翁善鋼

（外高橋出入境檢驗檢疫局，上海浦東新區(qū)200137）

豬德爾塔冠狀病毒的流行與防控

翁善鋼

（外高橋出入境檢驗檢疫局，上海浦東新區(qū)200137）

豬德爾塔冠狀病毒（Porcine Deltacoronavirus, PDCoV），又稱豬δ冠狀病毒、豬丁型冠狀病毒。它是這幾年新發(fā)現(xiàn)的一種豬病病毒，也是引起仔豬腹瀉的一種重要病原體。

1 病原學(xué)

冠狀病毒（Coronavirus,Cov）屬于套式病毒目（Nidovirales）冠狀病毒科（Coronaviridae）。冠狀病毒的宿主范圍較廣，包括鳥類、人以及其它哺乳動物[1]。自從2003年嚴重急性呼吸綜合征（Severe acute respiratory syndrome,SARS）暴發(fā)以來，冠狀病毒受到高度重視，不斷有新的冠狀病毒被發(fā)現(xiàn)，如近年來出現(xiàn)的中東呼吸綜合征冠狀病毒（Middle east respiratorysundrome coronavirus,MERS-CoV）。

2011年，國際病毒分類委員會（ICTV）第9次報告中將冠狀病毒分為α、β、γ以及新假定的一個屬（即δ）。冠狀病毒共4個屬。α和β冠狀病毒屬主要由哺乳動物冠狀病毒組成，γ冠狀病毒屬主要包括鳥類冠狀病毒，而δ冠狀病毒屬既包括哺乳動物冠狀病毒，也含有鳥類冠狀病毒。與其它3個屬相比，人們對δ冠狀病毒屬的了解還非常少。δ冠狀病毒最早于2007年從亞洲豹貓和中國白鼬獾群中檢測到[2]。2014年，豬δ冠狀病毒在美國被成功分離，動物試驗證實PDCoV對仔豬具有較強的致病性，成為研究δ冠狀病毒的良好模型。目前，δ冠狀病毒屬主要包括亞洲豹貓冠狀病毒（Asian leopard cats Coronavirus,ALCCoV）、中國白鼬獾冠狀病毒（Chinese ferret badger Coronavirus,CFBCoV）、豬δ冠狀病毒、繡眼鳥冠狀病毒（white eye Coronavirus,WECoV）、麻雀冠狀病毒（Sparrow Coronavirus,SPCoV）、鵲鴝冠狀病毒（Magpie robbin Coronavirus,MRCoV）、夜鷺冠狀病毒（Night heron Coronavirus,NHCoV）、野鴨冠狀病毒（Wigeon Coronavirus,WiCoV）、黑水雞冠狀病毒（Common Moorhen Coronavirus,CMCoV）以及夜鶯冠狀病毒（bulbul Coronavirus,BuCoV）、鵝口瘡冠狀病毒（Thrush Coronavirus,ThCoV）、文鳥冠狀病毒（Munia Coronavirus,MunCoV）。

根據(jù)目前已經(jīng)測定的PDCoV全基因組序列，病毒基因組大小約為25.4 kb，是所有冠狀病毒中基因組最小的，GC含量約為43%。PDCoV基因組的組成、排列與其它冠狀病毒類似，兩端包含兩個較短的非編碼區(qū)（Untranslated region,UTR），即5'-UTR和3'-UTR。5'端2/3的基因組編碼兩個大的重疊的開放閱讀框（Open reading frame,ORF）ORF1a和ORF1b，分別編碼兩個多聚蛋白pp1a和pp1ab?；谄渌跔畈《痉墙Y(jié)構(gòu)蛋白的組成并通過生物信息軟件預(yù)測，PDCoV的多聚蛋白pp1a和pp1ab可能被切割、加工、形成15個成熟的非結(jié)構(gòu)蛋白（Nonstructural proteins,Nsps）。這些Nsps主要是與病毒復(fù)制轉(zhuǎn)錄有關(guān)的蛋白酶，包括Nsp3（木瓜蛋白酶，PL－pro）、Nsp5（糜蛋白酶，3CLpro）、Nsp12（RNA依賴的RNA聚合酶，RdRp）、Nsp13（解旋酶，Hel）以及其它未知功能的蛋白。PDCoV基因組3'端主要編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，依次包括表面纖突蛋白（Spike,S）、小膜蛋白（Small membrane,E）、膜蛋白（Membrane,M）以及核衣殼蛋白（Nucleocapsid,N）。

在冠狀病毒的結(jié)構(gòu)蛋白基因之間或內(nèi)部，常常存在一些小的ORF，編碼數(shù)量不等的群特異性輔助蛋白（Accessory protein）。這些輔助蛋白在不同冠狀病毒中的編碼區(qū)位置以及個數(shù)差異都比較大，主要發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。在PDCoV的M基因和N基因之間以及N基因內(nèi)部分別存在一個ORF，分別編碼輔助蛋白NS6和NS7，但具體功能尚不清楚。另外，PDCoV的每個編碼基因都有一致的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列（TRS），5'-ACACCA-3'與其它冠狀病毒相比，該序列是δ冠狀病毒屬成員獨有的。N基因下游和3'端poly（A）尾上游還存在莖環(huán)結(jié)構(gòu)，保守的RNA元件，具體功能還不清楚[3]。

2 豬德爾塔冠狀病毒的流行

研究人員早在2012年就從臨床樣品中檢測到了PDCoV，但并沒有分離到病毒，也沒有對該病毒進行大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。2014年1—2月，美國暴發(fā)仔豬腹瀉期間，研究人員從俄亥俄州、愛荷華州、伊利諾斯州發(fā)生腹瀉的豬場檢測到了PDCoV，而且這些豬場的豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus,TGEV）、豬輪狀病毒（Porcine rotavirus,PoRV）等幾種常見的引起腹瀉的病毒均為陰性，這顯示PDCoV具有較強的致病性。全基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，與2012年香港檢測到的兩株P(guān)DCoV（HUK15-44和HUK15-155）同源性高達99%[4]。隨后，研究人員在美國的明尼蘇達、南達科他等9個州均檢測到PDCoV感染。目前，美國有19個州發(fā)生δ冠狀病毒感染，這表明PDCoV在美國普遍流行。2014年4月，在韓國、加拿大發(fā)生腹瀉的仔豬糞便中也檢測到PDCoV，與美國分離株同源性達99.7%以上[5]。

國內(nèi)研究人員董楠等對2013—2014年間采自湖北、江蘇、廣東、河南、安徽等省市規(guī)?；i場的258份糞便樣品進行檢測，共檢測到21份陽性樣品，陽性率為14.3%，這是首次證實在我國豬場中存在PDCoV[6]。研究人員對檢測的部分陽性樣品進行全基因組分析發(fā)現(xiàn)，我國大陸豬場中的PDCoV與2012年香港檢測到的PDCoV HUK15-155株具有較高的同源性。此外，國內(nèi)學(xué)者Song等采用建立的巢式RT-PCR檢測了2012—2015年期間從江西省采集的356份臨床樣品，結(jié)果顯示PDCoV的陽性率高達33.71%[7]。迄今為止，GenBank中共收錄了25條來源于美國、中國、韓國的PDCoV全基因組序列，進化系統(tǒng)樹分析顯示這些毒株的同源性很高，遺傳進化關(guān)系很近，可能起源于同一毒株。

為了搞清楚PDCoV是何時傳入美國的，研究人員對2014年美國18個州51個豬場的血清樣品進行PDCoV抗體檢測，結(jié)果表明樣品陽性率為8.7%，豬場陽性率為25.5%。研究人員同時也從2010年的血清樣品中檢測到相應(yīng)的抗體，表明PDCoV可能早在2010年就在美國豬場中存在。還有研究人員采用Real Time RT-PCR方法對2012—2013年間采自美國豬場的1 734份臨床樣品進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)來源于明尼蘇達州、愛荷華州以及伊利諾斯州2013年的部分樣品為PDCoV陽性，這也表明PDCoV至少在2013年就存在于美國豬群中。國內(nèi)的一個實驗室對其保存的臨床樣品進行了RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，2004年的2份臨床樣品為PDCoV陽性，這提示11年前PDCoV可能就在中國大陸存在，而且基因組序列與2012年中國香港檢測到的HUK15-44具有很高的同源性[6]。

3 豬德爾塔冠狀病毒的致病性

在臨床上，PDCoV可感染各個年齡階段的豬，不過主要引起新生仔豬腹瀉。在試驗條件下，為了避免腸道細菌的協(xié)同致病作用，用過濾的PDCoV陽性病料人工感染10日齡無菌仔豬，感染后21小時左右出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，主要表現(xiàn)為粥樣腹瀉，48小時和72小時出現(xiàn)嘔吐，96～120小時出現(xiàn)嚴重脫水、體重減輕、昏睡癥狀。用PDCoV感染細胞的培養(yǎng)物分別人工感染10日齡無菌仔豬和普通仔豬，都能引起嚴重的腹瀉。對于普通仔豬，腹瀉癥狀可持續(xù)7～10天，體重減輕，隨后癥狀緩解，體重逐漸增加，在整個過程中體溫變化不明顯。值得注意的是，人工感染普通仔豬引起的腹瀉癥狀較無菌仔豬嚴重，時間更早，病毒在普通仔豬體內(nèi)存在時間至少可達21天，這說明腸道細菌可能在PDCoV的致病中發(fā)揮著協(xié)同作用[8]。

4 豬德爾塔冠狀病毒的診斷

PDCoV與PEDV、TGEV等其它豬腸道冠狀病毒感染引起的臨床癥狀非常相似并且存在混合感染。因此，對PDCoV的診斷主要依靠實驗室檢測。目前，已經(jīng)建立的PDCoV檢測方法包括病原學(xué)檢測和抗體檢測。病原學(xué)檢測技術(shù)主要有普通RT-PCR、巢式RT-PCR、熒光定量RT-PCR、免疫組織化學(xué)分析等。因為PDCoV的M基因高度保守，大部分的RTPCR檢測技術(shù)都是針對該基因。有學(xué)者采用PDCoV編碼蛋白M、N、S的多肽免疫家兔，并利用免疫兔的血清作為一抗，建立了PDCoV免疫組織化學(xué)（ICH）方法。采用該方法分析了PDCoV感染豬的不同組織，結(jié)果顯示PDCoV陽性信號主要集中在空腸中端、末端以及回腸部分，表明病毒對空腸中末端及回腸最敏感，為PDCoV的臨床診斷、組織分布以及致病機理研究奠定了基礎(chǔ)[8]。

在抗體檢測技術(shù)方面，有學(xué)者采用體外表達純化的S1蛋白作為包被抗原，建立了檢測PDCoV抗體的間接ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗）方法，這種方法的敏感性為91%，特異性為95%。對355份血清樣品進行檢測，結(jié)果陽性率為8.7%[9]。上述抗原和抗體檢測方法的建立，為PDCoV的病原學(xué)和流行病學(xué)調(diào)查提供了重要工具。

5 豬德爾塔冠狀病毒的防控

目前，尚無針對PDCoV的商品化疫苗與診斷試劑。相信隨著研究的深入，尤其是對其致病和免疫機理的深入了解，在不久的將來，PDCoV的疫苗和診斷試劑都會相繼面世，用于控制該病的發(fā)生與流行。

糞-口傳播和通過污染病毒的器械設(shè)備等非生物媒介傳播是PDCoV在豬群內(nèi)和豬群間傳播病毒的主要途徑。采食含有PDCoV污染的飼料和飼料原料是病毒傳播的一個風(fēng)險因素。美國明尼蘇達大學(xué)的研究人員調(diào)查了PDCoV在飼料和飼料原料以及環(huán)境（新鮮糞便和糞漿）中的存活情況。結(jié)果顯示，在25℃環(huán)境下，飼料原料儲存的時間在21天以上才能夠減少病毒存活，而且不能夠保證病毒的完全滅活。病毒在不同飼料原料中的存活有差異，其中在預(yù)混飼料和肉骨粉中病毒的存活率最高。在糞便和糞漿中，越高的溫度下病毒滅活越多。因此，將樣品暴露于更高的溫度中，并延長儲存時間能夠滅活PDCoV，降低傳播的潛力。因此，做好養(yǎng)豬場的清潔消毒工作，加強飼料管理仍然是做好PDCoV預(yù)防工作的重要內(nèi)容。

[1]Jonassen C M,Kofstad T,Larsen I L,et al.Molecular identification and characterization of novel coronaviruses infecting graylag geese,feral pigeons[J].J Gen Virol,2005,86(6):1597-1607.

[2]Dong B Q,Liu W,Fan X H,et al.Detection of a novel and highly divergent coronavirus from Asian leopard cats and Chinese ferret badgers in southern China[J].J Virol,2007,81(13): 6920-6926.

[3]Woo P C Y,Huang Y,Lau S,et al.Coronavirus Genomics and Bioinformatics Analysis[J].Viruses-Basel,2010,2(8):1804-1820.

[4]Marthaler D,Jiang Y,Collins J,et al.Complete genome sequence of Strain SDCV/USA/Illinois121/2014,a porcine Deltacoronavirus from the United States[J].Genome Announce,2014, 2(2):1-23.

[5]Lee S,Lee C.Complete Genome Characterzation of Korean Porcine DeltacoronavirusStrainKOR/KNU14-04/2014[J]. Genome Announce,2014,2(6):23-28.

[6]Dong N,Fang L R,Zeng S L,et al.Porcine Deltacoronavirus in Mainland China[J].Emerg Infect Dis,2015,21(12):2254-2255.

[7]Song D,Zhou X,Peng Q,et al.Newly Emerged Porcine Deltacoronavirus Associated with Diarrhoea in Swine in China:I－dentification,Prevalence and full length Genome sequence analysis[J].Transbound Emerg Dis,2015,62(6):575-580.

[8]Ma Y M,Zhang Y,Liang X Y,et al.Evolution and Virulence of Porcine Deltacoronavirus in the United States[J].Mbio,2015,6(2): 116-234.

[9]Thachil A,Gerber P F,Xiao C T,et al.Development and application of an ELISA for the detection of porcine deltacoronavirus IgG antibodies[J/OL].Plos one,2015,10(4): e0124363.

（編輯：柳青）

S858.285.3

A

1002-1957(2016)05-0115-03

2016-07-22

翁善鋼（1985-），男，江蘇常熟人，碩士，主要從事各類動物疫病流行病學(xué)及其防控對策研究.E-mail：sgweng@163.com