緣光滑的單菌落于顯色培養(yǎng)基上劃線，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取紫紅色單菌落接種于1 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫180 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。

1.2.2大腸埃希菌PCR鑒定根據(jù)文獻(xiàn)[3]，用大腸埃希菌16 S rDNA特異性引物對(duì)大腸埃希菌分離株進(jìn)行PCR鑒定，引物序列見表1。

1.2.3大腸埃希菌生化鑒定和藥敏檢測(cè)通過BD PhoenixTM-100 System全自動(dòng)微生物鑒定/藥敏系統(tǒng)對(duì)PCR鑒定陽性的大腸埃希菌分離株進(jìn)行生化鑒定、藥敏檢測(cè)以及超廣譜β內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases,ESBLs)表型判定。

1.2.4大腸埃希菌分群鑒定根據(jù)文獻(xiàn)[4]，利用多重PCR方法分群，可將大腸埃希菌分為A群、B1群、B2群、D群和未知群5個(gè)類別。分群鑒定引物序列如表2。

表1　大腸埃希菌特異性16 S rDNA鑒定引物

表2　大腸埃希菌分群鑒定引物

2結(jié)果

2.1大腸埃希菌分離鑒定

通過麥康凱選擇性培養(yǎng)基和科瑪嘉顯色培養(yǎng)基，以及大腸埃希菌特異性16 S rDNA PCR鑒定和細(xì)菌鑒定儀檢測(cè)，從135份肛拭子樣品中分離得到95株大腸埃希菌分離株。

2.2大腸埃希菌藥敏檢測(cè)

對(duì)95株寵物源大腸埃希菌進(jìn)行6類(19種)抗生素的藥物敏感性檢測(cè)，并判定ESBLs表型。抗生素耐藥率如圖1。結(jié)果表明，寵物源大腸埃希菌分離株對(duì)氨芐西林(AMP)和哌拉西林(PIP)的耐藥率最高，分別為78.9%(75/95)和76.8%(73/95)；其次是四環(huán)素(TET)，耐藥率高達(dá)61.6%(58/95)；對(duì)頭孢唑林(CZO，56%，53/95)、頭孢噻肟(CTX，52.6%，50/95)、頭孢吡肟(FEP，50.5%，48/95)、慶大霉素(GEN，56%，53/95)、復(fù)方新諾明(SXT，50.5%，48/95)、環(huán)丙沙星(CIP，51.6%，49/95)和左氧氟沙星(LVX，50.5%，48/95)耐藥嚴(yán)重，耐藥率均超過了50% ；對(duì)氯霉素(CHL，37.9%，36/95)和氨芐西林-舒巴坦(SAM，30.5%，29/95)中度耐藥；對(duì)阿米卡星(AMK，17.9%，17/95)、頭孢他啶(CAZ，12.6%，12/95)、氨曲南(ATM，23.2%，22/95)、阿莫西林-克拉維酸(AMC，2.1%，2/95)相對(duì)敏感；僅對(duì)亞胺培南(IMP)和美羅培南(MEM)全部敏感。經(jīng)細(xì)菌鑒定儀判定為ESBL表型的大腸埃希菌占53.7%(51/95)。

圖1　寵物源大腸埃希菌對(duì)抗生素耐藥率

2.3耐藥譜分析

對(duì)寵物源大腸埃希菌分離株耐受的抗生素種類及其對(duì)應(yīng)的耐藥菌株數(shù)、百分比和主要的耐藥模式進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，結(jié)果見表3。僅有15株大腸埃希菌分離株對(duì)所有抗生素全部敏感(15.8%，15/95)，有9株大腸埃希菌對(duì)1種~3種抗生素耐藥(9.47%，9/95)，其余全部表現(xiàn)出對(duì)3種及以上的抗生素耐藥。對(duì)4種~6種抗生素耐藥的有18株(18.9%，18/95)；對(duì)7種~9種抗生素耐藥的有17株(17.9%，17/95)；對(duì)10種~12種抗生素耐藥的有29株(30.5%，29/95)；對(duì)13種~15種抗生素耐藥的有7株(7.37%，7/95)。其中，對(duì)12種抗生素耐藥的菌株高達(dá)15株(15.8%，15/95)。頻率最高的耐藥模式為AMP-ATM-CAZ-CIP-LVX-CHL-TET -CZO-CTX-FEP-GEN-PIP(6.31%，6/95)。

表3　寵物源大腸埃希菌主要耐藥模式

進(jìn)行耐藥性檢測(cè)的抗生素有六大類，包括β-內(nèi)酰胺類、氨基糖苷類、磺胺類、喹諾酮類、氯霉素類和四環(huán)素類。一般定義對(duì)三類及三類以上抗生素耐藥的細(xì)菌為多重耐藥菌(Multidrug resistance MDR)。如圖2所示，多重耐藥菌為63株(66.3%，63/95)，其中對(duì)五類抗生素耐藥的菌株最多，為27株(28.4%，27/95)，對(duì)所檢測(cè)的六類抗生素全部耐藥的有11株(11.6%，11/95)。

圖2　寵物源大腸埃希菌多重耐藥模式

2.4大腸埃希菌分群

大腸埃希菌分群結(jié)果如圖3和表4所示。B2和D群大腸埃希菌數(shù)量相當(dāng)，且顯著高于A和B1群，未知群的數(shù)量最少。B2和D群大腸埃希菌被認(rèn)為是常見的致病性大腸埃希菌，在本研究中，B2和D群大腸埃希菌占53.7%(51/95)。

2.5大腸埃希菌分群與多重耐藥的關(guān)系

由于B2和D群被認(rèn)為是常見的致病性大腸埃希菌，將5個(gè)群分為A+B1+未知群和B2+D 2組；將三類及以上抗生素耐藥(≥3R)的菌株定義為多重耐藥菌。進(jìn)而分析非多重耐藥菌和多重耐藥菌在致病菌和非致病菌兩組中的分布，來探究耐藥性與致病性之間的關(guān)系，結(jié)果見表5。本研究中，非多重耐藥菌在B2和D組中的分布顯著高于A+B1+未知群組的分布，多重耐藥菌在A+B1+未知群組中的分布顯著高于B2和D組中的分布。

1.未知群；2.A群； 3.B1群； 4~5.D群； 6~7.B2群；M. DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000

1.Group untyped; 2.Group A; 3.Group B1; 4-5.Group D; 6-7. Group B2; M. DNA Marker DL 2 000

圖3　大腸埃希菌的多重PCR分群結(jié)果(部分)

表5　多重耐藥菌株在不同分群中的分布

3討論

近年來，隨著抗生素的濫用，從寵物中分離到越來越多的多重耐藥大腸埃希菌，其中包括一些與人源分離株極其相似的菌株，如ST131和ST648菌株[5-6]。充分的證據(jù)表明細(xì)菌及其攜帶的耐藥性能夠在人和動(dòng)物之間水平傳播[7]。因此，寵物源大腸埃希菌耐藥菌株的出現(xiàn)，不僅限制了寵物臨床治療的抗生素藥物的選擇，還威脅到人類健康，給公共衛(wèi)生帶來嚴(yán)重影響。

研究顯示，寵物源大腸埃希菌對(duì)早期抗生素如氨芐西林和四環(huán)素耐藥情況都相當(dāng)嚴(yán)重，對(duì)目前臨床上的常用抗生素-頭孢噻肟、慶大霉素、磺胺類、喹諾酮類抗生素的耐藥率也都超過了50%，這表明在抗生素的選擇壓力下寵物源大腸埃希菌已經(jīng)嚴(yán)重耐藥。而對(duì)于同一類型的抗生素，慶大霉素(56%)和阿米卡星(17.9%)的耐藥率差異較大，第三代頭孢菌素中，頭孢噻肟(52.6%)和頭孢他啶(12.6%)的耐藥率差異較大，這可能與臨床上藥物的使用頻率相關(guān)。

本研究中寵物源大腸埃希菌分離株對(duì)各種抗生素的耐藥率均遠(yuǎn)高于國外同類研究中的報(bào)道[8]。其中對(duì)氨芐西林(78.9%)、慶大霉素(56%)、氯霉素(37.9%)和環(huán)丙沙星(51.6%)的耐藥率與蔣月[9]、賀志沛等[10]等報(bào)道的其他地區(qū)的寵物肛拭子樣品中大腸埃希菌分離株的耐藥率相近。而這些分離株對(duì)于阿米卡星(17.9%)、阿莫西林-克拉維酸(2.1%)和復(fù)方新諾明(50.5%)的耐藥率明顯偏低?？梢?，長春地區(qū)寵物源大腸埃希菌耐藥性在整體上略低于國內(nèi)其他地區(qū)。

在獸用抗生素方面，β-內(nèi)酰胺類藥物是治療革蘭氏陰性細(xì)菌感染的最重要、最廣泛使用的抗菌藥物[11]，其不合理的使用會(huì)加劇ESBLs菌株的流行。本研究中長春地區(qū)寵物源ESBL表型菌株比例(53.7%)雖然顯著低于2013年趙相勝等[12]報(bào)道的比例(67.7%)，仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于國外相關(guān)報(bào)道[13-14]，也顯著高于Sun等[15]對(duì)廣東省寵物源大腸埃希菌研究中的比例(40.4%)，可能與長春地區(qū)寵物臨床治療中頻繁使用頭孢菌素有關(guān)。

在大腸埃希菌分群方面，B2和D群大腸埃希菌比例(53.7%)明顯高于2013年趙相勝等[12]獲得的寵物源大腸埃希菌B2和D群比例(41.0%)。在耐藥情況與分群關(guān)系的研究中，我們發(fā)現(xiàn)多重耐藥菌多為非致病菌株，說明與致病菌株相比，非致病菌株耐藥更嚴(yán)重，這一現(xiàn)象也值得深入研究。

動(dòng)物抗生素耐藥問題已經(jīng)引起了越來越多的關(guān)注，各國抗生素使用和耐藥菌監(jiān)測(cè)系統(tǒng)都加強(qiáng)了對(duì)獸用抗生素及動(dòng)物源耐藥菌的監(jiān)管。如法國的Resapath、德國的GERM-Vet和丹麥的DNAMAP，我國也建立了動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性監(jiān)控系統(tǒng)[16]。大量研究表明，我國動(dòng)物源細(xì)菌抗生素耐藥情況比國外更為嚴(yán)重，抗生素使用和細(xì)菌耐藥性發(fā)生和傳播存在直接的因果關(guān)系。新型抗生素的研發(fā)仍然任重而道遠(yuǎn)，這就要求人們更加重視合理地使用抗生素，顯然這是獸醫(yī)工作人員、政府監(jiān)管機(jī)構(gòu)、公共衛(wèi)生部門及動(dòng)物飼養(yǎng)者所面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。

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Isolation, Identification and Antimicrobial Resistance ofEscherichiacoliin Companion Animals

LIU Guo, JI Xue, SUN Yang, LIU Zhe, ZHU Ling-wei, LIU Jun,ZHOU Wei, GUO Xue-jun,FENG Shu-zhang

(InstituteofMilitaryVeterinaryMedicine,AMMS,KeyLaboratoryofJilinProvinceforZoonosisPreventionandControl,Changchun,Jilin, 130122,China)

Abstract:The occurrence of antimicrobial-resistant Escherichia coli and related resistance characteristics were investigated in companion animals in Changchun. E. coli were isolated and identified from 135 anal swab samples from two pet hospitals. Triplex PCR was used to detect E. coli phylogenetic groups. The resistance to 19 antimicrobial agents and extended-spectrum β-lactamases(ESBLs) phenotype were detected by BD PhoenixTM-100 System. Among 95 isolates, 78.9% showed resistance to ampicillin, 76.8% showed resistance to piperacillin, followed by 61.6% showed resistance to tetracycline. More than 50% isolates showed resistance to cefazolin, cefotaxime, cefepime, gentamicin, trimethoprim-sulfamethoxazole, ciprofloxacin and levofloxacin. However, all these isolates were sensitive to imipenem and meropenem. Furthermore, 15 isolates were sensitive to all the antimicrobials tested (15.8%). 63 isolates presented multidrug resistance phenotype (66.3%). 53.7% of these isolates presented ESBL phenotype. This study provided the epidemiological characteristics of antimicrobial-resistant E. coli from pets in Changchun, which may be useful for companion animal treatment.

Key words:Escherichia coli; antimicrobial resistance; extended-spectrum β-lactamases; companion animal

文章編號(hào):1007-5038(2016)02-0120-05

中圖分類號(hào):S852.612

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B

作者簡(jiǎn)介：劉果(1989-),女，河南南陽人，碩士研究生，主要從事細(xì)菌耐藥性研究。*通訊作者

基金項(xiàng)目：國家科技部傳染病重大專項(xiàng)(2013ZX10004-217-002)；863項(xiàng)目(2012AA022006)；吉林省科技計(jì)劃項(xiàng)目(20150101110JC)

收稿日期：2015-07-17