谷新怡，周 劍，閆曉玲，蘇 艷，吳魯華，趙朋波，劉昕妍

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078; 3.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029)

黃芪注射液通過(guò)調(diào)節(jié)JNK和NF-κB通路抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡*

谷新怡1，周 劍2△，閆曉玲2，蘇 艷2，吳魯華3，趙朋波1，劉昕妍1

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029;2.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078; 3.北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，北京 100029)

目的:觀察黃芪注射液對(duì)視神經(jīng)牽拉傷大鼠視神經(jīng)保護(hù)作用并探討其作用機(jī)制。方法:將66只SPF級(jí)健康Wistar雄性大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、視神經(jīng)牽拉傷模型組及黃芪注射液治療組3組各22只大鼠;橫向定量牽拉法制作大鼠視神經(jīng)損傷模型，假手術(shù)組僅暴露視神經(jīng)不予牽拉;術(shù)后治療組給予黃芪注射液腹腔注射，模型組給予生理鹽水腹腔注射;治療14 d后取大鼠視網(wǎng)膜組織，利用蛋白免疫印跡法檢測(cè)JNK和NF-κB表達(dá)變化，并采用real time-PCR方法檢測(cè)p75NTR的mRNA水平。結(jié)果:與假手術(shù)組比較，視神經(jīng)牽拉傷模型大鼠視網(wǎng)膜組織p75NTR mRNA水平及JNK蛋白表達(dá)明顯上升，NF-κB蛋白表達(dá)顯著下降;給藥14 d后與模型組比較，黃芪注射液治療組大鼠視網(wǎng)膜組織p75NTR mRNA水平及JNK蛋白表達(dá)顯著減少，NF-κB蛋白表達(dá)明顯升高。結(jié)論:黃芪注射液具有視神經(jīng)保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制p75NTR mRNA的表達(dá)及JNK蛋白水平、促進(jìn)NF-κB的蛋白表達(dá)有關(guān)。

視神經(jīng)損傷;黃芪;p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體;c-Jun氨基末端激酶;核因子κB

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)是視網(wǎng)膜的第三級(jí)神經(jīng)元，其軸突匯集成視神經(jīng)，將視覺(jué)信號(hào)輸入大腦，在視覺(jué)通路中起重要傳導(dǎo)作用;視神經(jīng)損傷后RGCs數(shù)目進(jìn)行性減少，是導(dǎo)致視功能不可逆性損害的組織病理學(xué)基礎(chǔ)。在神經(jīng)元凋亡過(guò)程中，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-termianl kinase，JNK)和核因子 кB(nuclear factorkappaB，NF-кB)的表達(dá)起至關(guān)重要的作用。黃芪注射液是由中藥黃芪提取精煉而成，現(xiàn)代藥理研究表明，黃芪具有抗氧化、清除氧自由基、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞等作用，近年來(lái)在視神經(jīng)保護(hù)研究領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用。本課題組前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)［1］，黃芪注射液對(duì)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡有抑制作用，但是通過(guò)哪條信號(hào)傳導(dǎo)通路發(fā)揮抑制凋亡作用目前尚不清楚。本研究通過(guò)觀察黃芪注射液對(duì)視神經(jīng)牽拉傷大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白JNK及 NF-кB表達(dá)的影響，探討黃芪注射液抑制細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及試劑

1.1.1 動(dòng)物與分組 選擇健康SPF級(jí)成年雄性Wistar大鼠66只，體質(zhì)量(220±20)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。行外眼及眼底檢查，無(wú)眼疾者納入實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)期間于北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，自由攝食、飲水，室內(nèi)通風(fēng)干燥。按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組22只，模型組即視神經(jīng)牽拉傷+生理鹽水組22只及黃芪治療組即視神經(jīng)牽拉傷+黃芪注射液組22只。假手術(shù)組僅暴露視神經(jīng)，不予牽拉，不予任何藥物，模型組和治療組均選取左眼制作視神經(jīng)損傷模型，右眼為正常對(duì)照。

1.1.2 藥物及主要試劑 黃芪注射液購(gòu)自杭州正大青春寶藥業(yè)有限公司(批準(zhǔn)文號(hào)國(guó)藥準(zhǔn)字Z33020179)。RNAisoTMPlus提取試劑(D9108A)、SYBR Premix Taq II(2×)(DRR081S)購(gòu)自TaKaRa; ReverTra Ace-α-反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (FSK-100)購(gòu)自TOYOBO公司;兔抗JNK抗體(9258S)、小鼠抗NF-кB 抗 體 (6956S)均 購(gòu) 自 美 國(guó) CellSignaling Technology公司;辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記 anti-Rabbit抗體(ZB-2301)購(gòu)自北京中杉金橋;辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記anti-Mouse抗體(7076S)購(gòu)自Cell Signaling Technology公司;RI-PA 裂解液(R0010)、BCA法蛋白濃度測(cè)定試劑盒(PC0020)及ECL超敏發(fā)光液(PE0010)均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。普通PCR儀器(型號(hào)MG96+)為杭州朗基科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品，熒光 PCR儀(型號(hào)ABI7500)為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品，SDS-PAGE電泳設(shè)備均為美國(guó)BioRad公司產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 模型復(fù)制 采用橫向定量牽拉法制作視神經(jīng)損傷模型大鼠［2-3］:術(shù)前直接檢眼鏡查大鼠眼底視網(wǎng)膜及血管無(wú)異常。2%戊巴比妥(按100 mg/kg大鼠體質(zhì)量)腹腔注射全身麻醉動(dòng)物，大鼠俯臥位，沿大鼠左眼顳側(cè)眶緣剪開(kāi)皮膚長(zhǎng)約1 cm，摘除部分眶脂肪，剪斷(亦可保留)上直肌和外直肌，向眶尖部鈍性分離并暴露視神經(jīng)，采用6-0聚酯縫合線在球后1～2 mm處圈住視神經(jīng)并打結(jié)(圈長(zhǎng)等于視神經(jīng)橫截面周長(zhǎng)，注意不能拉緊)，縫線另一頭連接壓力張力計(jì)(最小刻度0.01 N)，以0.10 N拉力垂直于視神經(jīng)水平牽拉并持續(xù)20 s。牽拉完成后立即觀察，如大鼠術(shù)眼瞳孔散大、直接對(duì)光反射消失、間接對(duì)光反射存在、眼底視網(wǎng)膜無(wú)血管閉塞、視網(wǎng)膜蒼白缺血不超過(guò)5 min予以納入，否則予以淘汰。術(shù)后縫合傷口，常規(guī)抗炎，回籠飼養(yǎng)。造模后第2天開(kāi)始分組腹腔注射藥物進(jìn)行干預(yù)。

1.2.2 給藥方法 治療組于造模成功后1 d開(kāi)始給予黃芪注射液腹腔注射0.5 ml/d×14 d，模型組于造模成功后1 d開(kāi)始給予0.9%氯化鈉注射液腹腔注射0.5 ml/d×14 d。

1.2.3 取材 假手術(shù)組、模型組及黃芪治療組均于造模后第15天取材。10%水合氯醛過(guò)量麻醉處死大鼠，剪開(kāi)瞼裂，完整摘取雙眼眼球置于冰上操作，沿角膜緣剪開(kāi)去除晶體和玻璃體，小心剝離視網(wǎng)膜置于凍存管中，立即投入液氮中保存。

1.2.4 指標(biāo)檢測(cè)

①Western blot檢測(cè)視神經(jīng)牽拉傷大鼠視網(wǎng)膜組織JNK、NF-кB蛋白表達(dá):取視網(wǎng)膜組織，每4個(gè)視網(wǎng)膜為1個(gè)樣本(約40 mg)，采用冰浴超聲裂解組織，BCA法測(cè)定蛋白濃度，每孔上樣50 μg進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)印蛋白至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)，10%脫脂奶粉封閉，一抗4℃過(guò)夜(anti-JNK 1∶1000稀釋，anti-NF-кB 1∶1000稀釋，anti-GAPDH 1∶2000稀釋)，辣根酶標(biāo)記二抗(1∶3000稀釋)，ECL發(fā)光液顯影、曝光并拍照。條帶灰度值分析采用Alpha View軟件測(cè)定，計(jì)算目標(biāo)蛋白灰度值/內(nèi)參灰度值。②Real-time PCR檢測(cè)神經(jīng)牽拉傷大鼠視網(wǎng)膜組織p75NTR mRNA表達(dá):取視網(wǎng)膜組織，采用 RNAisoTMPlus提取試劑抽提各組總RNA，按照ReverTra Ace-α-反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。GenBanK上查找相關(guān)的基因序列，特異性引物由life technologies公司設(shè)計(jì)合成。P75NTR上游引物:5’-CCACCAGAGGGAGAGAAAC TG-3’，下游引物:5’-CCAGGTGTCACCATTGAGC AG-3’，擴(kuò)增目標(biāo):186 bp。beta-actin上游引物:5’-CTTCCTTCTTGGGTA TGGAATCC-3’，下游引物:5’-GGAGCAATGATC TTGATCTTCATG-3’，擴(kuò)增目標(biāo): 205 bp。實(shí)時(shí)定量 PCR反應(yīng)條件:預(yù)變性94℃ 10 min，94℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 15s，80℃ 30 s，循環(huán)40次，讀取 Ct(cycle threshold)值，首先分別計(jì)算各樣本目的基因p75NTR與內(nèi)參beta-actin Ct的差值，即△Ct=Ct(p75NTR)－Ct(beta-actin)，再用各處理樣本的△Ct減去對(duì)照組的△Ct，得到△△Ct，即［Ct (處理組目的基因)－Ct(處理組內(nèi)參基因)］－［Ct (對(duì)照組目的基因)－Ct(對(duì)照組內(nèi)參基因)］，利用2－△△Ct進(jìn)行計(jì)算［4］，表示實(shí)驗(yàn)組測(cè)定基因 p75NTR的表達(dá)相對(duì)于正常對(duì)照組樣本 p75NTR表達(dá)的變化倍數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布且方差齊采用單因素方差分析(One-Way ANOVA-LSD)，組間比較用 LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對(duì)大鼠視網(wǎng)膜組織JNK蛋白表達(dá)的影響

鑒于以上我區(qū)的水果包裝中存在的問(wèn)題來(lái)看，未來(lái)水果包裝的發(fā)展趨勢(shì)應(yīng)當(dāng)順應(yīng)國(guó)家環(huán)保的號(hào)召，走綠色環(huán)保型的道路，要采用綠色環(huán)保的材料進(jìn)行包裝，對(duì)于那些化學(xué)物質(zhì)嚴(yán)重超標(biāo)的包裝物要盡量避免使用，以免造成對(duì)環(huán)境的破壞和對(duì)人體健康的危害。但是在低碳環(huán)保的同時(shí)，也要做到節(jié)約資源，保證產(chǎn)品的質(zhì)量，降低包裝資源的損耗率。只有這樣，才能做到資源的可持續(xù)利用和發(fā)展。

圖1表1顯示，與假手術(shù)組比較，視神經(jīng)牽拉傷模型大鼠視網(wǎng)膜組織 JNK明顯上升，組間方差齊同，經(jīng)單因素方差分析(One-Way ANOVA-LSD)顯示(P=0.008＜0.05)。給藥 14 d后與模型組比較，黃芪注射液治療組大鼠視網(wǎng)膜組織 JNK蛋白表達(dá)明顯下降(P=0.003＜0.05)，說(shuō)明中藥黃芪可以明顯下調(diào)大鼠視網(wǎng)膜組織 JNK的蛋白表達(dá)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織JNK表達(dá)的Western blot電泳條帶

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織JNK蛋白表達(dá)的情況(±s)

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織JNK蛋白表達(dá)的情況(±s)

注:與假手術(shù)組(左眼)比較:*P=＜0.05;與模型組(左眼)比較:△P＜0.05

組別 鼠數(shù)JNK/GAPDH模型 組 ( 右 眼 )4 0.032 0.57±0.09模 型 組 ( 左 眼 ) 4 0.77±0.08*治 療 組 ( 右 眼 ) 4 0.56±0.10治 療 組 ( 左 眼 ) 4 0.52±0.12△假 手 術(shù) 組 (右 眼 ) 4 0.55±0.10假 手 術(shù) 組 (左 眼 ) 4 0.55±0.10 F 3.149 P

2.2 對(duì)大鼠視網(wǎng)膜組織NF-кB蛋白表達(dá)影響

圖2表2顯示，與假手術(shù)組比較，視神經(jīng)牽拉傷模型大鼠視網(wǎng)膜組織 NF-кB明顯下降，組間方差齊同，經(jīng)單因素方差分析(One-Way ANOVALSD)顯示(P=0.002＜0.05)。給藥14 d后與模型組比較，黃芪注射液治療組大鼠視網(wǎng)膜組織NF-кB蛋白表達(dá)明顯上調(diào)(P=0.003＜0.05)，說(shuō)明中藥黃芪可以明顯改善大鼠視網(wǎng)膜組織 NF-кB的蛋白表達(dá)，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織NF-кB表達(dá)的Western blot電泳條帶

2.3 對(duì)大鼠視網(wǎng)膜組織 p75NTR mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

表3顯示，各組間方差齊同，經(jīng)單因素方差分析(One-Way ANOVA-LSD)，模型組p75NTR mRNA表達(dá)較假手術(shù)組升高(P=0.000)，假手術(shù)組的表達(dá)僅為模型組的0.23倍。黃芪注射液治療組的p75NTR mRNA表達(dá)較模型組降低(P=0.04)，治療組的表達(dá)為模型組的0.56倍。

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織NF-кB蛋白表達(dá)的情況(±s)

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織NF-кB蛋白表達(dá)的情況(±s)

注:與假手術(shù)組(左眼)比較:*P＜0.05;與模型組(左眼)比較:△P＜0.05

組別 鼠數(shù) NF-кB/GAPDH模型組 ( 右 眼 )4 0.001 0.82±0.05模 型 組 ( 左 眼 ) 4 0.63±0.06*治 療 組 ( 右 眼 ) 4 0.81±0.06治 療 組 ( 左 眼 ) 4 0.80±0.06△假 手 術(shù) 組 (右 眼 ) 4 0.83±0.05假 手 術(shù) 組 (左 眼 ) 4 0.82±0.06 F 7.274 P

表3 p75NTR mRNA的表達(dá)情況(相對(duì)定量法)

3 討論

P75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體 (p75 neurotrophin receptor，p75NTR)因其促神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的效應(yīng)近年得到廣泛研究［5-6］。p75NTR是一種跨膜糖蛋白，屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體家族成員之一［7］。TNF受體家族在氨基酸排序上有很大的保守性，它們的胞內(nèi)域都存在一個(gè)短的同源區(qū)域，稱為死亡結(jié)構(gòu)域(death domain)，當(dāng)它與配基結(jié)合時(shí)可誘導(dǎo)相應(yīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡。Lebrun-Julien等［8］進(jìn)一步對(duì) Müller細(xì)胞進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(NGF)與P75NTR受體結(jié)合后產(chǎn)生了對(duì)RGCs有害的毒性信號(hào)，可抵消NFG的神經(jīng)保護(hù)作用;此外，即使不使用NGF，藥物抑制p75NTR或者使用敲除p75NTR基因的小鼠也可減少軸索斷裂造成的 RGCs死亡，進(jìn)一步證實(shí)p75NTR的毒性作用。通過(guò)對(duì)p75NTR信號(hào)傳導(dǎo)途徑的研究發(fā)現(xiàn)，一些信號(hào)分子參與 p75NTR引起的細(xì)胞凋亡過(guò)程，如神經(jīng)酰胺(ceramide)、JNK (c-Jun N-termianl kinase)、Bax、caspase、calpain等。研究表明，神經(jīng)酰胺可以激活JNK，JNK活化后可與線粒體共同產(chǎn)生促凋亡作用，因此 JNK的活化在p75NTR介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起重要作用［9-10］。

需要指出的是，p75NTR也可通過(guò)核因子 кB (nuclear factor kappaB，NFкB)促進(jìn) RGCs細(xì)胞存活。NF-κB是 p75NTR參與促進(jìn) RGCs細(xì)胞存活的重要信使，自然狀態(tài)下 NF-κB普遍存在于細(xì)胞漿中，與其抑制性蛋白 IκB結(jié)合而呈非活性狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體受到創(chuàng)傷如被病毒、氧化劑、炎癥細(xì)胞因子等刺激后，NF-κB被激活與 IκB解離，從胞漿中進(jìn)入到細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合到靶基因啟動(dòng)子序列上的 κB位點(diǎn)，誘導(dǎo)基因轉(zhuǎn)錄，合成各種細(xì)胞因子，并通過(guò)反饋環(huán)路將基因表達(dá)放大、持續(xù)。NF-κB與細(xì)胞凋亡的關(guān)系十分密切。一方面 NF-κB能通過(guò)刺激IL-1β轉(zhuǎn)化酶蛋白酶、c-myc、TNF-α基因的表達(dá)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同時(shí)又有大量的證據(jù)表明，NF-κB在活體和不同的細(xì)胞培養(yǎng)模型中均有抗凋亡作用［11-12］。

黃芪注射液是由中藥黃芪提取精制而成，黃芪始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. Var.mongholicus(Bge.)Hsia或 膜 莢黃芪 Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，其味甘、性溫，有補(bǔ)氣升陽(yáng)、固表止汗、托毒排膿和生肌等功效［13］?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，黃芪具有增強(qiáng)心肌收縮力、保護(hù)心肌細(xì)胞、清除氧自由基、改善微循環(huán)灌注、提高超氧化物歧化酶活性、調(diào)節(jié)免疫功能、降低血液黏稠度、抑制血小板凝聚等作用［14］。臨床廣泛用于治療循環(huán)、神經(jīng)、呼吸和內(nèi)分泌等疾病。近年來(lái)，黃芪在缺血性視網(wǎng)膜病變、青光眼和糖尿病視網(wǎng)膜病變等眼科疾患中的應(yīng)用也日益廣泛。

本實(shí)驗(yàn)以橫向定量牽拉法制作大鼠視神經(jīng)損傷模型，從基因和蛋白水平觀察黃芪注射液對(duì)視神經(jīng)牽拉傷大鼠視網(wǎng)膜組織 p75NTR、JNK及NF-кB的影響。實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在視神經(jīng)損傷之后，模型組手術(shù)眼JNK蛋白表達(dá)量明顯高于非手術(shù)眼，這提示橫向牽拉法造模導(dǎo)致的視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡通過(guò) JNK蛋白介導(dǎo)。黃芪注射液治療組p75NTR的mRNA及JNK的蛋白表達(dá)水平均較模型組降低，而NFкB蛋白表達(dá)量較模型組明顯升高，提示黃芪注射液可以降低視神經(jīng)牽拉傷大鼠視網(wǎng)膜組織中p75NTR mRNA的表達(dá)，從而減少神經(jīng)生長(zhǎng)因子與p75NTR的結(jié)合，進(jìn)而阻斷下游JNK信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活，發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡的作用，并通過(guò)上調(diào)NF-кB的蛋白表達(dá)而促進(jìn)神經(jīng)再生，從而提高神經(jīng)元的抗損傷能力，起到視神經(jīng)保護(hù)作用。

［1］廖良，孔瑩瑩，韋企平，等.黃芪注射液對(duì)體外培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的保護(hù)作用［J］.眼科新進(jìn)展，2010，12:1101-1104.

［2］Ken-ichiro M，Miho Y，Yoshitsugu I，et al.Neuroprotective Effect of Transcorneal Electrical Stimulation on the Acute Phase of Optic Nerve Injury［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2007，48:2356-2361.

［3］張圣海，吳繼紅，孫興懷.一種改良的大鼠視神經(jīng)損傷定量模型的建立［C］.亞洲實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)聯(lián)合會(huì)(AFLAS)第三次會(huì)議暨中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)會(huì)(CALAS)第八屆學(xué)術(shù)年會(huì)，2008: 135.

［4］Pfaffl MW.A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR［J］.Nucl Acids Res，2001，29:2002-2007.

［5］Anders Nykjaer，Thomas E Willnow，Claus Munck Petersen.p75NTR-live or let die［J］.Current Opinion in Neurobiology，2005，15(1):49-57.

［6］Bradley R.Kraemer，John P.Snow，Peter Vollbrecht，et al.A Role for the p75 Neurotrophin Receptor in Axonal Degeneration and Apoptosis Induced by Oxidative Stress［J］.The Journal of Biological Chemistry，2014，8(1):21205-21216.

［7］Longhi L，Perego C，Ortolano F，et al.Tumor necrosis factor in traumatic brain injury:effects of genetic deletion of p55 or p75 receptor［J］.J Cereb Blood Flow MeTab，2013，33(8):1182-1189.

［8］Lebrun-Julien F，Morquette，Douillette A，et al.Inhibition of p75NTR in glia potentiates TrkA-mediated survival of injured retinal ganglion cells［J］.Molecular and Cellular Neuroscience，2009，40(4):410-420.

［9］Dhanasekaran DN，Reddy EP.JNK signaling in apoptosis［J］.Oncogene，2008，27(48):6245-6251.

［10］Eleanor T.Coffey.Nuclear and cytosolic JNK signaling in neurons［J］.Nature Reviews Neuroscience，2014，15:285-299.

［11］Mattson MP，Culmsee C，Yu Z.Roles of nuclear factor kappaB in neuronal survival and plasticity［J］.J Neurochem，2000，74 (2):443-456.

［12］Christian Engelmann，F(xiàn)alk Weih，onny Haenold.Role of nuclear factor kappa B in central nervous system regeneration［J］.Neural Regeneration Research，2014，9(7):707-711.

［13］中華人民共和國(guó)藥典委員會(huì).中國(guó)藥典［S］.2010年版.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:283.

［14］李淑芳.中藥黃芪藥理作用研究進(jìn)展［J］.湖北中醫(yī)雜志，2013，35(6):73-75.

Astragalus Injection Inhibits Retinal Ganglion Cell Apoptosis by Regulating JNK and NF-κB Pathway

GU Xin-yi1，ZHOU Jian2△，YAN Xiao-ling2，SU Yan2，WU Lu-hua3，ZHAO Peng-bo1，LIU Xin-yan1
(1.Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China; 2.Dongfang Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100078，China; 3.The Third Affiliated Hospital，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China)

Objective:To observe the optic nerve protective effects of astragalus membranaceus injection on tractive optic nerve injury in rats and to explore its possible mechanism.Methods:66 healthy male Wistar rats were randomly divided into sham operated group，model group and astragalus membranaceus injection group，with 22 rats in each group; The optic nerve of model rats was injured by the transverse quantitative traction(tension given to the optic nerve:0.10N; tractive direction:perpendicular to the optic nerve;duration:20 seconds)，and that of sham-operation group was only exposed but not pulled;After model establishment，treatment group were given with astragalus membranaceus injection by intraperitoneal injection，and model group were given with normal saline for testing.14 days later，the changes of expression of JNK and NF-κB in rat retinal tissue were detected with Western blotting，and the expression of p75NTR mRNA was detected by real-time PCR.Results:Compared with the sham operation group，the expression level of p75NTR mRNA and JNK protein in the optic nerve injury group increased.On the contrary，the protein expression level of NF-κB significantly declined;After treatment for 14 days，the expression of p75NTR mRNA and JNK protein decreased in the astragalus injection treatment group compared with the model group.However，the protein expression level of NF-κB increased.Conclusion:Astragalus membranaceus injection could has the function of protecting the optic nerve.The mechanism may be related with decreasing p75NTR mRNA and the protein expression of JNK，and increasing the protein expression of NF-κB.

Optic nerve injury;Astragalus membranaceus;P75 neurotrophin receptor;C-Jun N-termianl kinase; Nuclear factor kappaB

R285.5

:B

:1006-3250(2016)03-0358-04

2015-06-15

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81173307)-補(bǔ)氣活血法對(duì)視神經(jīng)p75NTR/TrK信號(hào)通路調(diào)控的分子機(jī)制研究

谷新怡(1986-)，女，黑龍江人，在讀博士，從事中醫(yī)藥治療視神經(jīng)疾病的臨床與研究。

△通訊作者:周 劍(1964-)，男，教授，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，博士研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)藥治療視神經(jīng)疾病的臨床與研究，Tel:010-67689733，E-mail:zhj9667@126.com。