郭 津， 劉 陽,4， 王 超， 白玲玲， 韓小唯， 張鑫陽， 孫艷秋， 王魯川△， 姜志梅，3△

(1. 佳木斯大學(xué)附屬第三醫(yī)院， 2. 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 黑龍江 佳木斯 154002； 3. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 4. 哈爾濱市第四醫(yī)院， 黑龍江 哈爾濱 150026)

慢性癲癇大鼠心肌中鈣敏感受體及絲裂原活性蛋白激酶表達的改變*

郭 津1， 劉 陽1,4， 王 超2， 白玲玲1， 韓小唯2， 張鑫陽1， 孫艷秋1， 王魯川2△， 姜志梅1，3△

(1. 佳木斯大學(xué)附屬第三醫(yī)院， 2. 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院， 黑龍江 佳木斯 154002； 3. 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院， 4. 哈爾濱市第四醫(yī)院， 黑龍江 哈爾濱 150026)

目的：觀察鈣敏感受體在癲癇大鼠心肌細胞中的表達和絲裂原活化蛋白激酶途徑的變化。方法：戊四氮成功點燃慢性癲癇模型；Wistar健康雄性大鼠隨機分為5組：對照組；癲癇組；癲癇+精胺組；癲癇+精胺+Chalhex231組；癲癇+Chalhex231組，每組各12只。模型組用PTZ亞驚厥劑量(35 mg/kg)持續(xù)腹腔注射28 d后停藥1周，再用相同劑量的PTZ測試，對照組以等容生理鹽水代替PTZ 腹腔注射，依據(jù)Racine行為學(xué)分級標準出現(xiàn)連續(xù)5次出現(xiàn)Ⅱ級以上發(fā)作者視為成功點燃慢性癲癇模型；以鈣敏感受體激動劑精胺，鈣敏感受體抑制劑Chalhex231做為干預(yù)因素，(精胺3 μmol/L和Chalhex231 2 μmol/L)；檢測血清肌酸激酶、肌酸激酶同工酶；檢測心肌功能、大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)變化、心肌細胞的超微結(jié)構(gòu)、心肌中鈣敏感受體以及細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶 ERK、 p-ERK、p-JNK表達情況。結(jié)果：與正常組比較，癲癇組CK、CK-MB含量明顯升高，心臟超聲顯示心臟順應(yīng)性下降，左室功能降低，E/A<1。心肌細胞超微結(jié)構(gòu)顯示損傷嚴重。CaSR表達進一步增加，p-JNK蛋白表達增加，p-ERK蛋白表達減少。精胺能夠促進癲癇所誘發(fā)的CaSR蛋白表達增多、p-JNK蛋白表達增加，p-ERK蛋白表達減少；Chalhex231的作用相反。結(jié)論：慢性癲癇可誘發(fā)心肌改變，CaSR表達增多可能參與癲癇慢性發(fā)作時心肌損傷，MAPK信號通路可能參與慢性癲癇心肌損傷過程。

鈣敏感受體；絲裂原活化蛋白激酶；癲癇；心?。淮笫?/p>

癲癇是一種常見的以反復(fù)突然發(fā)作的意識喪失伴抽搐為主要癥狀的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，全世界有超過五千萬的癲癇患者[1,2]，其中10%～15%的癲癇突發(fā)死亡為不明原因的猝死[3]。國內(nèi)外學(xué)者研究認為,癲癇不明原因的猝死可能與癲癇頻繁發(fā)作導(dǎo)致的呼吸與循環(huán)功能紊亂有關(guān)。癲癇發(fā)作時,患者常出現(xiàn)心率改變,甚至心律失常、心臟驟停等,這種由腦部病變引起的心臟損傷稱為腦心綜合征。自1954年Bruch首次報道腦心綜合征以來，其逐漸為大家所認識。但是臨床尚未將腦心綜合征發(fā)病機制完全闡明，多認為關(guān)聯(lián)于腦損傷后體液調(diào)節(jié)障礙、血流動力學(xué)改變以及血管病變等[4]。鈣敏感受體(calcium-sensing receptor, CaSR)是G蛋白偶聯(lián)受體超家族中C家族成員，主要功能為維持機體鈣與其他金屬離子的穩(wěn)定狀態(tài)，參與基因表達，調(diào)節(jié)激素分泌，激活離子通道，細胞分化與凋亡以及衰老等過程[5,6]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated proteinkinase, MAPK)是廣泛存在于真核細胞中的一類絲/蘇氨酸蛋白激酶。在哺乳動物中，MAPK 可以被物理應(yīng)激、細胞因子和細菌復(fù)合物等細胞外信號或刺激激活，并將這些刺激信號通過三級激酶級聯(lián)反應(yīng)的方式傳遞到細胞核中，進而調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化、侵襲、凋亡等生物學(xué)效應(yīng)[7]。本課題組曾用戊四氮(pentetrazole, PTZ)復(fù)制大鼠癲癇發(fā)作模型可引起大鼠腦組織CaSR表達增加和細胞凋亡，其機制與氧化應(yīng)激和細胞凋亡可能也參與癲癇的發(fā)作[8]。癲癇是腦部疾患的一種，本研究將從腦心綜合癥的角度出發(fā)，觀察CaSR在癲癇大鼠心肌細胞中的表達和MAPK途徑的變化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

成年雄性清潔級Wistar大鼠，體重(180±10) g(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)動物實驗室)；RIPA裂解液(索萊寶科技有限公司)；Anti-CaSR,Anti-p-ERK,Anti-p-JNK,Anti-p-P38(Cell Signaling Technology,USA)； 電泳儀JY600C(北京六一電泳設(shè)備有限公司)；H-600A型透射電鏡(日立)；視頻腦電(EMS 奧地利)；超聲(飛利浦 德國)。

1.2 分組及模型制作

健康成年雄性Wistar大鼠，隨機分為5組(n=12)：(1)正常組(C)：每天腹腔注射生理鹽水，劑量等同PTZ，連續(xù)28 d；(2)癲癇組(EP)：每天腹腔注射PTZ(35 mg/kg)1次，連續(xù)28 d，停藥7 d，再用同劑量注射一次；配制方法：將戊四氮溶解在0.9%生理鹽水中，戊四氮的濃度為20 mg/ml。注射后記錄癲癇發(fā)作的級別、發(fā)作持續(xù)時間 (s)及發(fā)作潛伏期(即注入PTZ 到首次癇性發(fā)作之間經(jīng)歷的時間)，出現(xiàn)Ⅲ級以上發(fā)作的大鼠視為模型制備成功[9]。(3) EP+精胺(CaSR激動劑)：同2組，停藥7 d里每天尾靜脈注射精胺(3 μmol/L)一次；(4) EP+Calhex231+精胺：同2組，停藥7 d里每天尾靜脈注射Calhex231(2 μmol/L)和精胺(3 μmol/L)各1次；(5) EP+ Calhex231(CaSR抑制劑)：同2組，停藥7 d里每天尾靜脈注射Calhex231(2 μmol/L)1次。

1.3 大鼠心臟超聲心動圖檢查

腹腔水合氯醛 (劑量為350 mg/kg) 腹腔麻醉,仰臥位固定麻醉的大鼠后,胸部備皮,應(yīng)用線陣探頭，選擇探頭頻率為7.0 MHz，對大鼠心臟行超聲檢查。探頭置于大鼠左胸,首先在胸骨旁左心室短軸取得滿意的二維圖像后,然后將M型取樣線在乳頭肌水平，垂直于室間隔和左心室后壁獲取大鼠心臟M型超聲心動圖。

1.4 大鼠心肌酶學(xué)檢測

將麻醉后大鼠, 取眼球血2 ml, 3 000 r/min 4℃離心10 min,取上層血清, 按照試劑盒說明嚴格操作, 分別檢測肌酸激酶(phosphocreatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(MB isoenzyme of creatine kinase，CK-MB)的活性。

1.5 心肌組織形態(tài)學(xué)的光鏡觀察

于大鼠心尖部切取1 mm×1 mm×1 mm心室組織，4%多聚甲醛磷酸緩沖溶液固定24～48 h。常規(guī)脫水、浸蠟、包埋、染色、透明和封片, 制作成普通的HE染色切片。用日本產(chǎn)Nikon ECLIPSE顯微圖像分析系統(tǒng)E100進行光學(xué)顯微鏡觀察。

1.6 心肌超微結(jié)構(gòu)的透射電鏡觀察

切取兩組大鼠心尖區(qū)心肌,進一步切成約1 mm×1 mm×1 mm大小的組織塊, 用2.5%戊二醛前固定, 1%鋨酸進行后固定, 然后用丙酮逐級的脫水,再用環(huán)氧樹脂包埋, 超薄切片, 最后1%醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛雙重染色, 然后應(yīng)用H-600A型透射電鏡(日立)觀察。

1.7 Western blot檢測心肌細胞CaSR、ERK、p-ERK、p-JNK蛋白表達水平

取20 μg蛋白，用電泳儀JY600C進行10% SDS-PAGE電泳，然后用100 V電壓轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(PVDF膜)上1 h。將該膜放在含5%脫脂牛奶的封閉液中封閉，37℃ 1 h；用封閉液稀釋一抗，4℃震蕩過夜。反復(fù)洗膜，將膜在堿性磷酸酶標記的抗IgG (1∶1 000)中孵育，室溫輕搖1 h，洗膜，用Western blot檢測心肌細胞CaSR、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular-signal regulatedproteinkinas， ERK),(proteaseextracellular -signal regulatedproteinkinase，p-ERK)、(protease c -Jun amino -terminal kinase，p-JNK)蛋白表達水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 腦電圖的變化

對照組大鼠腦電圖以α、β波為主，散在θ波，無異常放電表現(xiàn)。癲癇組大鼠腦電圖表現(xiàn)為，陣發(fā)性高幅尖波，棘波、棘慢復(fù)合波(圖1)。

Fig. 1 The EEG findings from different groups A: Control; B: Epilepsy

2.2 心臟超聲心動圖檢查的結(jié)果

與正常大鼠超聲心動圖比較，慢性癲癇組大鼠左室功能下降，左心室射血分數(shù)(left ventricular enjection fraction,LVEF)和左心室短軸縮短分數(shù)(fractional shortening,FS),均降低，E/A<1。各組大鼠心臟超聲心動圖變化情況見圖2。

Fig. 2 The echocardiography findings from different groups A: Control; B: Epilepsy

2.3 兩組大鼠心肌酶學(xué)檢測的結(jié)果

與對照組比較，癲癇組大鼠血肌酸激酶(CK)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)含量均增高(P<0.05，表1)。

GroupCK CK?MB Control827±83466±46Epilepsy2035±202?672±67?

CK： Phosphocreatine kinase； CK-MB： Creatine phosphokinase-isoenzyme-MB

*P<0.05vscontrol

2.4 兩組大鼠心肌組織形態(tài)學(xué)光鏡觀察的結(jié)果

HE染色光鏡400倍視野下所見: 正常對照組心肌細胞，肌絲排列整齊, 橫紋和細胞核清晰;癲癇組心肌細胞，肌絲排列紊亂，橫紋模糊, 部分胞漿消失溶解(圖3)。

Fig. 3 Morphological observation of rat myocardial cells under light microscope (HE ×400) A: Control; B: Epilepsy

2.5 兩組大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)透射電鏡觀察的結(jié)果

透射電鏡下見：對照組心肌細胞肌絲排列得整齊, 閏盤和橫紋結(jié)構(gòu)清晰, 細胞核和線粒體結(jié)構(gòu)完整；癲癇組心肌細胞肌束間出現(xiàn)水腫，肌絲片狀溶解斷裂，線粒體腫脹、嵴溶解融合或有電子致密物沉積，空泡現(xiàn)象(圖4)。

Fig. 4 The ultrastructural alteration of cardiac tissues under electron microscope (×8 k) A: Control; B: Epilepsy

2.6 五組大鼠心肌細胞CaSR、ERK、p-ERK、p-JNK蛋白表達水平的變化

癲癇組大鼠心肌細胞的CaSR,ERK,p-ERK,p-JNK蛋白表達變化與正常組比較。CaSR表達增高(P<0.05)。ERK表達減少(P<0.05), p-JNK表達增高(P<0.05)而p-ERK表達無明顯變化(P>0.05，圖5-7)。

Fig. 5 Western blot analysis for CaSR in rat cardiac tissue of different groups. The protein changes values in represents group(n=6) A: Control group； B: Epilepsy； C: Epilepsy+spermine group； D: Epilepsy+spermine+Chalhex231group； E: Epilepsy+Chalhex231group*P<0.05vscontrol group;?#P<0.05vsepilepsy group

Fig. 6 Western blot analysis for p-JNK in rat cardiac tissue of different groups. The proteins change values in represents group(n=6) A: Control group； B: Epilepsy； C: Epilepsy+spermine group； D: Epilepsy+spermine+Chalhex231group； E: Epilepsy+Chalhex231group*P<0.05vscontrol group;?#P<0.05vsepilepsy group

3 討論

癲癇是人類一大頑疾，但癲癇是否引起心臟損傷，具體損傷機制如何仍不清楚。目前癲癇模型中以點燃模型應(yīng)用最為廣泛，認為其機制與人類癲癇發(fā)病機制相類似[10]。PTZ 點燃不僅可以提高發(fā)作的易感性，還可以導(dǎo)致腦部功能的改變，目前認為PTZ 點燃癲癇模型為難治性癲癇較為理想的模型[11]。介于以上原因，本實驗采用了腹腔內(nèi)注射PTZ 的方法制作慢性癲癇模型。腦電圖表現(xiàn)的癇性發(fā)放和臨床發(fā)作是判斷癲癇發(fā)作的兩個主要特征。本實驗采取臨床觀察與腦電圖監(jiān)測，其結(jié)果顯示大鼠慢性癲癇模型制作成功。

Fig. 7 Western blot analysis for ERK in rat cardiac tissue of different groups. The protein changes values in represents group(n=6) A: Control group； B: Epilepsy； C: Epilepsy+spermine group； D: Epilepsy+spermine+Chalhex231group； E: Epilepsy+Chalhex231group*P<0.05vscontrol group;?#P<0.05vsepilepsy group

采用超聲心動圖和血清心肌酶檢測。超聲心動圖觀察到模型組左室順應(yīng)性減低，射血分數(shù)降低，心肌酶學(xué)檢查中模型組CK,CK-MB升高，其中的CK-MB被認為能夠特異性地反映心肌受損。綜上所述，故可推斷，在慢性癲癇發(fā)病過程中存在著心臟功能與心肌的受損。

采用HE染色和透射電鏡觀察。HE染色發(fā)現(xiàn)模型組與對照組相比心肌形態(tài)發(fā)生改變，出現(xiàn)肌絲排列紊亂，橫紋模糊，部分胞漿消失溶解；透射電鏡下模型組表現(xiàn)心肌細胞肌束間出現(xiàn)水腫，肌絲片狀溶解斷裂，線粒體腫脹、嵴溶解融合，空泡現(xiàn)象。從形態(tài)學(xué)角度均能說明慢性癲癇發(fā)病中心肌細胞發(fā)生損傷。

從病理生理角度分析，癲癇發(fā)病過程中心肌損傷可能與以下因素有關(guān)：癲癇發(fā)作時，腦電沖動異常增加，導(dǎo)致交感和副交感神經(jīng)失衡，影響心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)和心肌的復(fù)極化,造成心臟損傷，癲癇發(fā)作時，機體處于應(yīng)激狀態(tài)，交感-腎上腺系統(tǒng)釋放大量兒茶酚胺、去甲腎上腺素，導(dǎo)致冠狀動脈痙攣或收縮，造成心肌缺血性損傷。

眾多實驗已表明，CaSR表達增多時心肌損傷較重,并已有文獻證實CaSR通過G蛋白-PLCIP3通路引起細胞內(nèi)鈣增加，參與心肌鈣穩(wěn)態(tài)的調(diào)控，是細胞鈣超載的發(fā)生機制之一[12,13]。本實驗通過免疫蛋白印記法證實在慢性癲癇大鼠模型中，CaSR表達增加(P<0.05)。說明鈣敏感受體的增加可能參與了慢性癲癇心肌的損傷過程。

近年來，在分子生物學(xué)和遺傳學(xué)方面，已經(jīng)對凋亡的效應(yīng)和調(diào)節(jié)機制特別針對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進行深入的研究，其中酪氨酸激酶介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路MAPK通路在CaSR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用開始受到人們重視。目前在哺乳動物細胞中已鑒定4條MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，本實驗選取其中兩條通路即ERK通路和JNK通路。磷酸化的ERK和JNK為其活性狀態(tài)。在大多數(shù)情況下，ERK發(fā)揮細胞保護作用，而JNK表現(xiàn)為促凋亡作用[14]。這與本實驗采用Western bolt技術(shù)所得出結(jié)果相吻合，ERK的表達減少(P<0.05), p-JNK表達增加(P<0.05),說明ERK通路和JNK通路參與慢性癲癇心肌損傷的過程。運用CaSR激動劑和阻斷劑，進一步證實 CaSR的表達增加通過分別激活MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的ERK通路保護心肌細胞和JNK通路促進心肌細胞凋亡。實驗中發(fā)現(xiàn)p-ERK表達無顯著變化，可能因為磷酸化的蛋白在試驗操作過程中發(fā)生去磷酸化，而影響實驗結(jié)果。其結(jié)果有待進一步驗證。

本實驗通過PTZ點燃慢性癲癇大鼠模型，觀察到CaSR參與大鼠癲癇發(fā)作時心肌損傷和心肌細胞凋亡，并揭示CaSR的表達增多可分別使ERK通路和JNK通路中的ERK磷酸化減少和JNK磷酸化增加，進而表現(xiàn)出相應(yīng)保護心肌細胞和促進心肌細胞的凋亡的作用。這對癲癇引起的心肌損傷機制研究有一定的意義，并為臨床治療癲癇引起的心肌損傷提供新的視角。

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The expression of calcium sensing receptor(CaSR) and MAPK pathway changes in myocardial cells of epilepsy rats

GUO Jin1， LIU Yang1,4， WANG Chao2， BAI Ling-ling1， HAN Xiao-wei2， ZHANG Xin-yang1， SUN Yan-qiu1， WANG Lu-chuan2， JIANG Zhi-mei1，3△

(1. The Affiliated the Third Hospital, 2. The Affiliated the First Hospital Jiamusi University, Jiamusi 154002； 3. Harebin Medical College of Public Health, 4.Harebin NO.4 Hospital, Harebin 150026, China)

Objective: To investigate the changes of the myocardial cells in chronic epileptic rat model and to observe the expression of calcium sensing receptor(CaSR) and mitogen-activated proteinkinase(MAPK)pathway changes in epilepsy rats. Methods: The chronic epileptic rat model was induced by pentetrazole (PTZ). Adult male Wistar rats were divided into 5 groups randomly, and there were 12 rats in each group. The rats in model group were treated with a sub-convulsive dose of PTZ (35 mg/kg) by intraperitoneal injection for 28 d. After stopping a week, the same dose of PTZ test was conducted. The control group was treated with isovolumetric saline instead of PTZ by intraperitoneal injection. According to Racine behavior grading standards the rat emerged two levels above epileptic seizure 5 consecutive times, which was considered the chronic epilepsy model successful ignition. The intervention factors included spermine(calcium-sensing receptor agonist， 3 μmol/L) and Chalhex231(calcium-sensing receptor inhibitor， 2 μmol/L). The serum creatine kinase (CK) and creatine kinase isoenzyme(CK-MB)were detected. The cardiac functions, morphological changes of rat myocardial tissue, myocardial cell ultrastructure, myocardial cell calcium sensing receptor and extracellular regulated protein kinase (ERK), p-ERK, p-JNK expression were carried out. Results： Compared with normal control group, CK, CK-MB in PTZ group were increased obviously. The cardiac compliance and left ventricular function were decreased, E/A<1 by echocardiography. The myocardial ultrastructure showed serious injury. The expressions of CaSR and p-JNK were increased, but the expression of p-ERK was decreased. Spermine could promote the expressions of CaSR and p-JNK, and decrease the expression of p-ERK in epilepsy; however, the role of Chalhex231 was opposite. Conclusion: The level of CaSR expression increased in chronic epileptic rat model. CaSR activated the expressions of MAPK of the myocardial cells,and then influenced the cardiac myocyte apoptosis.

calcium-sensing receptor; mitogen-activated proteinkinase; epilepsy; myocardial cells

國家自然科學(xué)基金資助項目(81300122)；黑龍江省青年科學(xué)基金項目(QC2016130)；佳木斯大學(xué)校級創(chuàng)新團隊(Cxtd201302)

2015-04-14

2016-04-19

R363

A

1000-6834(2016)05-454-05

10.13459/j.cnki.cjap.2016.05.018

△【通訊作者】Tel： 13846163601； E-mail： mynard93@163.com