索朗扎西，許思遙，楊凡，李雨濛，樊毅，文軍，朱玲，徐志文，4

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物技術(shù)中心，四川成都611130；2.西藏自治區(qū)山南市瓊結(jié)縣農(nóng)牧綜合服務(wù)中心，西藏山南856800；3.阿壩州博文農(nóng)牧科技有限公司，四川阿壩藏族羌族自治州624000；4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物疫病與人類健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都611130）

一例藏香豬混合感染豬流行性腹瀉病毒與圓環(huán)病毒2型的報告

索朗扎西1，2，許思遙1，楊凡1，李雨濛1，樊毅1，文軍3，朱玲1，徐志文1，4

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物技術(shù)中心，四川成都611130；2.西藏自治區(qū)山南市瓊結(jié)縣農(nóng)牧綜合服務(wù)中心，西藏山南856800；3.阿壩州博文農(nóng)牧科技有限公司，四川阿壩藏族羌族自治州624000；4.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物疫病與人類健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都611130）

2016年3月四川九寨溝某藏香豬養(yǎng)殖基地出現(xiàn)10余例仔豬死亡案例，臨床癥狀主要表現(xiàn)為嘔吐，腹瀉，水樣稀便及消瘦，病程短，病死率高，呈典型病毒病癥狀。剖解發(fā)現(xiàn)小腸大面積充氣，腸壁明顯變薄，腸系膜淋巴結(jié)充血腫大，腎臟有大量出血點(diǎn)，腹股溝淋巴結(jié)充血腫大。采集病料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室RT-PCR、PCR檢測，結(jié)果為豬流行性腹瀉病毒和圓環(huán)病毒2型陽性。結(jié)合臨床癥狀、病理解剖特征及實(shí)驗(yàn)室檢測結(jié)果，確診為豬流行性腹瀉病毒與圓環(huán)病毒2型混合感染。

藏香豬；豬流行性腹瀉病毒；圓環(huán)病毒2型；混合感染

藏香豬，別名“藏血豚”、“人參豬”，是我國川西高原、云南、西藏、甘肅甘南和岷縣特有的一種古老畜種，也是我國唯一的高原、高寒放牧豬種[1]。藏香豬除具有耐嚴(yán)寒、耐粗飼、抗病性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)外，豬肉特有的營養(yǎng)及風(fēng)味使之成為高端產(chǎn)品的必選。伴隨藏香豬養(yǎng)殖規(guī)模化程度提高，由此所致疫病增多、疫情更復(fù)雜，使藏香豬養(yǎng)殖面臨著新的挑戰(zhàn)和困難。2016年3月，四川九寨溝某藏香豬養(yǎng)殖基地出現(xiàn)10余例仔豬腹瀉，主要表現(xiàn)為嘔吐，腹瀉，水樣稀便及消瘦，病程短，病死率高，經(jīng)采樣后送四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物技術(shù)中心做實(shí)驗(yàn)室檢測。

1 材料與方法

1.1 臨床癥狀及樣品采集

2016年3月四川九寨溝某自繁自養(yǎng)式藏香豬養(yǎng)殖基地3～20日齡仔豬發(fā)病，主要表現(xiàn)為嘔吐、消瘦、水樣腹瀉、腹瀉1 d后迅速死亡。青霉素、鏈霉素治療效果不明顯，死亡率高。解剖后發(fā)現(xiàn)病理變化主要在腸道，出現(xiàn)明顯的小腸腸壁變薄、充氣、出血，腸內(nèi)有未消化乳塊，腸系膜淋巴結(jié)腫大、出血呈深褐色。采集癥狀典型新死亡仔豬腸黏膜、腸內(nèi)容物、腸系膜淋巴結(jié)冰凍保存，送四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生物技術(shù)中心進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測。

1.2 主要儀器和材料

Mastercycler PCR擴(kuò)增儀（Eppendorf，德國）、Gel Doc 2000凝膠圖像分析系統(tǒng)（BIO-RAD，美國）、2×Taq Plus PCR MasterMix（含染料）購自天根生化科技（北京）有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TakaRa Taq DNA酶和DL 2 000 DNA Marker（寶生物工程大連有限公司）。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中收錄的豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬輪狀病毒（PoRV）、偽狂犬病病毒（PRV）、圓環(huán)病毒2型（PCV2）序列，設(shè)計特性檢測引物（表1）。

表1 檢測引物序列

1.4 病料處理及DNA/RNA提取

取采集病料0.5~2.0 g研磨，并按1∶3比例加入生理鹽水配成病料懸液，隨后反復(fù)凍融3次。凍融后按12 000 r/min離心5 min后取上清液，分別按照Trizol法和酚-氯仿法提取RNA和DNA，并將提取的RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒方法制成cDNA保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

將cDNA進(jìn)行PEDV、TGEV、PoRV檢測，提取的DNA進(jìn)行PRV、PCV2檢測。PCR擴(kuò)增體系見表2，各病毒PCR擴(kuò)增程序見表3。

表2 PCR擴(kuò)增體系（20 μL）

表3 PCR擴(kuò)增程序

2 結(jié)果

以實(shí)驗(yàn)室保存的陽性毒株作為各檢測的陽性對照，若出現(xiàn)與陽性對照相符的目的條帶，則判定為陽性，反之判定為陰性。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PEDV、PCV2為陽性，結(jié)果見圖1。

圖1 PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳

3 分析與討論

藏香豬作為我國優(yōu)良地方豬種，抗病性強(qiáng)、耐粗飼是其突出的優(yōu)點(diǎn)。隨著飼養(yǎng)模式的改變近年關(guān)于藏香豬病例報道也日益增加，2011年湖南報道了藏香豬傳染性胸膜肺炎與毛首線蟲混合感染案例[2]，2014年3月遼寧報道一起藏香豬感染附紅細(xì)胞體致育成豬死亡42頭、仔豬死亡138頭的嚴(yán)重案例[3]，同年4月，貴州報道另一起藏香豬混合感染PRV、PCV2和附紅細(xì)胞體的案例[4]，可見疫病控制是藏香豬規(guī)模化養(yǎng)殖過程中面臨的新問題，其抗病性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)并不能起絕對的保護(hù)作用。經(jīng)對本次病例送檢樣品進(jìn)行相應(yīng)分子檢測，結(jié)果顯示為PCV2與PEDV混合感染，分析認(rèn)為，九寨溝縣3月處于較為寒冷的初春季節(jié)，加之發(fā)病豬群沒有接種PCV2、PEDV相關(guān)疫苗，這些因素均有利疫情的發(fā)生。PEDV和PCV2都會引起新生仔豬腹瀉，早期Hirai等[5]就已經(jīng)報道了新生仔豬的PEDV和PCV2雙重感染病例，并有人提出PCV2可能參與新生仔豬PEDV感染的病理進(jìn)程。臨床觀察發(fā)現(xiàn)感染PCV2的仔豬在感染PEDV時會出現(xiàn)更為嚴(yán)重的腹瀉[6]。且已有試驗(yàn)證明，母豬感染PCV2后，會加快仔豬感染PEDV后的病程發(fā)展[7]。有研究指出，多病原混合感染會影響細(xì)胞因子的產(chǎn)生和表達(dá)類型，阻礙仔豬對PCV2的清除，仔豬體內(nèi)細(xì)胞因子數(shù)量的下降為PCV2提供了有利的體內(nèi)環(huán)境，從而促進(jìn)病毒增殖[8]，可見二者在感染仔豬過程中存在關(guān)聯(lián)。近期對四川PCV2流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果也證實(shí)了以上觀點(diǎn)，發(fā)生腹瀉仔豬中PCV2陽性率呈現(xiàn)升高趨勢，對四川13個地市436份樣品檢測，結(jié)果顯示，PCV2陽性樣本有312份，陽性率為71.55%，其中攀枝花市陽性率最高，達(dá)88.89%。而重點(diǎn)對采自9個地市的75份仔豬腹瀉病料分析，共有66份PEDV陽性病料，總陽性率為88.00%，個別市區(qū)陽性率甚至達(dá)100%；75份樣品PCV2的檢出率高達(dá)80%[9]，可見目前四川PEDV、PCV2流行較為普遍，且混合感染嚴(yán)重。

建議發(fā)病場進(jìn)行相關(guān)疫苗的免疫，母豬產(chǎn)前40 d、20 d用滅活疫苗配合活疫苗進(jìn)行PEDV的加強(qiáng)免疫；按程序進(jìn)行PCV2疫苗的免疫；同時加強(qiáng)綜合措施，重點(diǎn)注意圈舍保溫、保持干燥，病豬的隔離、對癥處理及環(huán)境消毒，疫情很快得到有效控制。

[1]周治宏，貢吉卓瑪.養(yǎng)殖技術(shù)顧問[J]，2012（12）：198-199.

[2]唐偉.現(xiàn)代畜牧獸醫(yī)[J]，2012（7）：43-44.

[3]梅強(qiáng).畜牧獸醫(yī)科技信息[J]，2016（1）：64.

[4]姜玲玲，史開志，徐景峨，等.中國畜牧獸醫(yī)[J]，2014，41（10）：225-229.

[5]Hirai T,Nunoya T,Ihara T,et al.Veterinary Record[J],2001, 148(15):482-484.

[6]Kim O,Chae C.Veterinary Pathology[J],2000,37(1):62-67.

[7]Jung K,Kim J,Ha Y,et al.Veterinary Journal[J],2006,171(3): 445-450.

[8]Chae C.The Veterinary Journal[J],2005,169(3):326-336.

[9]陽酉萍，黃小波，曹三杰，等.中國獸醫(yī)學(xué)報[J]，2015，35（5）：704-710.

（編輯：郭玉翠）

S858.28

A

1002-1957(2016)05-0103-02

2016-07-12

四川省科技支撐計劃（2014NZ0043；2015NZ0072）

索朗扎西（1981-），男，藏族，西藏拉薩人，獸醫(yī)師，主要從事獸醫(yī)方向研究.E-mail：15378277188@163.com